靶向载体范文（精选6篇）
靶向载体 第1篇
关键词：主动靶向,高分子,药物载体,生物素,叶酸
0 引言
随着科技的发展, 癌症的有效治疗依然是一个巨大挑战。传统的治疗方法是通过全身给药, 即药物通过给药部位进入血液循环, 由循环系统运送至各脏器组织 (包括靶组织) 。这种给药方式会杀死非作用部位的正常细胞从而产生很强的毒副作用[1];同时, 在药物的分布过程中, 机体代谢了大量的药物, 大大降低了药物的生物利用度。而靶向给药则可以有效的避免这些缺点[2,3]。
靶向给药的原理是通过药物释放体系选择性地与靶组织在细胞水平上发生反应, 使药物能够可控性的分布。抗癌药物通过脂键与生物可相容载体接合在一起。药物载体的链接可以通过肿瘤部位的癌细胞特异性酶, 或者pH值的高低而水解, 从而有效控制药物的释放, 降低药物对机体的副作用。靶向给药的理论基础是受体与配基的结合具有高度的结构专一性, 受体结合部位能够专一的识别相应的配基并与之结合。利用对某些组织细胞具有特殊亲和力的分子作载体, 与药物偶联后得到的靶向药物, 能够将药物定向输送到作用的靶器官, 靶向药物可以认为是前体药物的一种特殊形式。靶向给药的优点有:有效减少用药剂量, 降低药物对机体的不良反应;延长药物在体内循环时间, 可以持续产生药效, 长时间保持靶细胞的有效药物质量浓度[3]。靶向给药按照其作用方式分为主动靶向和被动靶向。主动靶向可以分为物理靶向和生物靶向。
本文是通过叶酸-叶酸受体靶向, 生物素-亲和素靶向, 以及其他常见的高分子载体类型的靶向来阐述生物主动靶向型高分子药物载体的研究现状。表1列出了几种药物靶向体系[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]。
1 叶酸靶向体系
叶酸 (FA) -叶酸受体 (FR) 靶向系统是由受体介导的内吞途径进入细胞, 是通过两种跨膜蛋白细胞转运方式, 即低亲和力的还原性叶酸载体和高亲和力的叶酸受体完成的。研究发现叶酸受体在许多组织中难以检测到, 并且正常的组织中的叶酸受体表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜, 但是在转移瘤表面则发现叶酸受体过度表达[16]。图1[17]中枝丫状代表叶酸配体;小实心圆点代表包裹在纳米粒子水相中的药物;方形表示配体。用数字1~6表示靶向过程。步骤1~3表示非靶向和靶向的脂质体在体内的运行状态。步骤4~6表示叶酸靶向的特异性。
两亲性高分子聚合物在水中能自聚形成亲水性外壳, 疏水性内核的纳米粒子。以纳米粒子为载体, FA作为靶向配体制成的靶向体系, 具有毒副作用小, 稳定性好, 长效缓释以及靶向性等优点, 目前在运送药物方面取得了良好的效果 (见表1) 。
Hu等[4]将甲氧基聚乙二醇 (mPEG) 作为亲水链, 而乳酸 (LA) 和2, 2-二羟基丙稀碳酸脂 (DHP) 形成的共聚物作为疏水性链段, 分别制成了含阿霉素 (Dox) 以及含叶酸的纳米粒子胶束:mPEG-b-P (LA-co-DHP/Dox与mPEG-b-P (LA-coDHP/FA。通过共聚焦显微镜 (CLSM) 技术和流式细胞术展示了二者体外细胞实验对比, 发现人类卵巢癌细胞 (SKOV-3) 对含FA的胶束具有优先的选择性。同样, Cheng等[5]以DOX作为模型药物, 在普朗尼克 (Pluronic) 两端分别接FA和聚N-异丙基丙烯酰胺 (PNH) , 得到具有靶向功能的两亲性载体FA-Pluronic-PNH。通过在人类宫颈癌细胞 (Hela) 和人类肺癌细胞 (A459) 上加以空白DOX和装载DOX的纳米粒子胶束, 证明了FA能增加具有FR细胞对胶束的摄取率。Zhang等[6]通过利用多功能普朗尼克PluronicP123/F127 (PF) 混合物偶联包埋紫杉醇 (Paclitaxel, PTX) 研究其治疗多药耐药性 (Multidrug resistance, MDR) 肿瘤的功效。通过将Taxol、PF-PTX、FPF-PTX (FA-PF-PTX) 三组药物注射到携带有人口腔上皮鳞癌KB细胞的MDR荷瘤小鼠身上来做对照实验, 研究发现, 注射药物22天以后, 注射FPF-PTX的小鼠的肿瘤体积, 分别比注射PTX、PF-PTX的小鼠小52.8%和37.1%。证实了叶酸受体介导的主动靶向明显加强了含叶酸受体细胞的胞吞行为, 以及普朗尼克作为PTX药物的运送模板有效克服了肿瘤药物的多药耐药。相对于空白的小鼠, 注射PTX的小鼠其肿瘤细胞的生长得到了很好的抑制, 说明FPF-PTX成功地结合了二者的特点。
Park等[7]将FA接在聚乙二醇/聚己内酯 (MPEG/PCL) 上以便靶向治疗癌症。研究发现没有接FA的MPEG/PCL装载的紫杉醇 (PTX) 对正常纤维母细胞、人乳腺癌细胞 (MCF-7) 以及人宫颈癌细胞 (HeLa 229) 有相同的毒性, 而接有FA的MPEG/PCL对于癌细胞则展示了更高和更好的选择性。通过用共聚焦显微镜测试接有荧光基团的FA-MPEG/PCL包埋的PTX胶束的分布情况, 证实了癌细胞可以通过叶酸受体选择性的胞吞摄入纳米胶束。
FA接纳米凝胶做为药物载体同样展现了良好的装载, 以及摄取稳定性等优点。Nukolova等[18]以具有一定交联度的聚氧乙稀-聚甲基丙烯酸嵌段共聚物 (PEO-b-PMA) 纳米凝胶偶合叶酸 (FA) , 作为运送顺氯铵铂 (Cis-dichlorodiamminoplatinum, CDDP) 的纳米药物载体。人类卵巢癌A2780移植瘤作为体内实验对象, 用CDDP, 纳米凝胶装载CDDP, 叶酸偶合纳米凝胶装载CDDP, 叶酸偶合纳米凝胶装载CDDP和叶酸混合物进行对比试验, 结果表明叶酸偶合纳米凝胶装载CDDP在肿瘤部位滞留是最多的, 并且通过靶向作用显著减少了肾的排毒压力。另外通过研究发现, 体系中自由叶酸的数目会对叶酸靶向起到抑制作用, 所以优化偶合在纳米凝胶上的叶酸分子能展现出更良好的摄取效果。
2 生物素-亲和素靶向体系
生物素-亲和素系统 (BAS) 是20世纪70年代末发展起来的一种生物反应放大系统, 具有特异性高、灵敏度高、稳定性高等特点, 被广泛用于生物医学各领域, 其介导的肿瘤显像和靶向治疗是近几年来肿瘤早期诊断和治疗研究的热点 (见表1) 。
BAS介导的肿瘤靶向给药分为“两步法”和“三步法”。目前较热门的是三步法给药:先在肿瘤部位给注射生物单抗, 然后注射亲和素与之在肿瘤部位结合形成聚集体, 从而迅速被网状内皮细胞清除, 最后注射生物素标记的药物载体。
Xiong等[8,9]利用生物素-亲和素三步法检测包埋紫杉醇的B-Pluronic-PLA纳米粒子对肿瘤细胞 (OVCAR-3和SK-OV-3) 的细胞毒性 (MTT) (见图2[9]) 。其实验测试结果显示包埋紫杉醇的B-Pluronc-PLA纳米粒子对OVCAR-3细胞 (细胞表面表达CA-125抗原) 的抑制作用要明显强于SK-OV-3细胞 (细胞表面不表达CA-125抗原) 的抑制作用。这说明包埋药物的B-Pluronic-PLA纳米粒子利用生物素-亲很素三步法给药有显著的靶向作用。
