内皮祖细胞与冠心病（精选7篇）
内皮祖细胞与冠心病 第1篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
降糖治疗组为我院2012年4月-2013年1月接收诊治的47例老年冠心病合并糖尿病患者, 其中男31例, 女16例, 年龄61~69岁, 平均62.1岁, 病程3个月至14年, 平均8.5年, 入选标准是经临床确诊的2型糖尿病患者、诊断符合1999年中国2型糖尿病协会标准和经冠脉造影证实为冠心病, 临床表现符合不稳定心绞痛诊断标准且在入院期间接受冠脉介入治疗者;对照组为45例健康者, 其中男29例, 女16例, 年龄62~70岁, 平均62.8岁。两组在年龄、性别等方面均无显著性差异 (P>0.05) , 所有受试对象均知情同意, 并且两组均剔除外伤、溃疡、视网膜病、近期外科手术、炎症、肿瘤等影响外周血内皮祖细胞疾病的患者
1.2 方法
外周血内皮祖细胞数量检测:两组受试对象禁食8~10 h后, 次日清晨于肘静脉抽取空腹静脉血2 m L, 以肝素钠抗凝, 采取标本血后即刻送检行直接免疫荧光标记, 流式细胞仪检测各抗原表达情况;功能检测:采用相对公认的Di I-ac-LDL和FITC-UEA-I免疫荧光双染法对细胞进行鉴定, 双染阳性的细胞被认为是正在分化的外周血内皮祖细胞, 使用MTT比色法测定外周血内皮祖细胞增殖能力, 使用30 min贴壁方法测定外周血内皮祖细胞黏附能力, 使用改良型Boyden小室测定外周血内皮祖细胞迁移功能。降糖治疗组患者根据2010年美国糖尿病协会糖尿病治疗指南, 运用常规降糖药物进行治疗, 将血糖控制在正常范围内, 12周后, 再次对该组受试对象外周血内皮祖细胞数量和功能进行检测。
1.3 统计学方法
所有数据均以SPSS 17.0进行分析;计量资料以±s表示, 行t检验和单因素方差分析;以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对照组、降糖治疗前、降糖治疗后外周血内皮祖细胞数量的比较
降糖治疗组治疗前与对照组相比, CD 34、CD 133、VEGFR 2、v WF、CD 34/CD 133的表达细胞数量明显低于对照组, 均具有统计学差异 (P<0.05) , 降糖治疗后与治疗前相比, CD 34、CD 133、VEGFR 2、v WF、CD 34/CD 133的表达细胞数量增加, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 治疗后表达细胞数量仍低于对照组, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.2 对照组、降糖治疗前、降糖治疗后外周血内皮祖细胞增殖、迁移、黏附功能的比较
降糖治疗组治疗前与对照组相比, 增殖、迁移功能明显低于对照组, 具有统计学差异 (P<0.05) , 黏附功能低于对照组, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) ;降糖治疗后与治疗前相比, 增殖、迁移功能增高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 但是与对照组相比仍低于对照组, 有统计学差异 (P<0.05) , 黏附功能与治疗前和对照组相比差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
3 讨论
外周血内皮祖细胞是一种起源于骨髓的原始细胞, 类似于胚胎期的成血管细胞, 是直接产生血管内皮细胞的前体细胞, 并且研究也已经证实[4,5], 外周血内皮祖细胞具有体内外分化为血管内皮细胞的潜能, 当血管内皮功能受损时, 即由外周血内皮祖细胞分化替代补充, 而糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量明显下降, 其增殖能力减弱, 迁移能力降低, 寿命明显缩短, 当外周血内皮祖细胞的这种修复能力受损时, 不能有效维持血管的完整性, 从而形成功能不完整的病理性新生血管-内皮细胞间隙扩大, 血液外渗, 即出现各种血管疾病。本研究中也发现老年冠心病合并糖尿病患者的外周血内皮祖细胞数量和增殖、黏附和迁移功能均低于正常健康受试者, 进一步证明了长期的高糖、高脂毒性、多元醇旁路代谢、终末产物增加等因素会导致患者血管内皮细胞功能受损。本研究还发现使用降糖药物治疗后, 尤其是将患者血糖控制在正常范围内, 外周血内皮祖细胞数量和增殖、迁移、黏附功能相较于降糖治疗前均有所增加, 为该类患者动脉粥样硬化治疗提供了临床依据。但是外周血内皮祖细胞数量和增殖、迁移、黏附功能均低于正常健康受试者, 说明长期的高糖导致的外周血内皮祖细胞损伤是不可逆的, 其机制值得进一步研究。
参考文献
[1]陈树春, 宋光耀, 孙阳, 等.二初诊2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞的研究[J].天津医药, 2010 (7) :549-551.
[2]杨波, 张钲.2型糖尿病患者外周血EPCs数量和功能的变化[J].中国分子心脏病学杂志, 2008, 8 (2) :278-282.
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血管内皮祖细胞与血管新生 第2篇
1 EPCs概述
EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,即能分化为成熟的血管内皮细胞的祖细胞。造血干细胞与EPCs来源于共同的干细胞——血液血管干细胞(hemangioblast),它们具有多种相同的抗原表达。1997年,美国波士顿伊丽莎白医学中心的Isner教授与其同事用磁式细胞分选法首次从人的外周血中分离出CD34+的单核细胞(MNCCD34+),体外培养发现MNCCD34+能分化成贴壁细胞ATCD34+,且发现ATCD34+具有内皮细胞家族的特性,能表达内皮细胞的表面标志物,并能摄取DiI标记的乙酰化的低密度脂蛋白(DiI-acLDL),从而证明了MNCCD34+即为假定的EPCs[1]。
EPCs存在于各种成年动物和人的骨髓和外周血中,主要存在于骨髓。在某些生理、病理状态下,EPCs可从骨髓释放,并在外周血中运行。近几年,人们从脐带血中分离出EPCs,并成功地诱导其分化为血管内皮细胞。不同培养时间的内皮祖细胞可能呈椭圆形、长梭形或纺锤形,在形态上无法与其他细胞区分开来,主要靠细胞表面标志来识别。目前将CD34、CD133(即AC133)、血管内皮生长因子受体1(Flk-1)、c-Kit、Sca-1、DiI-acLDL、血管性假性血友病因子(vWF)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2等作为EPCs主要的细胞表面标志。正常情况下,EPCs的数量极少,在含有VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)等适合EPCs生长的培养条件下,可大量增殖扩增。新近报道,成体血管壁上有EPCs存在的特定区域,该区域的EPCs能分化为成熟血管内皮细胞,可作为出生后新血管发生的一个来源[2]。但由于缺乏确切的细胞表面标记和稳定的分离纯化技术,人体内哪些部位存在EPCs,有待进一步研究。
2 EPCs在血管新生中的作用
