ELISA试验（精选4篇）

ELISA试验 第1篇

1 样品的采集和保存

ELISA试验最常用的是血清样品。为了保证试验的准确性,血清的采集和保存尤为重要。首先应避免溶血。因为血红蛋白中的类过氧化物活性物质会与试验过程中的辣根过氧化物酶反应,造成假阳性的发生。其次,样品采集过程中应尽量保证无菌操作,减少污染。为了保证样品的有效物质不被降解,同时避免样品发生腐败,采集的样品于4℃短期保存。如需长期保存,则应-20℃°或-70℃保存,并避免反复冻融。

2 试剂的准备

目前有很多商品化的ELISA试剂盒可供选择,省去了很多试剂的准备工作。但是商品化的试剂盒在使用前也有很多注意事项。首先,ELISA试验对室温的要求一般为18~26℃。有的反应步骤要求37℃恒温。因此,实验室首先得满足实验条件,具备温控系统和恒温箱。在试验前于4℃保存的试剂盒必须恢复至18~26℃后方可使用。应注意每种试剂是否符合实验要求,如检查TMD底物是否已经显色变质,对不符合试验要求的试剂弃用,严禁用于后续试验。

3 温育反应时间的控制

因为ELISA是根据抗原抗体的特异性反应,依据酶标结合物和底物的显色差异来进行试验判断,而酶促反应对反应时间又有很高要求,因而ELISA试验中应严格按照说明书进行操作,缩短或延长反应时间,会造成试验失败和准确性降低。

4 洗板

ELISA试验 第2篇

但是有的养殖户对饲养管理做的不到位, 防治措施和方法不对, 羊舍拥挤, 潮湿, 空气不流通, 卫生条件不良往往造成大面积群发和死亡, 严重危害养羊生产。

实线证明, 正确合理的饲养方法是提高羊群肉量, 增加经济效益的有效途径, 所以养殖业户一定要努力提高养羊管理水平做好防疫防治工作。我们按实验计划每县50份羊血清, 12各县 (市) 总600份羊血清打疫苗后1个月采血做检测。

1 材料与方法

1.1 接种免疫使用口蹄疫病毒

“亚I”、“O”型双价活疫苗, 新疆天康畜牧生物技术服务有限公司生产。批号:2012018、生产日期20120611、有效期20130610。

1.2 实验用的“O”型血凝抗原

生产批号2013052904, 有效期20130828。

1.3 实验用的“O”型ELISA试剂盒

批号2013061906。有效20131219。该抗原和试剂盒中国农业科学院兰州研究所诊断中心生产自治区动物防疫总站提供。

2 主要仪器设备

电热恒温箱、振荡器、96空微量板、酶标仪、洗板机、电脑、各种移液枪。

3 实验方法

2月10日同时安排打苗, 3月10日安排采血检测。

3.1 口蹄疫正向间接血凝试验

按照国家标准“口蹄疫防治技术规范”所定的方法操作。

3.2 口蹄疫免疫抗体检测液相阻断ELISA (LB-ELISA)

按照国家标准“2007口蹄疫酶联免疫吸附试验ELISA (LB-ELISA) ”所规定的方法操作。

4 实验结果与结论

4.1此次调查采用正向间接血凝试验

此方法正常用于免疫口蹄疫疫苗后能否产生抗体或抗体滴度能否达到免疫保护, 以利于指导生产。该方法操作简便, 快速而且不需要昴责的仪器设备很适合在基层应用。缺点就是结果受操作技术人员的主官性影响较大而且结果存在一定的不确定性。更正确的判定和抓握羊群的实际免疫效价我们统一分血清还用ELISA实验来操作。本实验的正确性很高, 补充正向间接血凝试验的缺点。这两种实验证明本次“亚I”、“O”型双价的效果很不错。都达到上级部门的要求。

4.2做好生物安全防范

提高羊群健康水平规范, 合理用药, 制定科学合理的免疫程序认真做好免疫。

4.3 克服养羊过程中的各种应激反应, 确保羊群健康减少发病。

ELISA试验 第3篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

短肽修饰后的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1)SC为抗原，SC抗原、抗SC的多克隆抗体及阴性血清均由作者实验室制备;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G购自Protein Tech公司。

1.1.2 试剂

TMB购自Sigma公司;氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、十二水合磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、双氧水、吐温20均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 显色液的配制

精确称取TMB溶于DMSO中配成5mg/ml的储备液，置于4℃保存。显色时，在醋酸钠-柠檬酸缓冲溶液中(p H 5.5,0.1mol/L醋酸钠，0.013mol/L柠檬酸，0.5mmol/L EDTA,5%(V/V)甘油)加入TMB储备液和H2O2，配制成显色液，现用现配。