两步法在研究生物分布时通常以一种循序渐进的形式来实现肿瘤的靶向治疗。Pan等[10,11]通过将肿瘤坏死疗法 (Tumor necrosis treatment, TNT) 与生物素-亲和素靶向体系组合, 设计出一套两步法治疗肿瘤的新方法。第一步, 将生物素修饰的嵌合性肿瘤坏死疗法的单克隆抗体 (Chimeric TNT-3monoclonal antibody, chTNT-3) 绑定在肿瘤细胞区域内已经老化的肿瘤细胞上。第二步, 24h以后利用由链霉亲和素改性的脂质体包埋阿霉素, 将阿霉素运送到肿瘤部位。酶联免疫法证实了肿瘤内生物素修饰的chTNT-3的存在。当初始n (Ab) /n (PDP-PEG-HSPE) =1∶10时, 脂质体与抗体的连接效率为71%, 抗体密度为106μgAb/μmolPL。chTNT-3经化学修饰后连接到脂质体表面, 其免疫活性基本保留。chTNT-3-空间稳定脂质体能特异性地结合固定Raji细胞。该两步法中阿霉素的半衰期介于自由阿霉素和空间稳定脂质体包埋阿霉素之间。在给予包埋阿霉素脂质体4h和24h以后, 阿霉素的水平达到高峰。含H460肿瘤的Balb/c裸鼠在第二次治疗3天以后表现出良好的抗肿瘤功效。Xia等[19]先将荧光素酶基因标记的鼠神经胶质瘤细胞植入在成年老鼠的脑部, 然后在静脉内注射270g/kg的生物素修饰的短的干扰核糖核酸 (short interfering RNA, siR-NA) 并通过生物素链霉亲和素链接将其运送到转铁蛋白受体抗体上, 通过转铁蛋白受体抗体将药物带进脑内 (转铁蛋白受体抗体选择性穿越血脑屏障) 。结果发现通过静脉注射的siRNA能够有效降低老鼠颅内69%~81%的荧光素酶基因的表达。
生物素-亲和素系统作为肿瘤治疗效果的显像, 在研究药物分布状况中具有优势。Cheng等[12]以生物素接乙二醇 (biotin-PEG) 作为壳, 以聚N-异丙基丙烯酰胺-N-羟甲丙烯酰胺[P (NIPAAm-co-HMAAm) ]作为内核在高温下合成新型纳米共聚物[biotin-PEG-b-P (NIPAAm-co-HMAAm) ]。通过透射电子显微镜, 观察到共聚物在水中自聚形成了球形胶束。将抗癌药物甲氨蝶呤 (Methotrexate, MTX) 装载入胶束中, 观察其在不同温度中MTX释放的行为。增强化学发光检测为基础的毛细管电泳免疫分析法证实了与共聚物相关联的生物素。根据生物素-转铁蛋白预处理可以有效加强胶束对于癌细胞的绑定, 经生物素-转铁蛋白混合后的Hela细胞摄取率为12.2%, 未经混合的为5.5%, 从而间接证明了该新型药物载体对于肿瘤细胞的靶向化学治疗。Medina等[13]通过闪烁照相方法观察99mTc-标记的亲和素/生物素-脂质载药体系在正常老鼠的胸膜内的纵隔淋巴结上的分布情况。研究发现亲和素先于生物素-脂质载药体系注射的靶向效果 (15.7%;p<0.05) 明显高于亲和素后于生物素-脂质载药体系注射 (8.3%) 以及未注射亲和素的 (1.0%) 靶向效果。
生物素-亲和素作为靶向定位的基础, 具有更高的导向性和低毒副作用。Gasparri等[20]利用动物模型探索肿瘤坏死因子 (Tumor necrosis factor, TNF) 对局部的治疗指数的影响。通过皮下注射WEHI-164鼠纤维内瘤细胞和RMA淋巴瘤细胞 (该类型的细胞能够在薄膜表面表达Thy1.1抗原) 。该抗原能够成功与腹腔注射的生物素修饰的抗体-Thy1.1以及亲和素结合。这步预处理增加生物素接肿瘤坏死因子共轭体系 (B-TNF) 5倍的细胞活性, 并且没有增加系统的细胞毒性。通过肿瘤细胞24h间接体内疗法分析以及动物存活率和失重判断:接有亲和素的肿瘤坏死因子能够持续几个小时在细胞靶向定位的部分表达高抗肿瘤效应, 但是当亲和素被去除以后, 这个抗肿瘤效应将与最初的间接机制有关 (包括宿主的介导反应) 。
3 转铁蛋白靶向体系
转铁蛋白 (Transferrin, Tf) 是体液中不可缺少的成分, 不仅参与铁的运输与代谢, 还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节, 具有抗菌杀菌的作用。在脊椎动物所有具核细胞中均有转铁蛋白受体 (Transferrin receptor, TfR) 的表达, 尤其在肿瘤细胞、血脑屏障 (BBB) 、快速分裂等代谢旺盛需要大量铁的组织。转铁蛋白和转铁蛋白受体在药物转运和临床上得到越来越多的应用, 已引起广泛的关注 (见表1) 。
由于癌细胞表面转铁蛋白受体高度表达, Kawamoto等[21,22]将设计的可以裂解细胞膜的混合蛋白与转铁蛋白受体结合, 来治疗癌症细胞, 从而快速杀死癌细胞;并且通过体内实验, 发现其不产生T淋巴免疫细胞, 以及血液毒副作用, 从而减少机体的多药耐药性。
Abouzeid等[14]将聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE) 和维他命E偶合接Tf制成纳米胶束装载姜黄素 (CUR) 和PTX。以卵巢癌细胞SKOV-3为实验对象, 对比Tf和非靶向的抑制功效。结果显示:当控制CUR浓度为5~10μmol/L时, Tf靶向和非靶向纳米胶束达到半抑制浓度装载的PTX分别为0.74~0.1μmol/L, 1.78~0.68μmol/L。
Sawant等[15]通过将Tf与聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE) 偶合制成纳米胶束 (Tf-M) 包埋R547 (细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂) 药物, 以细胞表面度表达TfR的卵巢癌A2780为对象分别做体内体外实验评估其靶向功效和毒副作用 (见图3) 。共聚焦激光扫描显微下Tf-M被细胞胞吞的数目显著高于普通胶束 (M) 。体内以Tf-M、M、Tf-M-R547、M-R547和PBS五组对照试验, 10天后结果显示TfM、M、PBS三组对肿瘤没有抑制作用, 而Tf-M-R547抑制作用显著高于M-R547。
Xu等[23]合成了聚氨酯共丙交脂/1, 2二棕榈酰基甘油-3-磷酸乙醇氨共聚物 (HPAE-co-PLA/DPPE) , 然后在其边缘接精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽段 (RGD peptide, cRGDfK) 和转铁蛋白 (Transferrin, Tf) , 将其作为双功能定位的多烯紫杉醇的药物载体。这些本身带有荧光性质的共聚物在体内和体外实验时, 能清晰地观察到其分布情况。通过体外细胞毒性实验研究发现, 由于cRGDfK的存在, 在整和素αvβ3过度表达的脐静脉内皮细胞上, 细胞毒性加强了10倍。同样地在具有转铁蛋白受体过度表达的人类宫颈癌细胞, 细胞毒性也同样被加强了2倍。这些结果暗示了具有cRGDfK和Tf修饰的 (HPAE-co-PLA/DPPE) 纳米载体能够有效运载药物到血管内皮细胞和目标肿瘤细胞。
4 其他靶向体系
除了上面提到的3种比较通用的靶向方法, 许多其他的靶向给药的方式, 也展示了不俗的治疗效果。血管靶向是一种很有前景的治疗方法。这种方式在靶向对应的固体瘤的癌细胞时有能力去克服许多传输障碍, 这是因为肿瘤的脉管系统在系统循环中是直接进入靶向位置的传输工具。