血管新生(angiogenesis)是指从已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。自从Folkman提出血管新生的概念后,这个领域已成为一个新的研究热点[3]。传统观点认为血管新生包括两个概念:胚胎期的血管发生(vasculogenesis,VG)和出生后的血管生成(angiogenesis,AG)。Asahara等[1]用鼠和兔的肢体缺血模型证实EPCs参与了AG,给单侧肢体缺血的裸鼠从尾静脉注射来自人脐静脉血的EPCs(用DiI标记),组织学检查显示几乎所有标记的细胞都融入了毛细血管壁中。同时,他们用从兔外周血分离出的EPCs对单侧肢体缺血的新西兰家兔模型进行了自体回输实验,得出了类似的结果。
研究表明,成人中EPCs定居于骨髓,它可以被细胞因子或者来自于外周血中的血管生长因子信号动员到外周循环而进入外周血管组织中,通过整合进血管壁或提供生长因子两种方式来促使新生血管的形成。Shi等[4]从人骨髓中分离出了EPCs,并进行了犬的同种异体骨髓细胞移植术。移植术后6个月,又将涤纶做的血管假体置入犬的降胸主动脉,以防止周围组织的毛细血管延伸过来。12周以后,发现血管假体内壁有一层CD34阳性的内皮细胞,DNA分析显示这些细胞都来源于供体犬。这一结果能有效地说明骨髓来源的EPCs在体内能促进血管内皮的形成。Asahara等[5]复制表达β-半乳糖苷酶的转基因小鼠模型,并将其骨髓分别移植给免疫缺陷小鼠的心肌梗死和肿瘤模型,发现在梗死灶周围及肿瘤血管形成部位均有β-半乳糖苷酶阳性的细胞。结果表明,骨髓来源的内皮前体细胞能够迁移到血管形成活跃的组织,参与病理和生理性血管形成。
1998年,Hatzopoulos等[6]从鼠胚胎中分离出EPCs,还将鼠胚胎EPCs注射到鸡胚内,结果显示鼠EPCs参与形成了宿主的心内膜和脑微血管系统。Kawamoto等[7]在心肌梗死动物模型局部注射体外扩增的EPCs后,发现缺血局部血流增加、心功能改善、瘢痕面积缩小。Murohara等[8]从人的脐静脉血中成功地分离出了EPCs,同样显示EPCs参与形成内皮网。他们还将人的EPCs体外扩增后回输至肢体缺血的裸鼠模型体内,发现EPCs参与了缺血局部组织的新生毛细血管形成。Lyden等[9]在肿瘤动物模型发现,应用对VEGF敏感EPCs的抑制剂能减少局部血管生成和肿瘤生长。用磁共振(MRI)和共聚焦显微镜结合免疫组化染色观察,充分证实了EPCs参与肿瘤血管的新生[10]。
3 EPCs与治疗性血管新生
随着对血管形成机制研究的深入,Isner等[11]提出了“治疗性血管新生”概念,治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)是指将外源性血管新生诱导因子转入组织中增强缺血区域的侧支毛细血管新生。常用的生长因子有VEGF、bFGF等,但是这些生长因子的作用往往受到原有血管和血管内皮细胞(endothdial cells,EC)功能的影响。近年来EPCs参与的血管新生为缺血性疾病治疗提供了新思路, EPCs促进新生血管形成的机制是通过自身的分化、增殖而形成新生血管,无需依赖原有的血管系统。目前,有关EPCs与治疗性血管新生的研究主要处于从实验研究向临床治疗过渡的阶段,具体从内源性EPCs的动员及活化、骨髓单个核细胞移植、EPCs的基因修饰三方面展开。
3.1 内源性EPCs的动员及活化
成人EPCs主要存在于骨髓,在某种病理状态下骨髓中的EPCs可经动员进入外周循环。某些细胞因子、趋化因子在EPCs的动员中发挥重要作用。在机体局部缺血组织中,内源性的VEGF及基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对EPCs的动员有重要作用。无论是在动物实验还是临床试验,通过质粒或重组蛋白质增加循环VEGF水平以提高外周血中EPCs都取得了预期的效果[12,13]。由腺病毒介导的基因引入致SDF-1或血管生成素-1过表达亦能提高大鼠的EPCs水平[13,14]。其他一些能动员EPCs和造血祖细胞的细胞因子有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF),后者已应用于临床骨髓移植患者多年。最近有研究表明在动物模型体内促红细胞生成素(Epo)显著增强EPCs的动员[15] ,Epo能刺激CD34+/CD45+的EPCs动员进入人体外周血。其他的细胞因子如IL-3、IL-8、IL-11、干细胞因子(SCF)及巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)亦可动员EPCs,但作用较弱。除细胞因子外,几种药物也已被证明可增加EPCs的数量,其中他汀类药物的研究报道较多,研究证实,他汀类药物可诱导EPCs从骨髓动员,阿伐他汀可增加脾源性EPCs[16],罗苏伐他汀可提高循环内Sca-1+/Flk-1+的EPCs。此外,一些降糖药物、雌二醇、中药葛根素及银杏叶提取物等均有加速EPCs动员及增殖的作用[17,18]。促进内源性EPCs的动员和活化,使EPCs的数量更易满足治疗性血管新生的要求是血管新生治疗在方法学上的一个新思路。利用这些动员剂或研制开发一些具有临床应用价值的药物,有望实现真正意义上的“无创”治疗。
3.2 骨髓单个核细胞移植
骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNC)移植是由EPCs移植衍生出的一种血管新生治疗新方法。成年个体的BM-MNC中含有多种干细胞成分,其中EPC含量约占BM-MNC总数的3%,为外周血的15倍,同时BM-MNC移植还可以提供多种促血管生长因子,故BM-MNC移植兼具EPCs和细胞生长因子的作用。
Kalka等[19]将人的EPCs移植给无胸腺裸鼠的缺血下肢后,缺血下肢的毛细血管密度和血流恢复明显增加,肢体丢失较对照组明显减少。Shintani等[20]将兔的自体骨髓单个核细胞注入缺血下肢的腓肠肌,发现移植的骨髓单个核细胞存在于骨骼肌的新生内皮细胞毛细血管网,毛细血管密度较对照组增加。Al-khaldi等[21]将小鼠自体骨髓干细胞移植到左髂总动脉结扎后缺血肢体的大腿前内侧肌室的肌肉中,发现其分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌细胞和脂肪细胞,缺血后肢移植细胞处的毛细血管密度、小动脉密度、股动脉血流指数较对照组增高。Padilla等[22]在雄性大鼠下肢缺血模型中证实骨髓来源的EPCs移植是诱导血管新生的一种安全可行的方法。Kamihata等[23]在猪急性心肌梗死模型中发现,BM-MNC移植3周之后梗死部位的血流量和毛细血管密度分别增加4.6倍和2.8倍,左室射血分数提高48%,冠脉造影可见侧支血管数目增加5.7倍。Hamano等[24]在犬慢性心肌缺血模型中采用BM-MNC心肌注射,30 d后发现缺血心肌的微血管生成明显增多,心室壁增厚,室壁运动明显改善。
除动物实验外,在一些前瞻性的临床试验中BM-MNC移植亦取得了较好的效果。Tateishi-Yuyama等[25]首次报道了骨髓干细胞移植治疗周围血管病患者的临床报道。 Saigawa等[26]应用骨髓细胞移植治疗8例动脉硬化闭塞患者,都取得了较好的临床疗效,并且揭示了移植CD34+细胞数量多少反映了临床疗效的改善程度。Hamano等[27]报道5例严重冠心病病人于冠脉搭桥术中在无法进行桥血管移植的区域行BM-MNC心肌注射,术后1个月随访时,有3例注射区域的心肌灌注扫描结果明显改善。Aesmus等[28]报道了用经冠脉内移植骨髓来源或外周血来源体外培养扩增的EPCs治疗20例、28例和59例急性心肌梗死患者随访4个月和1年的临床研究,即TOPCARE-AMI研究,结果表明,两种来源的EPCs疗效相似,均能显著增加冠脉血流储备,改善左室功能。