1.2.2 间接ELISA法

间接ELISA的方法步骤见参考文献[1]。

1.2.3 正交试验

以TMB浓度、H2O2浓度、p H值和反应时间和温度为考察因素，根据单因素试验的结果，选取4个水平，做5因素4水平的正交试验[2]，每个试验做3个平行，正交试验因素水平设计见表1，表中A、B、C、D、E分别代表TMB浓度、H2O2浓度、p H、反应时间和反应温度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 TMB浓度对显色的影响

配制浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg/ml的显色液，配制过程中发现，浓度超过4.0mg/ml时，出现肉眼可见沉淀。试验结果见图1，当TMB的浓度达到2.0mg/ml时，吸光度最大，即2.0mg/ml的TMB可以满足一般条件下的ELISA检测的要求;当TMB浓度超过3.0mg/ml时，吸光度开始下降，推测可能与TMB过饱和析出生成沉淀，或者非特异性的显色使本底值升高有关。

2.1.2 H2O2浓度对显色的影响

配制TMB浓度为2.0 mg/ml,H2O2(30%)浓度分别为0.01、0.03、0.06、0.08、0.1、0.15、0.20%(V/V)的显色液，进行显色反应。结果见图2，随H2O2浓度的增大，OD值先是增强随后减弱。当H2O2(30%)浓度为0.03%(V/V)时，吸光度最大，当H2O2浓度高于0.03%时，随H2O2浓度的增加，吸光度显著降低。这是因为高浓度的H2O2使HRP活性中心的铁离子由二价变为三价，从而使酶失去了催化功能[3]，为确保H2O2浓度在相对于酶过量的前提下不影响酶的活性，H2O2的浓度应控制在一定范围内，结果表明，显色反应中H2O2的最佳浓度为0.03%(V/V)。

2.1.3 p H对显色的影响

配制TMB浓度为2.0mg/ml,H2O2(30%)浓度为0.06%(V/V)，p H分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的显色液进行显色，结果如图3，当p H为5.0～5.5时显色效果较佳，当p H值大于6.5或小于4.0时OD值显著减小，这是因为HRP的等电点为7.2，中性环境下，酶的溶解度降低，分子发生聚合，空间结构发生改变，使酶丧失活性;在p H小于4.0时的酸性条件下，活性中心的电子传递不能正常进行，导致酶的活性降低[4]。

2.1.4 温度对显色的影响

配制用TMB浓度为2.0mg/ml,H2O2(30%)浓度为0.03%(V/V)，p H为5.5的显色液，使显色反应分别在15、20、25、30、35、40、50、60、70℃的温度环境下进行，结果见图4，反应温度在30～50℃范围内，OD值最大且比较稳定，当温度超过50℃时，吸光度显著减小，可能高温条件导致HRP酶变性，结构发生变化，从而影响了其生物活性。

2.1.5 反应时间对显色的影响

采用2.1.4中配制的显色液，使显色反应在35℃的环境下分别进行5、10、15、20、25、30、35、40、50min，结果见图5，当反应进行5min后已有绝大部分的底物参加了反应，当反应进行到10～15min后，底物全部反应完毕，此时吸光度最大;当反应时间超过20min后，随着时间的延长，由于空气的氧化作用使本底吸光度升高，导致显色结果的下降。为了减小空气氧化的影响，显色应控制在10～15min内。

2.2 正交试验结果

影响ELISA检测的因素很多，本试验选取了对显色影响较大的几个因素:TMB和H2O2浓度、p H、显色温度和显色时间进行正交试验，因素水平的选取参考单因素试验的结果。

由表2正交试验的直观分析结果可知，5个因素对显色影响的主次顺序为TMB>H2O2>p H>反应时间>反应温度。

由于因素E的极差R最小，因此将因素E作为误差项，对另外4个因素进行方差分析。由表3可见，在本试验考察范围内，TMB和H2O2浓度及p H是影响TMB/HRP显色系统的主要因素，水平间的差异具有统计学意义;而反应时间和温度均为次要因素，各水平之间差异无统计学意义。由各因素所选用的几个水平来看，TMB/HRP显色体系的最佳反应条件为A3B3C2D2，即显色液中TMB的浓度为2.5mg/ml,H2O2(30%)的浓度为0.03%(V/V)，p H为5.0，反应时间为10min，反应温度为30～50℃。