Simnick等[24]报道了一种新型的抗血管靶向治疗策略, 该策略潜在地克服了许多靶向治疗的传输障碍。他们利用类弹性蛋白构成的 (Elastin-like polypeptide, ELP) 两性嵌段聚合物, 自聚形成的单分散球状胶束。然后将该胶束接上RGD三肽配体, 使其功能化。RGD是由精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺所构成基序的肽类, 这些肽类的结合特性依赖于内皮相关的氨肽酶N[aminopeptidase-N (CD13) , CD13], 而CD13与血管新生和肿瘤生长关系密切。通过研究他们发现相对于正常的组织RGD修饰的纳米粒子胶束显著的滞留在肿瘤区的血管内外。结果暗示了通过多元聚合物胶束靶向肿瘤血管周围细胞中显著上升的受体能显著加强传输效果。
寡核苷酸适配子以其高亲和力, 高靶向性, 易于体外筛选等优点迅速成为递送siRNA的常规手段之一。Farokhzad等[25]将可控释高分子纳米粒子 (Nanoparticle, NP) 和寡核苷酸适配子 (Aptamers, apt) 结合形成的生物共轭聚合物, 并测试了其靶向传送前列腺癌细胞的功效。通过合成聚乳酸-聚乙二醇-羧基 (PLA-PEG-COOH) , 并包埋了罗丹明修饰的葡聚糖 (作为模型药物) 制成纳米粒子。PLA-PEG-COOH具有负表面电荷当共轭带负电荷的核酸寡核苷酸适配子时能够降低非特异性相互作用;共聚物上带有的羧基可以方便聚合物的改性;聚乙烯二醇链段可以增加聚合物循环的半衰期, 从而减少非靶向细胞的摄取。他们用RNA寡核苷酸作为适配子, 二者形成了纳米粒子适配体体系 (NP-apt) 。RNA适配体能够和前列腺腺泡上皮细胞上的前列腺特异性膜抗原绑定。实验结果表明:前列腺LNCaP上皮细胞的NP-apt体系摄入是NP体系的77倍, 并且在其他没有前列腺特异性膜抗原表达的细胞上NP-apt的摄入并没有被加强。
Farokhzad O C等[25,26]通过利用生物可相容、生物可降解的聚乙丙交脂-聚乙二醇 (PLGA-b-PEG) 纳米粒子包埋多烯紫杉醇 (Docetaxel, Dtxl) , 并在表面接A10氟嘧啶RNA适配子作为前列腺特异性膜抗原 (Prostate-specific membrane antigen, PSMA) 细胞外域的特异性识别基团。通过体外实验发现纳米粒子包埋的多烯紫杉醇适配体 (Dtxl-NP-Apt) 能很好地与前列腺癌上皮细胞表面的前列腺特异性膜抗原 (PSMA) 结合。与缺少适配子的多烯紫杉醇纳米粒子 (Dtxl-NP) 相比, 发现接有适配子组细胞的药物摄入以及细胞毒性都有明显加强。Dtxl-NP-Apt体内实验展现了非常良好的功效, 可以发现细胞毒性随肿瘤体积减少而减少。单独注射Dtxl-NP-Apt时, 肿瘤体积减少了5/7, 并且在109天的观察中, 小鼠的存活率为100%。注射Dtxl-NP时, 肿瘤体积减少2/7, 109天内小鼠存活率为57%。而只注射Dtxl时小鼠存活率却只有14%。由此可见, 纳米粒子适配体, 在靶向治疗中的具有很好的应用前景。
Cheng等[27]合成了具有羧基端的聚羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物 (PLGA-b-PEG-COOH) , 并且研究了聚合浓度、装载效率以及溶剂中水混合比率对纳米尺寸的影响。因为纳米尺寸在特异性器官的靶向和非靶向具有显著影响。合成的纳米粒子尺寸在70~250nm之间, 呈线性分布。他们将这种具有令人满意的尺寸及装载效率的纳米粒子共轭接上A10RNA适配子 (Aptamer, apt) , 然后利用前列腺癌移植瘤小鼠模型, 做了NP和NP-apt对比试验。研究发现24h以后NP-apt运送药物到肿瘤上的效率是NP的3.77倍。
5 结语
靶向载体 第2篇
近20年来,我国恶性肿瘤的发生率和死亡率明显上升,在35~59岁的中年人群中,肿瘤已列居各类死因之首。实体肿瘤治疗首先应选择手术治疗,手术治疗癌症即对癌症组织进行全部或局部的切除,其治疗癌症的优势在于效果直接迅速,早期患者手术后有完全治愈的可能,但对于已经发生转移的癌症患者仅能做姑息性局部切除,且由于手术对人体的创伤较大,会使患者的免疫力降低,并且易出现一系列并发症。放疗是常用的治疗肿瘤方法之一,通过射线杀死肿瘤组织,对皮肤性、鳞癌等类型肿瘤效果显著,但也会对人体造成较大伤害,长期使用会导致不敏感。肿瘤化疗通过特效化疗药物杀死肿瘤组织,达到治疗效果,但此方法副作用较大。化疗经历了半个多世纪的发展和完善,已成为肿瘤综合治疗的重要手段之一[1],但化疗的疗效却处于较低的水平,这是由于目前的抗肿瘤药物不具备辨别正常细胞与肿瘤细胞的能力,在体内呈全身性分布,在杀灭癌细胞的同时也损伤了正常细胞,造成全身毒性反应,如骨髓抑制等,从而被迫停药,常常导致化疗失败。
近年来提出的靶向给药系统(TDDS)概念,即利用具有一定肿瘤靶向性的导向分子(载体)携带治疗肿瘤的药物通过局部或全身血液循环而使药物选择性地浓集定位于靶器官,在肿瘤局部选择性杀伤肿瘤细胞(及转移的肿瘤细胞),充分发挥治疗作用,靶向给药系统的研究已经成为国内外药剂学研究的重点之一,其中,微粒载体系统是靶向给药系统的一个研究热点。微粒载体系统是利用脂质体、纳米粒、微粒、微球、微囊、乳剂等作为载体,将药物包封或嵌入各种类型的载体系统,用药后,能选择性地浓集于肝、肺、淋巴组织、肿瘤细胞,发挥疗效。
本文对近年来各类具有靶向功能的抗肿瘤药物载体的研究概况作简要综述。
1 脂质体
脂质体将药物包封于脂质双分子层形成的薄膜中间,具有亲水的内部囊腔及亲脂性磷脂夹层结构,其主要成分是磷脂和胆固醇。
脂质体具有以下优点:既能包封脂溶性药物,又能包封水溶性药物,能够保护被包封的药物,提高药物的稳定性;具有细胞亲和性和组织相容性;能选择性地分布于人体内某些组织和器官;可以改变被包封药物的体内分布;提高药物治疗指数、减少给药剂量。
传统脂质体的一些缺点限制了其广泛应用,如靶向性只集中在网状内皮细胞丰富的器官,对其他器官则靶向性不明显;在体内不稳定,易被各种水解酶破坏或是被网状内皮系统摄取而被清除;包封率不高;用常规方法制得的脂质体易聚集,有效期太短等。目前,为了克服这些缺点,人们又在脂质体上做了一些修饰,研制出了免疫脂质体、磁性脂质体等。表1总结了一些新型脂质体及其靶向抗肿瘤效果[2-13]。
2 纳米粒
纳米粒是由高分子材料组成的骨架实体,粒径在10~100nm范围内,药物溶解、包裹于其中或者吸附在实体上。纳米粒具有靶向性,载药纳米粒可作为异物而被巨噬细胞吞噬,到达网状内皮系统分布集中的肝、脾等靶部位和连接有配基、抗体、酶底物所在的靶部位;载药纳米粒还能增加生物膜的通透性,也能穿越细胞间隙,通过人体最小的毛细血管及血脑屏障被细胞组织吸收,是最有价值的抗癌药物载体之一。但不容回避的是,其还面临一些重要问题,包括可供选择的药用载体材料比较有限,制备方法的工业化还有一定困难,纳米粒的长期稳定性、有效性和安全性有待考虑,以及一些新型的纳米粒的开发。制备纳米级载体与具有抗肿瘤药物相结合,以得到具有主动靶向的纳米药物,仍是目前研究的重点。
表2总结了一些新型的纳米粒及其靶向抗肿瘤效果[14-21]。
3 微粒