3.3 EPCs的基因修饰
最近有学者提出通过基因修饰来改变EPCs的生物学性状,从而增强其治疗活性。同单纯用生长因子治疗或单纯的细胞移植治疗相比,利用EPCs作为种子细胞的基因治疗配合干细胞治疗对血管新生的作用更加有效而显著。Iwaguro等[29]采用VEGF164基因的腺病毒载体转染EPCs,转染后的EPCs分泌VEGF量显著增加,效应持续时间超过4周,在此基础上,EPCs的增殖活性、黏附活性及促血管新生的能力明显增强。在大鼠下肢缺血模型中观察到,VEGF基因转染后的EPCs在治疗用量上较常规用量减少30倍,而治疗效能较对照组提高63.7%。该实验还证实了VEGF与EPCs在血管新生治疗上的协同性,为今后缺血性心脏病的血管新生治疗研究指出了一个新的发展方向。Ikeda等[30]移植转染了人VEGF的脐血来源的EPCs到慢性下肢缺血的大鼠模型体内,结果显示转染组的下肢血流比未转染的对照组显著增加。Murasawa等[31]将人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因通过腺病毒载体转导人EPCs,增加其端粒酶的表达,从而使EPCs的再生能力得以恢复(或提高),抗凋亡活性增强,生命周期延长;同时发现,EPCs在增殖活性、迁移活性、分化能力等方面也显著增强,离体及在体促血管新生的能力亦有明显提高。姜萌等[32]在人外周血EPCs中导入人低氧诱导因子(HIF-1α)基因,研究显示在体外HIF-1α转染后的EPCs扩增及迁移功能改善,在体内可促进缺血下肢的局部血管新生。
4 结 语
内皮祖细胞与肿瘤及放疗的关系 第3篇
1 内皮祖细胞的生物学特性
1.1 内皮祖细胞的来源
在正常情况下外周血中EPC的含量极少,为了便于功能检测,通常需要在特定的体外培养条件下对其进行扩增。Asahara等[1]最初于1997年建立的外周血EPC的分离培养体系,开创了人们对于EPC的研究先河。通常认为,EPC与造血干细胞来源于同一骨髓前体细胞,并且二者具有很多相同的表面标志,如Flk-1、C-Kit、CD34等。通过对心血管疾病的模型动物移植进行骨髓移植,在受损局部可以检测到由植入的骨髓EPC及其前体分化而来的内皮细胞,由此表明EPC来源于骨髓[2]。然而,尽管骨髓是循环EPC的主要储存场所,却并非唯一的来源。Wassmann等[3从小鼠的脾脏分离出一种单个核细胞,这类细胞不仅具有血管内皮细胞特征,在体外培养状态下能够形成小管样结构,同时这些细胞移植到颈动脉损伤的小鼠体内可以归巢到受损区域,明显改善血管的舒张功能。目前人们已经能够从骨髓、肝脏、血管外膜,甚至脂肪组织中实现EPC的分离和扩增[1,4,5,6]。对于心血管相关疾病患者EPC功能状态的研究,目前应用最多的是外周血单个核细胞通过体外培养扩增获得。然而在小型实验动物模型中,由于外周血采集困难且难以得到足够的细胞数量,因此多采用骨髓细胞进行体外的扩增培养,目前最常用的方法是通过密度梯度离心获得单个核细胞,再在特定的培养体系下进行EPC的诱导和扩增。即便如此,对于那些周龄较小的小鼠,由于骨髓含量少,加之在单个核细胞的密度梯度分离及细胞收集过程中可能存在的细胞损失,都极大地增加了操作的难度。此外,脐血也是EPC的丰富来源,其中含有大量CD133/CD34双阳性的细胞,在体外培养能分化为具有正常表型及功能的内皮细胞,并且具有强大的增殖特性。
1.2 内皮祖细胞的表面标志
EPC处于相对幼稚阶段,缺乏特征性的结构,因此无法从形态学上对其进行识别和鉴定。细胞表面特异性的抗原分子CD34、CD133和血管内皮生长因子受体(VEGFR-2)的表达是目前较为公认的鉴定EPC的表面分子抗原组合[7],CD34曾经被认为是造血干细胞的特异性标志物,然而,随后的研究显示,CD34不仅存在于造血干细胞上,在成熟的内皮细胞上同样存在有低水平的表达[8]。通过对代表着更早期的造血干细胞表面标志CD133的研究表明,纯化的CD133阳性细胞在体外特定的条件下同样能够分化为内皮细胞,同时在分化过程中,这类细胞逐渐失去CD133,并开始表达成熟内皮细胞特有的表面标志,如VEGFR-2和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)[9]。由此认为,CD34/CD133双阳性细胞可能是EPC与造血干细胞共同的前体细胞群,而CD34/VEGFR-2可能代表处于分化阶段的EPC。此外,类似于单核细胞,EPC同时具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白及结合荆豆凝集素的特性[10]。虽然并不具有特异性,但是在体外特定的诱导培养体系下,仍可作为一种简易的筛选方法。
1.3 影响循环内皮祖细胞数量的因素
正常状态下,成年人的骨髓及外周血中EPC的数量都很少,在外周血中EPC的比例通常只有0.01%,也就是说1 m L外周血中,一般只有70~210个EPC[11]。而特定的机体状态或内分泌激素的改变会对循环EPC的数量产生一定的影响。研究表明,雌激素可以有效地抑制Caspase-8的活性,进而减少EPC的凋亡,通过循环EPC数量的增加加速受损血管的修复[12]。此外适度的体育锻炼也能增加循环EPC的数量和活性。而在许多心血管相关性疾病中,循环EPC的数量和活性都会发生显著的变化。研究显示,在患有慢性缺血性心血管的患者以及具有相关危险因素的人群,如高血压、慢性肾功能不全、2型糖尿病、高龄、缺氧和吸烟等,其体内EPC的数量和活性都存在显著的下调,同时在体外培养状态下血管生成能力也明显受阻[13,14,15]。而在急性缺血状态下,机体则通过应激性地增加循环EPC的数量以修复受损的血管,以增加缺血部位的血液供应。除此之外,许多药物的应用也会对循环EPC的数量产生很大的影响。1.3.1他汀类药物作为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂,他汀类药物可以显著地降低血中胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白的含量。同时,与之降血脂作用无关,他汀类药物还能够通过磷酸酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号调节通路上调循环EPC的数量和功能。研究显示,在应用辛伐他汀治疗稳定型冠心病时,在治疗后第4周患者外周血中循环EPC的数量可增加3倍,并且其功能和活性也得到了显著的提高[16]。此外,对同时患有糖尿病的心血管疾病患者服用阿托伐他汀,8~10周后其循环EPC的数量也明显增加[17]。
1.3.2 血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂
作为一种生物活性肽类物质,血管紧张素Ⅱ在体内引起许多生理性反应以维持血压及肾脏功能。同时在高血压病、动脉疾病、心脏肥大、心力衰竭及糖尿病、肾病等的发病机制上都起着重要的作用,目前血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂已广泛应用于多种心血管疾病的治疗。研究显示,血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能够有效上调EPC的数量和功能,从而对心血管起到一定的保护作用。在对洛沙坦和利尿剂的对照试验中[18],血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能够显著提高小鼠EPC的增殖能力和各项功能指标。在对健康人群外周血EPC的进行体外培养时,替米沙坦不仅能够显著地增加早期EPC的集落数目及迁移能力,还可以抑制肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡[19]。