3 讨论

TMB难溶于无机相，为了增强TMB的溶解度，本试验在显色液中添加了5%甘油，显著改善了TMB在缓冲液中的溶解性，比传统BOS配方中TMB的溶解度提高了3倍[5]。TMB稳定性也较差，仅能稳定存在几周[6]，因此TMB显色液需现用现配。

注:F0.05(3,3)=9.28;F0.01(3,3)=29.5。

TMB/HRP系统的显色受TMB、H2O2浓度及p H、反应时间和反应温度多个因素的影响，李俚[7]和李红梅[8]分别就上述的部分因素进行了研究，但二者仅采用了单因素试验，忽视了各因素之间的交互作用，致使结果存在一定差异。与二者不同，本研究在单因素试验的基础上，选取了合理的因素水平，利用正交试验实现了多因素多水平的不同组合，充分考虑了各因素之间的交互作用。与常规的单因素试验相比，单因素试验联合正交试验优化ELISA显色体系的方法更科学、更准确。

本文通过单因素试验及正交试验探讨了ELISA TMB/HRP显色系统中影响显色的主要因素，确定了这些因素影响显色反应的主次顺序为TMB>H2O2>p H>反应时间>反应温度，并制订了优化这些因素的方法，利用该方法优化了TMB/HRP显色系统的最佳反应条件为:醋酸钠-柠檬酸显色缓冲溶液的p H为5.0,TMB的浓度为2.5mg/ml,H2O2(30%)的浓度为0.03%(V/V)，反应时间为10min，反应温度为30-50℃。该方法也可以用于ELISA其它显色系统的优化。

摘要：目的:建立ELISA显色体系的优化方法,优化TMB/HPR显色系统的反应参数。方法:首先采用单因素试验,研究显色体系中的缓冲溶液pH、TMB浓度、H2O2浓度、反应时间和温度对显色的影响,在此基础上,再进行5因素4水平的正交试验。结果:TMB/HRP体系的最佳工作条件:缓冲液pH为5.0,TMB浓度为2.5mg/ml,H2O2浓度为0.03%(V/V),反应温度为30～50℃,反应时间为10min。结论:优化的TMB/HRP最佳反应条件,可以满足一般反应的要求,所建立的TMB/HRP体系的优化方法也适用于其它ELISA显色系统的优化。

关键词：ELISA,正交试验,TMB,HRP

参考文献

[1]Andrea C,Klaver,Lynnae M,et al.Measurement of anti-Aβ1-42antibodies in intravenous immunoglobulin with indirect ELISA:The problemof nonspecific binding[J].Journal of Neuroscience Methods,2010,187(2):263-269.

[2]李云雁,胡传荣.试验设计与数据处理[M].北京:化学工业出版社,2009:167-189.

[3]Henriksen A,Smith AT,Gajhede M.The Structures of the Horserad-ish Peroxidase C-Ferulic Acid Complex and the Ternary Complex with Cy-anide Suggest How Peroxidases Oxidize Small Phenolic Substrates[J].TheJournal of Biological Chemistry,1999,274(49):35005-35011.

[4]洪伟,张朝晖,芦国营.辣根过氧化物酶的结构与作用机制[J].生命的化学,2005,25(1):33-36.

[5]Bos ES,Van der Doelen AA,van Rooy N,et al.3,3',5,5'-Tetram-ethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horse-radish peroxi-dase in enzymeimmunoassay[J].Journal of Immunoassay,1981,2(3-4):187-204.

[6]俞彩霞,赵静,王保民,等.硫代硫酸钠在四甲基联苯胺贮液保存中的应用[J].中国农业大学学报,2006,11(2):27-30.

[7]李俚,张连彦,高明春,等.间接酶联免疫吸附试验显色系统主要影响因素的探讨[J].中国兽药杂志,2008,42(6):43-46.

ELISA试验 第4篇

1 资料与方法

1.1 血清样本

1100份血清样本均为2012年6月~2014年2月在我院献血者血清样本或在我院接受治疗的梅毒患者血清样本, 其中男723例, 女377例, 健康者血清样本960份, 梅毒患者血清150份。

1.2 试剂与仪器

TPPA由日本富士株式会社生产, ELISA由北京万泰生物药业有限公司提供[2], 所有试剂应严格按说明书上操作, 在有效期内使用。芬兰雷勃酶标仪、雷勃洗板机、性病振荡器均按说明书进行, 仪器参数在正常范围内。

1.3 方法

所有样本经两种方法检测, ELISA按说明书对梅毒进行筛查, 结果观察酶标仪读数;两种检测说明书上设有室内质控品及阴阳性对照, 均满足试剂规定标准, 严格按照说明书操作步骤进行。