微粒包括微球和微囊。微球是以白蛋白、明胶、聚脂等高分子聚合物为载体而形成的微粒分散系统,直径一般为0.3~10μm。通过将抗癌药物置于微球内,在靶器官局部释放达到保护药物和增加疗效的目的,主要用于注射给药、动脉栓塞和口服等。微囊是指用天然的或合成的高分子材料作为囊膜壁壳,将(抗肿瘤)药物包裹成为药库型的微型胶囊。目前,应用最多的是通过微囊化方法形成靶向制剂。
表3 介绍了一些新型的微粒及其靶向抗肿瘤效果[28-36]。
4 胶束
聚合物胶束是一类由两亲性共聚物形成的聚合物体系,以疏水基团为内核,亲水基团为外壳的“核-壳”结构,粒径一般小于100nm,具有载药量高、稳定性好、低毒性、长循环性和靶向性等特点。
目前大多数研究还集中在对胶束理化性质的基础研究上,还需要系统地研究聚合物胶束的微观结构,载药聚合物胶束的体内分布,靶向及药效,为更多的载药胶束应用于临床奠定基础。
表4 介绍了一些新型的胶束及其靶向抗肿瘤效果[37-50]。
5 结束语
靶向载体 第3篇
为弥补以上非病毒载体的不足,基于纳米羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2,HAp)的基因载体研究越来越受关注。研究已证实:纳米HAp安全性高、生物相容性好,对正常细胞几乎没有毒性[6];纳米HAp可被细胞降解,降解时间与材料性能密切关联[7];通过尺度控制可实现物理靶向性;相对于病毒载体,纳米HAp无免疫原性,不会引起机体的免疫反应[8,9]。
纳米HAp用作药物载体或基因治疗载体已成为生物材料领域的研究热点之一,对拓宽非病毒载体的研究具有十分重要的意义。目前限制纳米HAp作为基因治疗载体的原因主要是转染效率低,提高转染效率是其关键问题。图1[10]为脂质体作为基因载体转染进细胞后的代谢过程,目前已证实多数非病毒载体包括纳米HAp,进入细胞后均具有类似的过程:当纳米HAp颗粒转染进入细胞后,部分HAp-DNA复合体进入细胞被溶酶体吞噬并降解,降低了纳米HAp颗粒转染效率[11,12]。纳米HAp的转染效率除与细胞有关外,还与HAp自身的理化性质(形貌、大小、晶型、表面电荷)密切关联,只有提高纳米HAp的转染效率并优化颗粒靶向性才能将其最终应用到临床。
纳米HAp携载治疗基因的抑癌效果研究已取得了积极成果,并且发现纳米HAp与部分抑癌基因如p53存在协同抑癌效应[13,14],然而纳米HAp较低的转染效率仍然是其达到理想抑癌效果的主要限制因素,因此寻找提高纳米HAp的转染效率的方法是目前研究的热点之一。
本文就纳米HAp用作基因载体转染细胞的研究现状以及影响其转染效率的因素做全面综述并对提高纳米HAp的靶向性的途径展开论述。
1 HAp-DNA的结合方式
目前制备HAp-DNA复合物有两种方法:一是在制备HAp的过程中将其与DNA以共沉淀方式形成HAp-DNA复合物;二是在制备纳米HAp后,通过纳米颗粒表面吸附DNA后形成HAp-DNA复合物。通过琼脂糖凝胶电泳和Z电位仪可以检测HAp负载DNA的效率。Bisht等[11]研究了上述两种方法对DNA的吸附能力,发现共沉淀方法合成的HAp-DNA复合物能有效抑制DNA酶对DNA的降解,而通过表面吸附的DNA则易被DNA酶分解。他们还发现在酸性条件下(pH=5.0)时,由于纳米HAp的分解,DNA能从HAp中释放出来;在碱性条件下(pH=8.0)时,HAp几乎没有分解,而DNA也不会从HAp中释放,如图2所示[11](其中:泳带1,Hind Ⅲ 酶切过的DNA;泳带2,pSVβgal DNA;泳带3-7,DNA在37℃释放0h、1h、2h、4h、24h的电泳结果)。
Xia等[15]在研究HAp结合DNA的过程时发现,将pDNA加入到纳米HAp悬液后涡旋10s,HAp能够充分负载pDNA。Wu等[16]在室温下,将1.43g/L pEGFPC2-NT3加入到等体积的表面呈正电性的HAp悬液中(1g/L),轻微充分摇匀,电泳发现HAp同样能够与DNA充分结合。HAp与DNA的结合能力与纳米HAp的形状、表面粗糙度及表面电荷密切关联。球形、面粗糙度大、表面带正电荷的纳米HAp颗粒会更加稳定地携载DNA。通过共沉淀方法制备的HAp-DNA复合物比较稳定,但结合DNA的量较少,且释放缓慢,另外具有复合物的溶液保存条件严格、时间短,制备步骤繁琐等不足。为便于临床应用,采用HAp先合成再携载DNA的方法更方便、经济、实用。
图2 DNA在pH 5.0(a)和pH 8.0(b)的溶液中的释放[11]Fig.2 DNA release at pH 5.0(a)and pH 8.0(b)shown by gel electrophoresis[11]
2 影响纳米HAp转染效率的因素
由于纳米HAp的转染效率较低,目前研究纳米HAp携载目的基因抑癌效果的研究尚少[13,17]。因此进一步研究影响纳米HAp转染效率的各种因素对HAp用于癌症基因治疗具有十分重要的理论意义。
2.1 表面电荷对纳米HAp转染效率的影响
纳米HAp载体的表面电荷是影响其转染效率最关键的因素。纳米HAp在偏中性(pH=7.4)溶液中重悬后表面呈负电性,当它携载目的基因转染细胞时,因与细胞表面负电荷[18]排斥作用,使纳米HAp的转染效率不高。多数研究表明,表面带有正电荷的纳米颗粒的转染效率明显高于表面带有负电荷或者不带电荷的纳米颗粒[19,20]。使颗粒表面带正电的方法主要是采用呈正电性的试剂对颗粒进行表面修饰,Chen等[16]采用PEI修饰纳米颗粒并使表面带有正电荷,研究发现,修饰过的基因载体的转染效率得到明显提高。Chen等[21]用12-氨基-十二烷酸对HAp颗粒表面进行带正电荷的表面修饰,研究发现,修饰后的纳米HAp表面电位明显提高(如图3所示,其中(a)12-氨基-十二烷酸,(b)酸性十二烷酸,(c)十二烷酸,(d)对照),用其转染成骨细胞,与带负电或中性电荷的纳米HAp相比,其转染效率明显提升,且修饰后的HAp能够明显促进成骨细胞的分裂增殖。
在纳米HAp的制备过程中添加辅助物质也可以对其表面改性,可改变纳米HAp的表面电荷并提高其转染效率。Chowdhury等[22]研究发现在制备碳酸磷灰石的过程中,添加锶和氟能够使其转染HeLa细胞的效率提高5~100 倍。Wang等[23]采用壳聚糖(CS)修饰纳米HAp表面,发现随着CS/HAp质量比的升高,其转染效率也逐渐升高。Nouri等[24]在含多种离子的模拟体液中合成了纳米磷酸钙颗粒,用其负载pEGFP/Luc后转染293T细胞,发现转染效率比在水溶液中制备的颗粒显著升高。Kimura等[25,26]利用超高静水压技术,制备了PVA/DNA颗粒,用其作为基因载体,然后采用高压方法将纳米HAp包封到PVA/DNA颗粒中制备成PVA/DNA/HAp颗粒,发现该颗粒能够有效地逃避溶酶体的降解,进入细胞核以提高转染效率。另外,表面改性的首要条件是保证改性后HAp良好的生物相容性,不同的表面修饰对细胞生物相容性、粘附性及诱导细胞凋亡的影响作用也明显不同[27]。
2.2 粒径尺寸对纳米HAp转染效率的影响
纳米HAp载体颗粒尺寸与形貌等因素与其转染效率密切相关[28],纳米HAp转染肿瘤细胞时,颗粒穿膜能力与粒径密切关联。Nadra等[29]制备了粒径为1.4~14μm的HAp颗粒并用其转染巨噬细胞,研究结果发现直径为1~2μm的HAp能够使巨噬细胞分泌TNFα的能力最强,而随颗粒粒径增大,巨噬细胞分泌的TNFα减少;当粒径增加到14μm时,细胞分泌的TNFα几乎为零,这是由于颗粒粒径太大,不能转染巨噬细胞引起的。该研究证实粒径对其转染效率具有重要的影响。