1.3.3 促红细胞生成素
促红细胞生成素能够刺激骨髓红细胞样前体细胞增殖和分化,生成红细胞集落形成单位。研究显示,急性心肌梗塞患者的血浆促红细胞生成素与循环EPC的数量呈明显的正相关,并且促红细胞生成素对EPC的动员和增殖能够起到有效地促进作用[20]。并且在对肾脏血管内皮损伤的小鼠注入高剂量的促红细胞生成素后,能够通过刺激血管内皮生长因子的释放,增加循环EPC的数量,进而加快内皮修复[21]。
1.3.4 高密度脂蛋白
素有“血管清道夫”之称的高密度脂蛋白具有显著的抗动脉粥样硬化作用。它能够通过上调一氧化氮合酶的表达,抑制基质金属蛋白酶-9和组织细胞凋亡蛋白酶-3的表达,从而增强EPC的集落形成能力,并减少EPC的凋亡。Sumi等[22]研究发现,重组高密度脂蛋白可以通过三磷酸肌醇途径通路直接刺激EPC的增殖,从而促进局部缺血组织的血管生成,并且重组高密度脂蛋白对EPC增殖的促进作用呈明显的剂量依赖性。同样,2型糖尿病患者在接受重组高密度脂蛋白治疗后,其外周血中循环EPC的数量及功能活性也能够得到明显的上调[23]。
1.3.5 其他刺激因子如基质细胞衍生因子-1、血管生成素-1、纤维母细胞生长因子-2、前列腺素、红细胞凝集素、
36中国医药导报CHINA MEDICAL HERALD
分泌神经素、血小板源性生长因子、胎盘生长因子、肝细胞生长因子、以及银杏叶提取物、中药黄芪、红花、丹酚酸、葛根素等中药提取物均可不同程度地对EPC的增殖产生积极的影响。
2 内皮祖细胞与肿瘤
作为血管的生成及增殖中起重要调控角色的EPC在肿瘤生长、转移过程中发挥着重要的作用。在肿瘤的初期阶段,由于血管的生成速度相对缓慢,肿瘤细胞不能够获得充足的营养供应以迅速增殖,因此肿瘤可能会由于增殖与凋亡的动态平衡而处于一个长期的休眠状态。然而一旦肿瘤内的血管浸入了快速增殖状态,获得充足营养供给的肿瘤细胞便会处于快速的增殖分化阶段,其侵袭及发生远处转移的能力也随之大大增强。由此可见,在肿瘤的生长过程中,富血管化是其从体积小、非浸润的局限性生长发展成为体积逐渐增大且伴随局部浸润及远端转移的关键步骤。而EPC则在这一过程中发挥了不可或缺的作用,在研究显示,EPC直接参与了荷瘤小鼠的肿瘤内部血管的生发[24],在肿瘤生长的早期阶段EPC能够通过定植到局部的血管床部位而参与血管的生发,后期则可以通过不断分裂增殖促进肿瘤血管生长[25]。在这一过程中,乳酸脱氢酶作为关键的信号分子发挥了重要的作用。乳酸脱氢酶-1[26]和α4整合素能够通过PBK/Akt信号途径促进骨髓EPC的动员和归巢进而促进肿瘤血管的生成及增长,而在乳酸脱氢酶-1/3缺陷的小鼠体内植入的肿瘤则无法生长[27]。此外,EPC所分泌的多种细胞因子(如血管内皮生长因子、粒细胞集落刺激因子)对于肿瘤血管的生长也起到了一定的促进作用,这些细胞因子不仅能够促进肿瘤血管的成熟,同时还可以降低血管壁的通透性,从而减少肿瘤内部的血管破裂及组织坏死。
3 内皮祖细胞与放疗
随着肿瘤治疗技术的发展,新的三维适形放疗方法的出现及观念的更新,使其在肿瘤治疗中的作用显得更加重要。然而另一方面,由于射线可以激活肿瘤内的多种细胞信号转导途径,从而促进了肿瘤内部血管的生成,以致肿瘤复发和转移增加[28]。目前对于放疗所诱导的肿瘤血管生成多集中在对于各种细胞因子(如血管内皮生长因子、环氧化酶-2、表皮生长因子和基质金属蛋白酶等)的研究。尽管已经发现放疗期间循环EPC的数量存在不同程度的变化,然而其结果则不尽相同,并且其可能存在的意义也知之甚少。有研究表明[29],在经131I治疗的甲状腺癌患者,由于放疗对肿瘤内部血管壁的损伤作用,大量内皮细胞脱落浸入外周血,以致其循环内皮细胞的数量显示出明显的增加,而与之相对应的是循环EPC的数量则存在显著的降低。然而EPC的这一变化是否是由于在血管损伤修复过程中过度的消耗所致,抑或是由于放疗破坏了肿瘤内部某种细胞信号转导途径或抑制了某些细胞因子的分泌目前尚不得而知。截然相反的现象同样有报道,Brunner等[30]对头颈部鳞癌患者的循环内皮细胞和循环EPC在放射治疗前后的变化进行了分析,结果显示其循环EPC在放射治疗后出现了明显的升高。此外EPC还可能与肿瘤组织内的含氧量之间存在一定的相关性,并可能放疗的疗效起到一定的预测作用[31]。研究显示,在放疗期间联合应用以EPC作为靶点的抗血管生成药物贝伐单抗,可以增加放疗的敏感性,并显著延长直肠癌患者的生存期[32]。其可能的机制是由于抑制了血管内皮生长因子的信号转导途径,从而增加肿瘤相关上皮细胞的放疗敏感性,并且由于EPC数量的减少使得肿瘤的血管密度降低,新生血管生成受到抑制。
综上所述,循环EPC在肿瘤的生长、侵袭、转移过程中发挥着重要的作用,其数量的变化对于评价肿瘤的恶性程度以及该肿瘤对于放疗的敏感性及放疗后的复发情况能够起到一定的预测作用。
摘要：作为血管内皮细胞前体的内皮祖细胞在肿瘤的生长、侵袭、肿瘤转移过程中发挥着重要的作用,其数量的变化对于评价肿瘤的恶性程度以及该肿瘤对于放疗的敏感性及放疗后的复发情况能够起到一定的预测作用。在此本文对内皮祖细胞的生物学特性及其在肿瘤与放疗期间的变化做一综述。
内皮祖细胞与冠心病 第4篇
1 资料与方法
1.1 临床资料 2009年1月至2010年1月间在我院住院治疗的60例冠心病患者中, 男41例, 女19例;年龄46～81岁, 平均 (62.10±11.46) 岁。所有患者均符合中华医学会心血管病学会制定的冠心病诊断标准, 具有典型的临床表现及心电图变化。经选择性冠状动脉造影术判断至少有一处为Ⅲ级或以上狭窄 (狭窄程度>50%) 。所有患者均未合并其他器质性心脏病、恶性肿瘤、感染性疾病、肝肾功能不全及其他系统的严重疾病, 排除绝经前妇女。随机选取同期40例非冠心病患者作为对照组。两组患者的性别、年龄比较差异无统计学意义。
1.2 选择性冠状动脉造影 采用Judkins法对所有患者行选择性冠状动脉造影术。采用定量冠状动脉造影 (quantitifying coranary angiography, QCA) 评估冠状动脉病变的血管以及狭窄的程度。病变仅累及左前降支 (left anterior descending, LAD) 、左回旋支 (left circumflex, LCX) 或右冠状动脉 (right coronary artery, RCA) 中其中一支者为单支病变, ≥2支者为多支病变 (其中左冠状动脉主干病变则记为2支病变) 。以病变累及的冠状动脉支数评价冠脉病变的严重程度, 分为单支病变、2支病变和3支病变[2]。本研究中35例患者为单支病变、20例患者为2支病变、5例患者为3支病变;对照组患者均未发现冠状动脉狭窄。
1.3 循环内皮祖细胞水平的测定方法 无菌采集患者外周血10 ml, 20 U/ml肝素钠抗凝。以Ficoll密度梯度离心法收集白膜层的单个核细胞, 然后使用磷酸盐缓冲液 (PBS液) 洗涤2次; 之后接种于包被人纤连蛋白 (human fibronetin) 的24孔培养板 (由Sigma公司提供) 中, 培养板置入培养液中培养, 培养液成分包括:青霉素100 U/ml、链霉素100 g/ml、VEGF 10 mg/L、20%优质胎牛血清。37℃过夜, 培养48 h后更换培养液, 去除未贴壁细胞, 以后每3～4天更换一次培养液。培养2周后在倒置相差显微镜下计数细胞克隆形成单位 (随机选取15个200倍视野) , 评估外周血内皮祖细胞的水平。