1.4 研究指标

比较两种方法检测的阳性率与假阳性率及敏感度、特异度。阳性率:分别运用ELISA、TPPA检测梅毒患者中出现阳性的例数, 阳性率=阳性例数/梅毒患者总数;运用ELISA、TPPA检测健康者中出现阳性的例数, 假阳性率=健康者阳性例数/健康者总数;其他指标根据阳性例数与假阳性例数算出。

1.5 统计学方法

应用SPSS17.0对数据进行统计学分析。计数资料的比较采用χ2检验, 以百分率表示, P<0.05差异有显著性意义。

2 结果

2.1 两种方法对梅毒患者、健康者检测阳性率比较

ELISA检测中梅毒患者出现145例阳性, 阳性率96.67%, 健康者中出现阳性例数7例, 阳性率7.29%;TPPA梅毒患者中出现148例阳性, 阳性率98.67, 健康者出现3例阳性例数, 阳性率3.12%, 差异对比均不显著 (P<0.05) , 见表1。

2.2 两组检测相关指标分析

TPPA检测的敏感度 (148/150) 、特异度 (957/960) 均高于ELISA检测法的敏感度 (145/50) 、特异度 (953/50) , 由于两种方法的特异性均较高, 差异不具有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

梅毒由梅毒螺旋体感染引起的感染性疾病, 感染10d后起疮, 潜伏期平均为3周, 疮斑出现后1w后可在血清中检测出抗体[3], 若能尽早诊断后进行治疗, 对疾病救治有重要意义。

梅毒螺旋体在体内会产生特异性抗体、非特异性抗体[4]。两种脂质抗体在梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 检测中血清特异性高、灵敏度强, 一旦感染抗体在体内持续存在保留终身, 检测结果不随治疗而变化, 出现假阳性反应低[5]。TPPA组960例健康者中仅出现3例, 假阳性率0.32%;ELISA法通过基因重组合成抗原, 检测特异性抗体, 在梅毒各期均表现较高的敏感性, ELISA利用梅毒旋转体的特异性标识酶标板孔, 采用双抗原夹心检测出梅毒特异性Ig M与Ig G抗体, 保证在梅毒病情发展各期都有较高的检测率, ELISA检测的假阳性相对较高, 假阳性率为0.73%远高于TPPA组, 但因两组检测方法的特异度、敏感度均较高, 检测结果不具有统计学意义 (P>0.05) 。TPPA阳性率高, 假阳性率低, 但有时易受肉眼判断的影响, 使结果准确性下降, 操作复杂需将样本稀释后检测、试剂昂贵, 无法进行大批量筛选;ELISA检测相对操作简单, 直接通过酶标仪观察结果, 简便、数据易保存。在实际操作中根据具体情况选择试剂, 在准确率要求高, 少量样本检测时运用TPPA检测, 在大批量检测时选用ELISA简单易行, 同时准确率较高。

综上, 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 相比酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测梅毒准确率高, 误诊率低, 检测过程中应根据实际情况选择合适的检测方法以达到最佳检测效果。

摘要：分别用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 与梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 对我院150份梅毒患者血清与960份健康献血者血清进行检查, 比较两种方法检测的阳性率、假阳性率、敏感度、特异度。结果 ELISA检测中梅毒患者出现145例阳性, 阳性率96.67%, 健康者中出现阳性例数7例, 阳性率7.29%;TPPA梅毒患者中出现148例阳性, 阳性率98.67%, 健康者出现3例阳性例数, 阳性率3.12%, 差异对比均不显著 (P<0.05) , TPPA检测的敏感度98.67%、特异度99.68%均高于ELISA检测法的敏感度96.67%、特异度99.27%, 差异不具有统计学意义 (P<0.05) 。梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 相比酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测梅毒准确率高, 误诊率低, 但TPPA相对价格贵, 造作复杂, 检测过程中应根据实际情况选择合适的检测方法以达到最佳检测效果。

关键词：联免疫吸附试验,螺旋体明胶颗粒凝集试验,梅毒

参考文献

[1]刘青梅.梅毒三种不同检测方法的比较[J].实用预防医学, 2010, 17 (1) :152-154.

[2]张晓红.TP-ELISA与TPPA梅毒检测方法的比较[J].中外健康文摘, 2013, 12 (6) :22-23.

[3]夏瑞, 李姝英, 陈苗水, 等.TPPA、ELISA、TRUST 3种梅毒检测方法的比较[J].现代预防医学, 2008, 35 (24) :4864-4865.

[4]高凯.梅毒检测的ELISA法、TPPA法、TRUST法比较[J].中国医药指南, 2013, 11 (34) :108-109.