当颗粒粒径减小至纳米级(<100nm),尤其小于40nm时,颗粒进入细胞不再被受体介导的胞吞作用限制,而是由细胞直接吞噬,纳米颗粒的转染效率会明显提高[30]。尽管如此,不同颗粒与细胞间的作用呈现明显区别。Lin等[31]以SiO2为研究对象,研究发现直径为15nm和45nm的SiO2均对细胞有明显毒性,且毒性差异不大。Oberdürster等[32]研究表明具有相同尺度的超细TiO2颗粒则能引起严重的肺部炎症反应。这说明当上述两种颗粒的直径减小到纳米级时,转染效率会增加,对机体也产生较大毒性。然而纳米HAp在同样的尺度下对细胞却有良好的生物相容性。Cai等[33]制备了3种不同粒径的纳米HAp(粒径分别为20nm、40nm和80nm),研究发现不同粒径的纳米HAp对骨髓干细胞(MSCs)和骨肉瘤细胞(U2OS)的增殖作用存在明显差异,HAp能促进MSCs分裂而抑制U2OS的分裂,粒径为20nm的HAp效果最显著。该研究证实了纳米HAp能够促进正常细胞的增殖,而抑制癌细胞的增殖,HAp粒径越小对正常细胞生物相容性越好。
HAp的粒径对转染效率的研究虽还没有统一定论,但转染效率除与纳米载体自身的理化性质有关外,还与所转染的细胞类型有关。正常细胞具有一定的免疫功能,进入胞内的外来载体被细胞识别为“异物”,被溶酶体分解。然而癌细胞不能正确识别“自己”和“非己”,不能通过溶酶体完全分解进入胞内的“异物”颗粒,从而可使部分携载治疗性目的基因的载体进入细胞核。
2.3 形貌对纳米HAp转染效率的影响
纳米HAp载体颗粒的形貌包括HAp的形状和表面形貌。目前已报道的纳米HAp的形状主要有球形[34]、棒状[35,36]、针状[37]和纤维状[38]。根据Gao等[30]提出的受体介导的胞吞作用理论,直径为50~60nm球形纳米颗粒的转染效率最高。Zhao等[39]采用粒径40~60nm球形纳米HAp、棒状纳米HAp分别转染成骨细胞,结果表明球形HAp的转染效率显著高于棒状HAp。Motskin等[40]研究球形和棒状HAp转染人单核巨噬细胞时发现,棒状HAp的转染效率高达30%以上,而球形HAp的转染效率仅为2.7%。这些研究结果表明纳米HAp的转染效率与其形貌密切相关,当然同一形貌的纳米颗粒在转染不同的细胞时,其转染效率也会存在差异。
2.4 钙磷比对纳米HAp转染效率的影响
HAp-DNA转染效率主要受以上3个因素影响,已有研究表明改变HAp的钙磷比也可以提高转染效率。Olton等[41]调节Ca/P比例,当Ca/P的摩尔质量比为100~300时制备出颗粒粒径在25~50nm的HAp,携载DNA能够达到90%,转染MC3T3-E1和HeLa细胞的效率在70%以上。
3 纳米HAp的靶向性
纳米HAp载体具有一定的靶向性,然而其靶向性不高,是限制其用于癌症基因治疗的重要因素之一。研究提高纳米HAp靶向性的方法对其用作基因、药物载体的研究具有重要的价值。
Zhu等[42]制备长度为40~50nm的针状HAp,携载pEGFP-N1基因,通过尾部静脉注射到小鼠体内后,发现HAp颗粒主要分布在肝、肾、脑的细胞质内,少量分布在细胞核中。Roy等将HAp颗粒经尾部静脉注射进入小鼠体内后,发现HAp具有肝靶向性[43],并可通过肝脏代谢分解掉。蒋明等[44]利用HAp负载pEGFP-NT3基因,通过耳蜗灌注法,将基因转染进豚鼠损伤的耳蜗,结果在神经节细胞内检测到NT3 蛋白的表达对受损的耳有明显修复作用。Wu等[16]利用聚乙烯亚胺(PEI)修饰HAp颗粒,HAp负载pEG-FPC2-NT3后被注射到南美栗鼠的中耳与内耳之间圆窗膜,48h后检测荧光的表达量,发现在基底膜柱细胞中有荧光表达,表明经PEI修饰的HAp具有一定的靶向性。
改善载体颗粒的靶向性有两种方法:一种是采用癌细胞表面特异识别配体(如叶酸[45]、转铁蛋白[46]及(AspSer-Ser)6[47]等)对载体表面进行修饰,实现载体的主动靶向性。转铁蛋白受体在癌细胞表面大量分布,是临床检测评价体内是否有癌症存在的一种重要参数,Davis等[46]以此为靶标(图4为靶向纳米颗粒设计示意图),采用转铁蛋白修饰环糊精颗粒,携载siRNA治疗人急性黑色素瘤,注射到人体后检测发现载体能靶向转染黑色素瘤细胞。Zhang等[47]制备出一种(AspSerSer)6-脂质体载体,它与HAp具有高度亲和力,用其携载Plekho1siRNA,进入体内能靶向成骨细胞,并发现成骨细胞中Plekho1蛋白表达量快速下降至最终消失,成功解决了骨代谢疾病治疗的靶向性问题。另一方法是实现载体的被动靶向性,可通过控制纳米颗粒的粒径或合成过程中添加磁性元素(如Fe2+/Fe[48,49])。在人体中,肿瘤组织血管壁的细胞间隙为200~300nm,而正常组织血管壁的细胞间隙为100~200nm,当纳米HAp颈静脉注射后,可使纳米HAp通过细胞间隙扩散到周围组织中,实现对肿瘤的被动靶向性[50,51]。
4 展望
靶向载体 第4篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和质粒
舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学口腔医学院惠赠,针对FAK的siRNA表达载体由上海吉凯基因有限公司合成并扩增。
1.1.2 主要试剂
RPMI1640 培养基、G418(Gibco,美国),新生牛血清(杭州四季青),LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen,美国),羊抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人FAK抗体、HRP标IgG二抗(中杉金桥,北京),蛋白显色试剂盒(Pierce, 美国)。
1.2 方法
1.2.1 siRNA 序列设计及合成
在NCBI 数据库中查找FAK 的mRNA 全序列,从FAK 编码区中寻找符合设计原则的靶序列,通过BLAST 软件确定与其他非相关基因无同源性,按照pGCSilencerTM-U6/Neo 载体的要求设计能编码siRNA 的寡核苷酸链。寡核苷酸序列两端包含酶切位点,能直接与经相同酶切的pGCSilencerTM-U6/Neo载体连接。设计的siRNA 寡核苷酸序列如下:FAK1(干扰组1),其正义链为5′-GCATGTGGCCTGCTATGGA- 3′,反义链为5′-TCCATAGCAGGCCACATGC-3′;FAK2(干扰组2),其正义链为5′-GCTAGTGACGTATGGATGT-3′,反义链为5-ACATCCATACGTCACTAGC-3′;同时合成与FAK基因序列无关的siRNA作为阴性对照(NON-siRNA),GAPDH si RNA为阳性对照。然后将以上siRNA分别连接到pGCSilencerTM-U6/Neo载体上,分别命名为:pGCSilencer-FAK1、pGCSilencer-FAK2 、NON-siRNA和GAPDH。
1.2.2 细胞培养及转染条件的优化