1.4 统计学方法 统计学数据采用SPSS 16.0统计学分析软件包进行处理, 计量资料采用均数±标准差
2 结果
2.1 两组患者循环内皮祖细胞水平的比较
冠心病组患者循环EPCs克隆形成单位数目为 (13.12±6.28) 个, 对照组患者循环EPCs克隆形成单位数目为 (38.25±8.32) 个;两组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 循环内皮祖细胞水平与冠状动脉病变严重程度的关系
单支病变组患者循环EPCs克隆形成单位数目为 (18.49±7.16) 个、2支病变组患者循环EPCs克隆形成单位数目为 (11.63±4.52) 个、3支病变组患者循环EPCs克隆形成单位数目为 (7.31±3.74) 个。随着冠状动脉病变支数的增加循环EPCs的水平逐渐降低, 3支病变组患者循环EPCs水平明显低于单支、2支病变组, 2支病变组患者循环EPCs水平明显低于单支病变组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
冠心病是一多危险因素性疾病, 多种心血管危险因素可引起内皮细胞损伤和功能不全而参与冠状动脉粥样硬化的形成。血管内皮细胞作为循环血液与血管平滑肌细胞间的机械屏障, 具有接受、传递信息及分泌血管活性物质等功能, 内皮祖细胞是存在于胎肝、脐带血和外周循环血中, 能够分化为内皮细胞的多潜能细胞目前的研究表明[3], 外周血中的内皮祖细胞可能参与损伤血管的再内皮化过程, 对内皮修复、维持血管稳定有利的生物学功能具有重要作用。为研究循环内皮祖细胞与冠状动脉病变程度之间的关系, 我们测定60例已行选择性冠状动脉造影患者的循环内皮祖细胞水平。
本研究发现, 冠心病组患者循环EPCs水平明显低于对照组 (P<0.05) , 而且随着冠状动脉病变程度的加重, EPCs水平呈逐渐降低的趋势。EPCs的数量减少以及EPCs的功能损伤可能导致冠状动脉自身修复能力的降低与缺血心肌新生血管的减少, 研究提示冠心病的发生及冠状动脉病变的严重程度可能与循环EPCs的数量减少有关[4]。
综上所述, 外周循环中内皮祖细胞 (EPCs) 的水平与冠状动脉病变的严重程度呈负相关。提示冠状动脉内皮损伤、缺乏循环EPCs时可能加重冠心病的病情程度。由于循环EPCs数量与冠状动脉病变严重程度呈负相关, 因此, EPCs数量可成为冠心病的生物学标志。
摘要：目的 探讨分析冠心病患者外周循环中内皮祖细胞 (EPCs) 的水平与冠状动脉病变严重程度的关系及其临床意义。方法 随机选取2009年1月至2010年1月间在我院住院治疗的60例冠心病患者作为研究对象, 所有患者均经选择性冠状动脉造影证实有不同程度的冠状动脉狭窄, 以定量冠状动脉造影评估血管狭窄程度;采集患者外周血进行EPCs分离培养, 14d后评估EPCs的水平, 并将EPCs的数量与冠状动脉病变的严重程度进行统计学分析。随机选取同期40例非冠心病患者作为对照组。结果 冠状动脉病变程度与EPCs的水平降低具有明显负相关性 (P<0.05) 。结论 外周循环中内皮祖细胞 (EPCs) 的水平与冠状动脉病变的严重程度呈负相关。提示冠状动脉内皮损伤、缺乏循环EPCs时可能加重冠心病的病情程度。
关键词：内皮祖细胞,冠状动脉,冠心病,冠状动脉造影术
参考文献
[1]张敬, 曲鹏.急性心肌梗死循环内皮祖细胞与冠状动脉病变严重程度的分析.心血管康复医学杂志, 2009, 18 (5) :433-436.
[2]汪海娅, 高平进, 姬开达, 等.稳定性冠心病患者循环内皮祖细胞与冠状动脉病变严重程度的分析.中华心血管病杂志, 2005, 33 (5) :425-427.
[3]李欢欢, 何旭, 刘亢丁.内皮祖细胞与缺血性脑卒中.中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14 (19) :3569-3572.
内皮祖细胞与冠心病 第5篇
关键词：内皮祖细胞,脑梗死,危险因素
动脉粥样硬化是缺血性脑血管病的最主要原因,可引起颅内外段脑供血动脉的狭窄及继发血栓形成,导致脑梗死。动脉粥样硬化的早期病理改变表现为血管内皮功能异常[1]。内皮祖细胞(EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞[2],在血管修复和维持内皮功能完整中具有重要作用[3]。近年文献报道,循环EPCs数量和功能与心血管危险因素相关[2,4]。本研究旨在观察外周血EPCs数量与急性脑梗死及脑血管危险因素的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年1月~2010年12月于我院神经内科就诊和住院患者,其中,急性脑梗死患者(脑梗死组)145例,脑血管危险因素患者(危险因素组)118例。脑梗死组患者均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的脑梗死诊断标准,均为发病时间≤24 h的首次发病患者并全部经头部CT或MRI证实。危险因素组为有脑血管病危险因素但无脑血管事件的患者。两组均排外感染、肿瘤、免疫性疾病、肝肾功能不全患者。对照组99例系同期门诊健康体检者,无高血压、血脂异常、脑卒中史、糖尿病史、肿瘤、肝肾疾病、免疫性疾病和感染性疾病史。
注:与对照组比较*P<0.05;1 mm Hg=0.133 k Pa
1.2 方法
1.2.1 记录研究对象基本特征
包括年龄、性别、收缩压、舒张压、糖化血红蛋白(Hb A1c)、血总胆固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。
1.2.2 流式细胞仪检测EPCs
取外周血50μL加入5μL PE标记的抗人CD133及3μL Per CP/Cy5.5标记的抗人KDR,4℃冰箱中避光孵育30 min,试管中加入红细胞裂解液500μL避光孵育10 min,加入PBS 1~2 m L,以1 500 r/min离心10 min,去上清,加入500 m L PBS缓冲液使细胞重新悬浮,通过流式细胞仪计数CD133、KDR双阳性细胞作为EPC的百分比。检测时用PE-Ig G1及Per CP/Cy5.5-Ig G1作为同型对照。
1.3 统计学方法
采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差表示,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;相关性分析采用Pearson检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组一般情况、临床及实验室检验指标比较情况
三组患者年龄、性别一般情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。脑梗死组和危险因素组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、Hb A1c、CHO、LDL-C水平均显著高于正常对照组,HDL-C显著低于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
2.2 三组循环EPC数量比较
与对照组比较,脑梗死组和危险因素组循环EPC数量均明显减少,差异有统计学意义(均P<0.01);脑梗死组循环EPC数量较危险因素组高,但差异无统计学意义(P=0.057 8)。见表2。
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与危险因素组比较△P<0.05
2.3 循环EPC数量与脑血管危险因素的关系
以循环EPC数量为因变量行非参数Pearson相关分析,结果显示,脑梗死组EPC数量与SBP、DBP、Hb A1c、CHO、LDL-C水平呈显著负相关(r=-0.358、-0.176、-0.264、-0.165、-0.283,均P<0.05),与HDL-C呈显著正相关(r=0.172,P<0.05);危险因素组EPC数量与SBP、Hb A1c、CHO、LDL-C水平呈显著负相关(r=-0.378、-0.259、-0.248、-0.251,均P<0.05),与HDL-C呈显著正相关(r=0.169,P<0.05);两组EPC数量均与年龄、TG无相关性(均P>0.05)。见表3。
2.4 脑梗死组与循环EPC数量NIHSS评分的关系
脑梗死组循环EPC数量与NIHSS评分呈显著负相关(r=-0.706,P<0.05)。
3 讨论
脑梗死是一种多危险因素疾病,即各种血管危险因素引起内皮细胞损伤和功能不全,启动动脉粥样硬化地形成而发生动脉粥样硬化性脑梗死。在正常情况下内皮损伤和骨髓来源的EPCs修补之间存在动态平衡,以维持内膜完整性。一些研究发现,在血管危险因素、组织缺血、血管损伤等病理性刺激下循环EPCs可发生变化[5]。
2004年Taguchi等[6]首次报道5例急性脑梗死患者脑梗死病灶数目与循环CD34+、CD133+细胞数值呈明显的负相关。2005年Ghani等[7]发现,急性缺血性脑卒中患者发病后4 h外周血EPC数量与正常对照组比较有明显下降。最近一些研究也提示,急性脑卒中患者EPC数量与神经功能评分相互关联,脑卒中48 h后神经功能严重缺损患者较神经功能轻微缺损患者EPC数量明显减少,而且急性脑卒中后循环EPC数量增加预示疾病预后较好[8,9,10]。Sobrino等[11]分别对脑卒中急性期、稳定期及短暂性脑缺血发作、健康人群的外周血EPC数量进行测定发现,前3组患者EPC数量比健康人群显著下降,且3组间差异无统计学意义(P>0.05)。本研究亦得出同样结果,急性脑梗死和脑血管危险因素患者EPCs数量明显下降(P<0.01),且EPCs数量与NIHSS评分呈显著负相关(P<0.05);但本研究还发现,急性脑梗死患者和脑血管危险因素患者EPCs数量差异无统计学意义(P=0.057 8),但急性脑梗死后EPCs数量有增加趋势,认为脑梗死时脑组织损伤,组织缺氧、缺血会增强骨髓EPCs迁移至外周血,使外周血EPCs数量增加,从而应对血管损伤应激需要[12]。
本研究结果发现,急性脑梗死组和脑血管危险因素组EPCs数量与血压、Hb A1c、CHO、LDL-C水平呈显著负相关,与HDL-C呈显著正相关,与年龄、TG无相关性。分析原因可能为高血压状态下肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)机能亢进,血管紧张素Ⅱ通过诱导氧化应激反应抑制EPCs分化,抑制EPCs端粒酶活性,加速EPCs老化,且这种作用可被血管紧张素受体拮抗剂所抑制[13]。另外,醛固酮可通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)的释放及影响蛋白激酶B(Akt)信号传导,抑制EPCs增殖、分化。高血糖及其作用的产物可通过多种信号途径影响EPCs,高糖本身和其介导的氧化应激可使EPCs的磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)/蛋白激酶B(PKB Akt)通路受阻,从而影响EPCs的分化;高糖介导的胰岛素B细胞转录因子(Fox O)磷酸化/乙酰化失衡,可能使Fox O蛋白表达增加,上调前凋亡基因表达,造成EPCs凋亡[14];糖基化终产物AGEs聚积改变骨髓和修复靶点的微环境,影响EPCs的动员和归巢[15]。另外,在胰岛素抵抗时,高浓度胰岛素使胰岛素受体底物(IRS)和PI3K/Akt通路受阻,抑制内皮一氧化氮合酶(e NOS)磷酸化,减少NO释放,损害EPCs的功能[16]。另有研究显示,在血胆固醇增高的个体EPCs集落数量明显减少,且氧化LDL-C是高胆固醇血症患者EPCs数量功能改变的主要原因[17,18]。LDL-C也通过中间代谢产物氧化LDL-C影响端粒酶活性,降低EPCs的存活率;通过Akt失活,降低VEGF诱导的EPCs分化,而且氧化LDL-C对EPCs的负性作用还有一定的量-效关系[19]。而HDL-C对EPCs具有保护作用,体外培养时HDL-C通过增加e NOS和降低前MMP-9表达来保护EPCs凋亡;在体内主要是通过抑制半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3),减少EPCs凋亡,维持EPCs的数量[20]。
人脐血内皮祖细胞的体外培养 第6篇
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hv-qapue,密度1.077 g/mL,天津市灏洋生物制品有限公司);EGM-2培养基(Lonza,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)均为美国Peprotech公司产品;纤维连接蛋白(FN,Sigma,美国);兔抗人CD133单克隆抗体(Santacruz,美国);鼠抗人CD34(epitomics,美国);FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133(Becman Coulter,美国)。X-60倒置相差显微镜(Nikon,日本);AX70荧光显微镜及图像采集仪(Olympus,日本);流式细胞仪(Becman Coulter,美国)。
1.2 方法
1.2.1 脐血内皮祖细胞的分离无菌条件下取正常剖宫产胎盘
中的脐带血50 mL(均签署知情同意书并获我院伦理委员会同意)。脐血中加入肝素(20 U/mL)抗凝,室温静置30～60 min。尽量吸取上清液到含有5 mL PBS缓冲液的试管中混匀;每个10 mL管中加入淋巴细胞分离液2 mL,然后加入混匀的脐血上清液4 mL;将试管放入水平离心机,2 000 r/min离心20 min;吸取呈乳白色的第2层细胞(单核细胞层)加入到含4 mL PBS液中混匀,1 200 r/min离心10 min;弃上清液,加入3 mL PBS液,混匀沉淀,1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入适量的培养基(EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1)吹打混匀。
1.2.2 脐血内皮祖细胞的培养
分离的单核细胞以1×105/cm2接种于纤维连接蛋白包被的12.5 mL培养瓶中;37℃、5%CO2、饱和湿度中培养;第3天半量换液,此后每2～3 d全量换液1次。
1.2.3 血管内皮祖细胞的鉴定
(1)形态学观察:前2 d静置培养细胞,从第3天开始观察。(2)免疫细胞化学染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,采用SABC法,对细胞涂片的CD34进行免疫细胞化学染色,DAB显色,PBS液代替一抗作阴性对照,以细胞质出现棕黄色颗粒为CD34阳性细胞。(3)免疫荧光染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,细胞经4%多聚甲醛固定,10%BSA封闭后,加入兔抗人CD133单克隆抗体(1∶100),阴性对照只加血清,37℃孵育60 min,PBS洗涤,加入FITC标记的荧光素二抗(1∶50),37℃孵育30 min,PBS洗涤,干燥,封片,荧光显微镜观察,显示绿色荧光的细胞为CD133阳性细胞。(4)流式细胞检测:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成1×106/L细胞悬液,分别加入FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133抗体各20μL避光室温反应30 min,然后上机检测,分析KDR和CD133共表达情况。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