转染前24 h取指数增殖期细胞,制成细胞悬液,接种于24 孔板,细胞密度为 5×108个/L。24 h后,取4 μl转染试剂与不含血清的RPMI 1640培养液室温下混合至体积100 μl,孵育 5 min,然后分别取 0.4、0.8、1.6、2.0、3.2 μl(浓度为1 g/L)的pGCSilencer-FAK1(或pGCSilencer-FAK2)与不含血清RPMI 1640培养液室温下混合至终体积各为100 μl。10 min内将上述pGCSilencer-FAK1 (或pGCSilencer-FAK2)与转染试剂混匀 (体积 200 μl),孵育10 min。细胞用不加血清及抗生素的RPMI 1640洗2 次,加入上述混合液,再加RPMI 1640至体积为2 ml。24孔板十字交叉轻摇,置CO2 培养箱中8 h后共聚焦显微镜下观察,红色荧光蛋白表达细胞计数,计算转染效率,实验重复3次,以GAPDH为对照。
1.2.3 细胞转染及单克隆细胞株的筛选
Tca8113 细胞用RPMI 1640 (含100 ml/L新生牛血清),在37 ℃, 50 ml/L CO2 条件下培养。将对数生长期细胞于转染前24 h接种于6 孔板,取pGCSilencer-FAK1、pGCSilencer-FAK2、GAPDH和non-siRNA重组体质粒DNA分别转染Tca8113细胞,转染方法参照LipofectamineTM2000转染试剂操作说明进行,转染48 h后用G418 (浓度0.4 g/L) 筛选,2 周后挑取阳性克隆细胞株,扩增培养,分别建立稳定表达pSilencer-FAK1、pSilencer-FAK2和Control的单克隆Tca8113细胞株,依次命名为Tca-FAK1、Tca-FAK2、Tca-NON和Tca-GAPDH。下述Western blot和免疫细胞化学的检测均采用筛选出的稳定细胞株。
1.2.4 Western blot检测
收获培养细胞,提取蛋白。配制100 g/L分离胶聚丙烯酰胺凝胶,每个加样孔中依次加20 μl待测样品,SDS-PAGE (100 g/L浓缩胶、80 g/L分离胶) 电泳12 mA 、2 h, 300 mA 2 h转膜,100 g/L脱脂奶封闭;1∶200一抗 4 ℃孵育 24 h, PBS洗10 min,重复洗3 次,加辣根过氧化物酶偶联的二抗,37 ℃下杂交1 h,PBS洗10 min,重复6 次,按化学发光法显影、定影并检测膜上印迹。
1.2.5 免疫细胞化学检测
将1 ml密度为5 ×108/L的细胞悬液滴于处理过的无菌盖玻片上,37 ℃、50 ml/L CO2 条件下孵育24 h,40 g/L甲醛固定,H2O2、正常羊血清处理后加入鼠抗人KAK单抗,4 ℃ 24 h后加入生物素化兔抗鼠IgG及SABC复合物,各步间均PBS(pH:7.14)充分振洗,DAB显色、脱水、透明、封片。以PBS代替一抗做为对照。
2 结 果
2.1 重组质粒酶切鉴定
将重组质粒pSilencer-FAK进行SacⅠ和SacⅡ酶切,RT-PCR及测序结果均证明靶向FAK基因siRNA重组质粒表达载体构建成功(图 1)。
2.2 转染条件的优化及效率测定
激光共聚焦显微镜下观察发现转染4 h后即有GFP标记的GAPDH和RFP标记的pSilencer-FAK转入细胞内,8 h达最高峰。转染效率以质粒2.0 μl、转染试剂4 μl组最高,pSilencer-FAK1和pSilencer-FAK2均达21%的转染效率。
2.3 激光共聚焦观察细胞形态
将重组质粒转染Tca8113, 经G418筛选2 周后,挑取阳性克隆团扩大培养。激光共聚焦显微镜下观察,Tca-FAK1、Tca-FAK2中可见红色荧光蛋白的表达(图 2);Tca-NON和Tca-GAPDH组可见绿色荧光蛋白的表达(图 3),证实目的基因被成功转染。此外,实验中发现,转染外源性质粒后细胞形态发生变化,细胞皱缩,细胞碎片增多。
2.4 免疫细胞化学
对照组及未转染组中细胞胞质呈棕黄色,FAK广泛表达于细胞质中(图 4)。实验组细胞质中FAK表达明显减少(图 5)。
2.5 Western-blot
各组间β-actin 的蛋白水平表达无明显差异,说明各组蛋白总的点样量基本一致。Tca-FAK1、Tca-FAK 2组FAK蛋白条带较Tca-NON和Tca-GAPDH组及未转染组蛋白条带明显减弱(图6)。
3 讨 论
根据肿瘤生物学特征,结合传统治疗方法设计新型生物治疗策略逐渐成为国内外广为关注的热点。FAK定位于人的8q24,cDNA 全长4 285 bp,编码1 052 个氨基酸,对其结构已清楚。学者们通过FAK单克隆抗体、受体阻断、寡核苷酸等抑制手段初步明确其分子生物学效应,但皆因抑制的暂时性难以应用于临床抗癌治疗[3]。由双链RNA引发转录后基因沉默机制的RNA干扰技术的建立,特别是在哺乳动物细胞应用小干扰RNA成功介导RNAi,以及RNAi的体内成功应用,为基因功能的研究提供了强大的武器,也为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径[4,5]。
siRNA或其相应表达载体的转染效率,是影响RNA干涉效果的一个关键因素。由于传统的脂质体介导方法对很多细胞的转染效率都不高,若需要稳定转染提高基因沉默效果,必须要挑选单个细胞克隆。本实验中应用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000转染细胞,虽然部分细胞瞬时转染的效率可达到40%～50%,但Tca8113细胞瞬时转染效率则不到20%。转染效率的差异可能与细胞种类、转染技术及条件有关。此外,不同siRNA稳定转染后的细胞对FAK基因的封闭效果不一样,这可能与序列的空间结构和质粒在基因组中的随机整合有关,从而影响了siRNA的表达。因此,我们首先对转染条件进行了优化,确定最佳转染条件。在检测FAK基因沉默效果时,本实验采用的是转染后稳定筛选的单克隆细胞株,通过应用免疫细胞化学及Western-blot检测,显示FAK基因在蛋白翻译水平受到明显抑制。
黏着斑激酶主要通过其多个位点的酪氨酸、丝氨酸等的磷酸化与含有SH2 或SH3 结构域的蛋白质接合,通过整合素、FAK/Src/p130CAS/JNK、FAK/ PI3激酶、FAK-ROCK/RhoA 等多条信号通路广泛参与细胞的多种生物学过程[4,6]。临床病理学研究表明,FAK在乳腺癌、肠癌等多种实体癌瘤中高表达,并参与肿瘤的发生、发展、侵袭与转移[2,7,8,9]。我们的前期研究也证实,FAK在口腔癌中高表达,与MMP2表达正相关,主要表达于口腔癌生长前沿区细胞及转移灶癌细胞,与颈淋巴结转移密切相关[2]。
本实验成功构建并筛选出能特异性干扰Tca8113细胞中FAK的siRNA,并建立FAK基因沉默后的Tca8113稳定细胞株,为系统观察口腔癌细胞的失巢凋亡效应,及进一步运用FAK 分子抑制手段治疗口腔癌奠定理论和技术基础。
摘要：目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用。方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Western-blot鉴定FAK的沉默效应。结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;pSi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制。结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达。