在培养第3天可见约40%贴壁细胞为梭型;第4～5天贴壁细胞出现细胞集落,周围细胞以集落为中心,呈发芽式向外生长,周围为呈放射状分布的梭形细胞(图1);8～10 d出现“铺路石样”形似鹅卵石的单层细胞(图2)。
2.2 免疫细胞化学染色
CD34免疫组化染色显示(89.67±2.05)%培养7 d细胞为阳性。
2.3 免疫荧光染色
CD133免疫荧光染色显示(67.2±2.12)%培养7 d细胞为阳性。
2.4 流式细胞检测
流式细胞分析培养7 d细胞KDR和CD133的表达率共达87.8%。
3 讨论
有研究认为血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)对内皮祖细胞有调控作用,能促进内皮祖细胞的体外生长[8,9]。这些生长因子用于培养内皮祖细胞的使用剂量和使用的种类,各个实验室各不相同,本实验采用3种生长因子进行体外内皮祖细胞的培养:VEGF使用浓度为50 ng/mL,bFGF为20 ng/mL,IGF-1为20 ng/mL。
体外分离内皮祖细胞的方法主要有免疫磁珠、流式细胞术和密度梯度离心法,前两种虽然可获得高纯度的细胞,但其回收内皮祖细胞的量少且操作复杂,费用昂贵。通过预试验我们对采取经过静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)和采用抗凝脐血与PBS缓冲液1∶1稀释后的血液分别用密度梯度离心法获得的单个核细胞通过显微镜观察比较,发现用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞中的红细胞含量远远少于用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞中的红细胞含量,且用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养发现细胞贴壁情况比用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养的贴壁情况要好。因此,本实验采用密度梯度离心法从静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)中获得单个核细胞用于内皮祖细胞的体外培养。
内皮祖细胞的培养方法主要有:一种方法是将获得的单个核细胞接种到预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,24 h后将未贴壁的细胞重新接种到新的铺有纤维连接蛋白的培养板中继续培养[1];另一种方法是将单个核细胞接种到培养板中,培养4 d后弃掉未贴壁的细胞,留下的贴壁细胞继续培养[10];还有一种是把单个核细胞接种到铺有Ⅰ型胶原的培养板中,然后弃掉未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养[11]。纤维连接蛋白可促进细胞的黏附,并且与VEGF协同可提高内皮祖细胞的迁移和分化[12],因此本实验采用的内皮祖细胞培养方法是将获得的单个核细胞接种到铺有纤维连接蛋白的培养瓶中,静置培养3 d后弃去未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养。
内皮祖细胞的的鉴定观点不一。有人把表达CD34和KDR的认为EPCs[1];有些学者认为CD34、CD133、KDR是EPCs特征性标志[13];也有学者把EPCs分为两类,早期EPCs(CD34+、CD133+、KDR+),晚期EPCs(CD34+、CD133-、KDR+)[14,15,16]。
内皮祖细胞与冠心病 第7篇
1 EPC的生物学特性及功能
EPC是直接产生血管内皮细胞 (endothelial cell, EC) 的前体细胞, 由血液血管母细胞或称原血干细胞经成血管细胞 (hemangioblast) 发育分化而来的, 与造血干细胞 (hematopoietic stem cell, HSC) 来源于同一祖先细胞, 表达共同的细胞表面抗原。出生后主要定居于骨髓, 外周血中也有少量EPC存在, 由于缺乏成熟内皮细胞表型, 在形态上人们无法将EPC与其他血细胞区分开来, 主要靠细胞表面的分子标志物:CD133、Flk-1和CD34识别。荆豆植物 (种子) 血凝素、vWF、激酶嵌入区受体、血管内皮钙黏素为EPC的内皮细胞系标记, 摄取乙酰化低密度蛋白及释放一氧化氮为EPC的内皮细胞功能标志。EPC具有游走特性, 在体外研究表明, 这些细胞可被诱导、分化、最终转化形成成熟的血管内皮细胞, 而在体内, 一定条件下, 如:缺血状态, 可以从骨髓动员释放进入外周血循环, 能进一步增殖分化, 并定位于缺血局部, 促进血管内皮的修复, 维持内皮功能完整, 参与出生后的血管新生过程, 参与缺血后的血管新生[1]。
2 EPC与缺血性疾病
EPC数量和功能的变化与血管疾病密切相关。缺血性心血管疾病高危人群中, 氧化型低密度脂蛋白抑制, 并使EPC迁移、黏附和植入功能降低。Hill等[2]曾报道冠心病患者血循环外周血中EPC的数量下降了近50%, 迁移能力受损, 并与危险因子的数目成反向线性关系, 而且高危者EPC更易老化, 因此循环血中EPC数量的下降可作为心血管事件发生的标志[3]。糖尿病大鼠下肢缺血再灌注时, 其骨髓EPC的动员受到损害[4], Ⅱ型糖尿病的高胰岛素血症减低了EPC的增殖和存活能力, 糖尿病等一些疾病状态下EPC的数量和功能的下降更是与血管性并发症的发生发展密切相关[5]。同源半胱氨酸血症能削弱EPC 的动员和整合到新生血管中的能力。原发性肺动脉高压症其基本病理特点是肌型小肺动脉丛样病变, 血管腔逐渐闭塞;动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄的病理生理过程也都表明内皮损伤后EPC功能障碍在上述疾病的发生、发展中扮演了重要的角色, 此外, 脑中风、肿瘤、皮肤损伤模型显示EPC参与了各类病理性血管的发生。目前, 对于EPC的研究更加注重于它在治疗缺血性疾病, 促进血管新生方面的作用及临床应用。
2.1 EPC促进缺血性血管新生的作用
血管新生存在于胚胎发育、创伤修复、缺血缺氧、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、内分泌疾病等生理或病理状态下。血管新生的机制十分复杂, 涉及多种细胞 (内皮细胞、血管壁细胞、炎性细胞等) , 是细胞与细胞因子、细胞外基质及蛋白水解酶等之间共同参与、相互作用的结果, 而血管内皮细胞局部聚集和增殖是新生血管形成的必要条件。血管新生包括两种方式:血管生成和血管发生, 前者由原先存在的微血管以出芽的方式, 经成熟、充分分化了的内皮细胞增殖、迁移和重塑形成新的血管分支及毛细血管丛[6]。后者由骨髓的成血管细胞原位分化为EPC或干细胞, 经过动员、增殖、分化和重塑而形成新的血管[7]。
缺血性疾病发生后, 由于成年以后促血管生成因子及其受体表达量很低, 自身代偿性再生血管过程非常缓慢, 一般只能起到部分代偿作用, 加之成熟内皮细胞的再生能力有限, 很难适应组织的缺血变化, 而在已进行的动物及临床试验中均显示:EPC对出生后血管发生、内皮损伤修复及维持内皮功能完整有着良好的效果, 骨髓作为多种血管生长因子的自然来源, 将可能成为缺血条件下促进血管新生的有效材料, 因此通过人为控制血管新生可达到治疗某些疾病的目的, 所以目前大量研究将缺血性血管新生的希望更多地投向了EPC。
最近, 有实验结果显示内源性刺激 (组织缺血) 和外源性治疗雌激素、某些刺激因子, 如:粒细胞集落刺激因子 (granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) 、粒-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 可诱导骨髓来源的EPC, 从而增加缺血组织的血管新生, 使血管再生内皮化过程加快。鼠肢体缺血诱导的EPC迁移增加了角膜手术后眼睛的血管新生, 再用GM-CSF预处理后, 能使循环血EPC的增加更多。低能量冲击波预处理通过增强趋化因子基质细胞衍生因子-1的表达而提高循环血EPC的补充, 其它, 如:胎盘生长因子, 红细胞生成素, 血管生成素-1, 低脂, 抗糖尿病药物, 体育锻炼等都有很好的EPC动员作用。
研究表明, EPC的归巢可能与基质细胞衍生因子 (SDF-1) 结合EPC表面受体CXCR4+后, 促进其向缺血或血管损伤处归巢, 而SDF-1的表达受到低氧诱导因子-1 (HIF-1) 的调控, HIF-1介导SDF-1表达, 可增加CXCR4+祖细胞对缺血组织的黏附、迁移和归巢。Walter等[8]的研究表明, 整合素αVβ3 和αVβ5能加快EPC黏附至血管损伤处, 选择素中的P、E、L选择素也参与EPC的归巢。
将大鼠骨髓中分离的EPC移植于心肌梗死瘢痕组织中, 2周后发现心肌梗死部位新生毛细血管数较对照组多, 分析可能为骨髓中存在EPC, 该细胞在心肌组织中分化形成新的毛细血管, 且周围血中EPC的数量与冠状动员狭窄的严重程度有关。Kalka等[9]将人的EPC移植给无胸腺裸鼠的缺血下肢后, 缺血下肢的毛细血管密度和血流恢复明显增加, 肢体丢失较对照组明显减少。Abdulaziz等[10]将小鼠自体骨髓移植到左髂总动脉结扎后缺血肢体的大腿前内侧肌室的肌肉中, 发现其分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌细胞和脂肪细胞, 缺血后肢移植细胞处的毛细血管密度、小动脉密度、股动脉血流指数较对照组增高。脐带血和骨髓来源的EPC直接注入小鼠的缺血下肢, 多普勒检查及组织学分析均提示血管生成明显[11]。Werner等[12]将EPC在体外扩增后经静脉输注到颈动脉损伤的小鼠, 结果显示移植的EPC聚集在颈动脉损伤部位, 加速受损部位血管再生内皮化, 增强内皮依赖的血管活性, 促进内皮修复, 减轻内膜增生。虽然其中仅有5%的内皮细胞是来自于移植的EPC细胞, 但却可以使再内膜化的区域增加76.6%~91.7%[13]。总的来说, 整合入血管内皮层的EPC数量相对较低, 这似乎难以解释其疗效, 因而推测可能存在其他机制。
2.2 EPC与促血管生长因子
有实验证实:EPC可通过自分泌和一种类似旁分泌的方式分泌一些促进毛细血管再生的生长因子, 如:VEGF和bFGF等, 还有细胞因子IL-21β、TNF2α、MCP-1、MCP-3等, 它们都具有促血管生成活性, 能动员更多的EPC刺激邻近的内皮细胞分化及增殖, 并直接作用于缺血区域来促进血管新生与血管功能的恢复, 从而加快新生血管的形成, 其中类似旁分泌机制更为重要。最近Kinnaird[14]等报道肌肉注射含有骨髓细胞衍生的生长因子和细胞因子的骨髓细胞培养液能显著改善缺血肢体的侧支循环及肢体功能。在这些生长因子中研究最多的是VEGF, VEGF是血管内皮特异性有丝分裂原。体外实验, VEGF基因转移EPC后增强了EPC的增生以及与内皮细胞层的黏附、结合能力;在体内, 基因修饰的EPC增强了实验动物缺血肢体的血管新生。以编码VEGF的腺病毒转染的异源性EPC处理后肢缺血的无胸腺裸鼠, 血管新生和血流恢复均增加, 下肢坏死和自截较对照组减少63.7%, 转染 EPC用量比以前用于缺血肢体的EPC量少30倍[15], 临床上接受VEGF基因转移的下肢缺血患者循环血中EPC含量也明显增加。而不同缺血损伤模型中缺血状态的严重程度显著影响EPC整合入新生血管的能力, 这可能与不同的局部细胞因子的类型及浓度水平有关[16]。
3 EPC移植的临床应用和局限性
EPC在正常机体内数量相对稀少, 外周血中2~3个/ml。在老龄、糖尿病、高脂血症和心血管疾病患者中, 存在EPC数量减少、活力和功能不良以及易老化等特点, 且疾病状态会进一步对EPC的动员、分化等产生抑制作用, 而这些人群恰恰又是EPC移植治疗并希望从中获益的主要对象。此外, 移植细胞后可能会出现促进肿瘤血管发生等病理性血管形成, 这也是不可忽视的问题。据粗略估计, 临床移植治疗1例患者需8.5~120L的外周血方能提供足够治疗用的EPC。因此, 提供足够有效数量、功能良好的EPC, 克服上述不足, 对开展EPC移植尤为重要, 是目前临床研究的关键。即使运用各种生长因子进行体外扩增和局部注射EPC等方法能获得足够数量的细胞, 但可能伴随细胞表型改变、细胞分化及衰老等问题, 也都需要人为地加以干预。有研究显示:通过转染一些特定基因, 如:VEGF、促血管生成素 (angiopoietin, Ang) 可以增强移植后EPC促血管新生的功能[17], 将eNOS基因转入EPC后再移植较单纯EPC移植能更有效地促进内皮修复, 防止内膜增生[18]。近来研究还表明, EPC除了具有高增殖潜能外, 还有强大的抗血栓形成的能力。在血管移植物腔表面接种自体内皮细胞能抗血栓和防止内膜增生。此外, 有实验证实EPC还参与了肿瘤血管的新生。如能以EPC为靶细胞, 将更为有效地阻断肿瘤的血管新生, 抑制肿瘤发展。
4 自体EPC移植的优点
一般认为, 理想的移植细胞应具有:取材容易, 易于大量培养;能在宿主体内长期存活并增殖;可自分泌或旁分泌生长因子和血管生长因子;无伦理方面的争论;无排斥反应;无致肿瘤源性。但到目前为止, 距这种要求还有较大的距离。自体EPC移植治疗缺血性疾病的优点为:EPC取材方便, 简单的骨髓穿刺或抽取外周血即可获得, 对机体无害, 细胞来源不受限;细胞取自自体, 移植时不存在组织配型及免疫排斥问题, 从动物及临床试验来看疗效显著。
5 展 望
尽管EPC移植在动物试验以及小规模临床试验中具有较好的疗效, 显示出广阔的临床应用前景, 但必须认识到, 要将EPC移植大规模应用于临床仍有许多问题需要解决: (1) EPC的表面标记仍未完全阐明, 继续寻找能把EPC与造血细胞和成熟内皮细胞鉴别开的特异性表面标志, 这将为分离和扩增EPC提供标准, EPC的体外扩增条件以及增殖潜能等需进一步明确, 以便获得足量有活力的细胞源, 进而为临床细胞治疗铺平道路。 (2) EPC在循环中的量及其富集、分离方法仍存在较大差异。 (3) 需进一步明确参与促进EPC器官特异性趋化和调节EPC移植的介质及细胞机制。目前的实验研究尚不能决定刺激血管新生的最佳治疗方案, 多因子的协同作用尚未研究。 (4) 注意应用EPC移植可能发生的各种不良反应, 如:促血管发生的同时, 也可能促使潜在肿瘤的生长和血管瘤的出现。尽管研究表明, 近期效果较好且也未发现重大不良反应, 但远期疗效如何仍有待进一步观察。