关键词：黏着斑激酶,舌癌细胞,RNA干扰
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靶向载体 第5篇
1 材料与方法
1.1 材料
肝癌细胞株和感受态大肠杆菌DH5α由南华大学附属第一医院临床研究所保存;逆转录病毒载体及重组质粒转录病毒载体psuper.retro.neo及psuper.retro.neo-VEGF-siRNA重组质粒由南华大学附属第一医院临床研究所保存和构建[1,6];逆转录试剂盒、Trizol购自上海生物工程有限公司;兔抗人VEGF多克隆抗体购自天津灏洋;HRP标记羊抗兔抗体购自美国Santa Cruz公司;BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 psuper.retro.neo-VEGF-si RNA、psuper.retro.neo转染细胞及阳性细胞筛选
HepG2细胞培养至对数生长期,用胰酶消化并调节细胞浓度以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板,1 m L/孔,培养过夜。按试剂盒说明书用Lipofectamine 2000将psuper.retro.neo-VEGF-siRNA和psuper.retro.neo转染HepG2细胞。G418筛选1周,得到上述稳定转染细胞克隆。分为实验组(HepG2/psuper.retro.neo-VEGF-siRNA组)、对照组(HepG2/psuper.retro.neo组)及空白组(HepG2组)。
1.2.2 裸鼠移植瘤的复制
BALB/c裸鼠18只,雄性,4～6周,体质量18～20 g,随机分3组,每组6只。将各组对数生长期细胞(细胞浓度为5×107个/m L)0.2 m L,用一次性1 m L无菌注射器接种到裸鼠前肢的背部皮下,形成直径约3 mm左右的皮丘。
1.2.3肿瘤生长曲线测绘
种植完成后,待肿瘤出现后,用游标卡尺测量并记录各组裸鼠的肿瘤体积(V)变化(每5天记录1次),V=a(长径)×b2(短径)/2,以每组动物移植瘤体积的平均值来绘制移植瘤生长曲线。于接种细胞后20 d脱颈椎法处死荷瘤裸鼠,完整剥离肿瘤,电子天平称量移植瘤重量,计算瘤重抑瘤率:瘤重抑瘤率=(1-实验组瘤重/对照组瘤重)×100%。每组每个标本取部分移植瘤组织固定于10%的中性福尔马林中,HE染色行病理学检测证实为裸鼠移植瘤;其余均-80℃超低温冰箱保存。
1.2.4 Western
blotting检测肿瘤组织中的VEGF表达每组称取约20 mg新鲜瘤组织,提取总蛋白。进行SDS-聚丙烯酞胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,电转移发将蛋白转移到PVDF膜上,兔抗人VEGF多克隆抗体为一抗,HRP标记羊抗兔抗体为二抗。以β-actin为内参照,观察VEGF蛋白表达变化,Mias图像分析系统测定各条带灰度值,以同一管中VEGF和β-actin条带积分光密度值之比作为VEGF蛋白的表达,并计算抑制率(Rv),抑制率=(对照组Rv-实验组Rv)/对照组Rv×100%。
1.2.5 免疫组织化学SP法检测瘤组织微血管密度(MVD)
按免疫组织化学试剂盒说明书操作,参照WEIDNER等[2,7]的方法:以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为阳性标准;微血管计数:以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为一条血管计数,只要结构不相连,其分支结构也计作一条血管计数,肿瘤内硬化区及与肿瘤交界处软组织内的微血管,有厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的血管除外。观察方法,先在低倍(×40)下观察切片,选择微血管分布最高密度区;然后在高倍(×200,每个视野面积为0.785 mm2)下计数3个视野的微血管数,取其平均值为该例的MVD值。
1.3 统计学方法
所有资料采用SPSS 13.0统计软件进行分析处理,所得到的数值以均数±标准差(x±s)表示,两两比较采用t检验进行假设检验,检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠模型的潜伏期
所有裸鼠经接种后,均先后成瘤,成瘤率100%,无自然死亡,3组裸鼠成瘤潜伏期见表1。
2.2 荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线
对照组第3天左右接种部位开始出现扁平结节,并逐渐长大;而实验组裸鼠皮下移植瘤的生长明显慢于对照组和空白组,见图1。
2.3 裸鼠移植瘤的瘤重及抑制率
接种细胞20 d后完整切除移植瘤,3组裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率见表2。
2.4 Western blotting检测各组移植瘤组织中
注:1)与空白组比较,P>0.05;2)与对照组、空白组比较,P<0.05
注:1)与空白组比较,P>0.05;2)与对照组、空白组比较,P<0.05
VEGF的表达
3组肿瘤组织Western blotting检测,内参照β-actin为均一显影的条带,VEGF显影条带密度不同,其中实验组瘤组织VEGF表达量低于对照组、空白组(P<0.05),其蛋白表达量为对照组的37.9%和空白组的35.6%,抑制率为对照组的62.2%和空白组的63.4%。见图2及表3。
2.5 免疫组织化学SP法检测实验各组瘤组织微血管密度
参照WEIDNER等[7]方法以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为阳性标准,在高倍(×200,每个视野面积为0.785 mm2)下观察视野中的微血管数。实验组中组织微血管数量较空白组及对照组减少,空白组和对照组无明显差别。见图3～5。
注:1)与空白组比较,P>0.05;2)与对照组、空白组比较,P<0.05
2.6 3组肿瘤组织内的微血管密度(MVD)记数
见表4。
注:1)与空白组比较,P>0.05;2)与对照组、空白组比较,P<0.05
3 讨论
肝癌为临床常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,侵袭性强,发展迅速,易复发和转移,传统治疗疗效不甚理想。近年来,随着分子生物学、基因组和蛋白组学的迅速发展,肝癌的基因靶向治疗已成为肝癌治疗最热门的研究方向,肿瘤的生长代谢、浸润转移和复发均与肿瘤血管的形成密切相关。VEGF作为一种促进血管渗透性增高和血管内皮细胞生长的主要因子,在原发性肝癌组织和血清中均有高表达[3,4,8,9],因而已成为肝癌基因治疗的重要靶点。
以VEGF为靶基因,运用RNAi技术,在宫颈癌[5,10]、乳腺癌[6,11]、卵巢癌等[12]方面进行的研究证实,RNAi技术能下调VEGF基因表达,抑制肿瘤细胞的增殖。本实验前期研究构建VEGF si RNA表达载体,经脂质体介导VEGF si RNA转染细胞,RT-PCR及Western blotting检测VEGF si RNA表达载体转染细胞中VEGF基因的表达,发现转染VEGF si RNA表达载体的细胞VEGF表达下调。证实VEGF si RNA表达载体在体外能有效抑制VEGF基因表达[1,6]。
新生血管的形成不仅是原位肿瘤生长所必需的,也是肿瘤转移灶形成的前提,肿瘤组织的MVD测定是反应肿瘤血管形成的一项有效方法,并可作为预后的独立指标。本研究为进一步证实该表达载体在体内成瘤的抑制作用,将VEGF si RNA表达载体转染至肝癌细胞中,然后行裸鼠皮下注射,通过计算肿瘤的成瘤时间及肿瘤生长曲线、瘤重和抑瘤率。通过Western blotting检测瘤组织的VEGF蛋白表达和免疫组织化学检测MVD值,发现实验组移植瘤的生长受到明显抑制,与空白组和对照组相比生长速度明显减缓,且瘤体积、重量明显要小,瘤组织VEGF蛋白和MVD值亦明显低于对照组和空白组,表明VEGF si RNA可特异降解VEGF m RNA,从而降低VEGF蛋白的表达水平,抑制肿瘤血管的生成,最终抑制肿瘤的生长。部分研究直接将si RNA注射至荷瘤裸鼠瘤体内,也发现能显著抑制m RNA和蛋白表达,表明VEGF si RNA具有肿瘤治疗价值。目前未见研究表明si RNA本身存在生理毒副作用,如果能解决其在体内有较高的转染效率和良好的给药途径,它可能成为肿瘤血管基因治疗药物。
参考文献
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靶向载体 第6篇
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集自2009年1月至2011年12月我院入院病例, 均符合如下标准: (1) 诊断符合1995年中华医学会全国第四届脑血管病学术会议修订的脑梗死诊断标准[1]; (2) 经头颅CT或证实为急性脑梗死; (3) 发病在48h以内; (4) 无出血史或出血性倾向史、消化道溃疡及血液系统疾病; (5) 无严重的心、肝、肾功能障碍。将符合以上条件的80名住院患者随机分为治疗组40例, 其中男性28例, 女性12例, 年龄在45～78岁, 平均年龄64.8岁;对照组40例, 其中男性26例, 女性14例, 年龄在48～76岁, 平均年龄66.7岁。两组患者在性别、年龄、病残程度、并发症等方面经统计学处理差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
两组病例均按照《中国脑血管疾病防治指南》[2]进行基础常规治疗, 包括控制血压、颅内压、血糖、血脂、维持水电解质平衡、抗血小板聚集等。治疗组在常规治疗基础上还给予Lipo PGE1 2mL/10μg加入10mL生理盐水缓慢静注, 每日1次;依达拉奉30mg加入100mL生理盐水稀释后静脉滴注, 30min内滴完, 每日2次, 连用14d。并同时监测血常规、尿常规、血小板计数、凝血四项、血脂、血糖、肝肾功能、心电图等。
1.3 疗效评定标准
依据1995年中华医学会第四次全国脑血管病制定的脑梗死临床神经功能缺损评分 (NDS) 和日常生活能力评分 (ADL) 标准。基本痊愈:功能缺损评分减少91%～100%;显著进步:功能缺损评分减少46%～90%;进步:功能缺损评分减少18%～45%;无变化:功能缺损评分减少低于18%。基本痊愈、显著进步、进步三项合计为总有效率。比较治疗2周后两组的临床疗效及治疗前后两组的NDS和ADL。
1.4 统计学方法
计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
两组治疗后均用不同程度好转, 治疗组总有效率为95.0%显著高于对照组的75.0%, 差异有统计学意义, P<0.05, 见表1。治疗组与对照组神经功能缺损评分较治疗前明显改善, 治疗组改善程度明显优于对照组, P<0.05, 见表2。两组均未发现明显不良反应。
3 讨论
脑梗死是由于脑动脉粥样硬化, 血管内膜损伤使脑动脉管腔狭窄, 进而因多种因素使局部血栓形成, 使动脉狭窄加重或完全闭塞, 导致脑组织缺血、缺氧、坏死, 引起神经功能障碍的一种脑血管病。脑细胞产生大量的自由基, 损伤细胞器和质膜, 离子调节受损, 引起线粒衰竭而导致细胞死亡。所以清除自由基, 切断自由基连锁反应是治疗脑梗死的主要环节[3]。
依达拉奉是一种新型的自由基清除剂, 临床研究提示N-乙酰门冬氨酸 (NAA) 是特异性的存活神经细胞的标志, 脑梗死发病初期含量急剧减少。依达拉奉用于脑梗死急性期, 可抑制梗塞周围局部血流量减少, 使发病后第28天脑中NAA含量较甘油对照组明显升高。依达拉奉可清除缺血半暗带组织中产生羟自由基, 抑制脂质过氧化, 从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞氧化损伤。并且能够通过抑制前列环素合成降低白三烯的数量, 抑制脑水肿形成, 抑制神经血管痉挛。另一方面依达拉奉还可以通过抗细胞程序性死亡的作用来保护缺血缺氧的神经细胞。并能降低急性脑梗死患者血清C反应蛋白水平, 减轻炎症介质释放, 从而起到脑保护作用[4]。
前列地尔是一种高生物活性物质, 属于天然前列腺素类 (Prostaglandin E1, PGE1) 。大多数细胞都具有合成的能力, 在局部发挥作用后迅速失活。其具有广泛的生理药理作用, 包括能够明显的扩张血管、抑制血小板聚集、促进红细胞变形和较好的细胞保护作用等从而改善血流变指标、改善微循环、抗氧化、抗纤维化和拮抗钙离子内流。Lipo PGE1是第三代前列地尔制剂, 是将前列腺素E1包裹在0.2μg脂微球内。该制剂具有的独特特点[5]: (1) 较高的靶向性:易于在病变部位聚集, 扩张颅内痉挛血管, 增加侧支循环, 改善脑梗死半暗区的局部供血, 从而防止“盗血”现象; (2) 作用持久:在脂微球的屏障保护下, 前列腺素E1在肺部的灭活明显减少; (3) 高效性:仅需传统制剂给药量的1/10就可达到治疗效果; (4) 不良反应发生率低:在脂微球的屏障保护下, 前列腺素E1对血管的刺激和炎症反应明显减少。
观察发现依达拉奉与前列地尔脂微球载体靶向制剂联合治疗急性脑梗死治疗组中, 总有效率95.0%显著高于对照组 (75.0%) , 并能有效减少急性脑梗死的神经功能缺损及提高日常生活能力, 且未发现严重的不良反应。综上所述, 二者联合治疗急性脑梗死具有协同作用, 效果明显, 且安全性好。
摘要：目的 探讨依达拉奉与前列地尔脂微球载体靶向制剂联合治疗急性脑梗死的临床疗效。方法 选择80例急性脑梗死患者随机分为治疗组 (40例) 和对照组 (40例) , 治疗组在常规治疗的基础上给予依达拉奉和前列地尔脂微球载体靶向制剂。结果 观察两组治疗后临床疗效, 治疗组总有效率95.0%显著优于对照组 (75.0%) 。结论 依达拉奉与前列地尔脂微球载体靶向制剂联合治疗急性脑梗死安全、有效。
关键词：依达拉奉,前列地尔脂微球载体靶向制剂,脑梗死
参考文献
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