因子效应范文（精选4篇）

因子效应 第1篇

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为日光温室内五年生篱棚架栽培的矢富罗莎 (Vitis vinifera L.Shifuluosha) 早熟葡萄品种, 株距70 cm。

1.2 试验设计

试验于2009年在枣庄市水泉镇下辛庄村进行。水肥条件较好, 设4个处理, 处理1:从升温 (12月20日) 起至花后 (4月1日) 在架下铺设厚0.02 mm的地膜 (白色透明) ;处理2:花后铺聚酯镀铝反光膜 (铝膜) 至果实采收;处理3:4月1日前铺设地膜, 花后改铺铝膜;以不覆膜的裸地作为对照 (CK) 。选生长势基本一致的植株作为观察对象 (离地面20cm处干周长为13~14 cm, 每株留新梢数45个, 果穗数15个, 平均每穗留果约100粒) , 每处理选5株。

1.3 调查项目与测定方法

土温用地温表测定;叶面积和果实大小用回归方程法分析;光强用便携式光合仪 (BAU) 测定;可溶性糖含量用蒽酮比色法测定;可滴定酸含量用滴定法测定;花青苷含量采用吴三桥的方法测定, 以苋菜红为标准换算成质量比含量[3,4,5,6]。

2 结果与分析

2.1 覆膜对土壤温度的影响

从表1可以看出, 覆盖地膜比CK平均地温有所提高。从8:00的调查结果看, 5 cm地温覆盖地膜比CK平均高2.8℃, 而15、20 cm处提高1.9、1.8℃, 这说明覆盖地膜对土壤浅层的增温效果更好。从一天中温度的变化来看, 覆膜处理较CK缓和, 这为根系的生长提供了更好的温度条件。

(℃)

注:统计时间为12月下旬至3月下旬, 每5 d测量1次。

2.2 覆膜对温室内气温的影响

从表2可以看出, 覆盖地膜可以提高温室内大气的温度, 一般可提高2℃左右。

(℃)

注:数据为晴朗天气的测量值。

2.3 覆膜对叶幕下方光强的影响

从表3可以看出, 地膜和铝膜的反射率都高于裸地, 其中铝膜的反射率高达61.2%, 因此相对于同期CK都增加了叶幕下方可见光的光强。虽然随着节气的推移, 进入温室的光强增加, 但由于葡萄枝叶量的增加, 裸地叶幕下方的光照反而恶化, 而铺设铝膜后可以有效地改善这种状况, 相对于对照可提高光照强度43.2%, 使叶幕下方的光强保持较高的水平。

注:太阳透过棚膜的照射光强2月10日为404 u/ (Em2s) , 5月10日为897 u/ (Em2s) 。

2.4 覆膜对葡萄营养生长的影响

于花前对矢富罗莎葡萄营养生长状况进行调查, 从表4可以看出, 覆盖地膜处理的新梢长度和节间长均显著高于CK, 而粗度和节数却没有显著的变化, 这说明新梢长度的变化主要是由节间长度的变化引起的。

从表5可以看出, 在花前, 矢富罗莎葡萄品种覆膜处理下的叶面积和叶干重均显著高于CK, 比叶重虽有所增加, 但增加不明显。综合表4、5可以看出, 覆盖地膜处理各指标均高于CK, 这说明覆盖地膜可有效提高植株的营养生长量。

注:同列不同字母表示差异性显著 (P=0.05) , 相同字母表示无显著差异, 下表同。

2.5 覆膜对葡萄浆果品质的影响

从表6可以看出, 矢富罗莎在浆果成熟时, 处理2、3浆果可溶性糖含量和花青苷含量均明显高于处理1和CK, 而浆果鲜重和可滴定酸含量却与处理1、CK差异不显著。

3 结论与讨论

(1) 覆盖地膜处理较裸地不仅提高温室内的温度, 而且还提高环境中的光照强度, 由此提高植株的生长量, 说明在矢富罗莎生长前期, 温室内的温度和光照普遍不能满足其生长需要。因此, 铺设地膜对葡萄前期的营养生长具有良好的效果。

(2) 花后铺设铝膜使温室内的光照度提高43.2%, 从而提高浆果中可溶性糖含量及果皮中花青苷的含量。

(3) 后期铺设铝膜结合前期覆盖地膜不仅使浆果的可溶性糖含量以及花青苷含量有一定的提高, 且较仅在后期铺设铝膜的处理营养生长好, 为当年的花芽分化和来年的丰产打下良好的基础, 在生产上可以推广应用。

摘要：系统研究铺设农用地膜和反光膜对温室内的温度、光强以及葡萄的枝叶和浆果品质的影响, 结果表明:覆盖地膜明显提高室内温度和光照强度, 也提高植株生长量;铺设铝膜使温室内光照强度提高43.2%;地膜结合铝膜在果实品质方面有一定改善, 可在生产上推广应用。

关键词：葡萄,覆膜,日光温室,环境因子,生长结实

参考文献

[1]李宪利, 高东生, 夏宁.果树设施栽培的原理与技术研究[J].山东农业大学学报:自然科学版, 1996, 27 (2) :227-232.

[2]赵玉国.温室葡萄花芽分化不良的原因及对策[J].烟台果树, 1997 (4) :34.

[3]刘林.不同反光膜有利于设施葡萄果实糖分代谢与品质提高[J].山西果树, 2009 (1) :54.

[4]李帅.覆膜对温室环境因子和葡萄生长结实的效果[D].济南:山东农业大学, 2006.

[5]蒋军新.葡萄幼树防寒越冬覆膜技术措施[J].巴州科技, 2005 (4) :13-14.

因子效应 第2篇

关键词：城市公园；绿地；冷岛效应；温湿度；广州

收稿日期：2011-11-15

修回日期：2012-05-29

前言

城市空间热环境在全球增温过程中扮演重要角色，对城市小气候、空气质量以及公众健康等产生深远影响[1]，因此热岛效应已成为科学界、管理者以至民众广泛关注的焦点。改革开放以来，以广州为中心的珠江三角洲地区经济发展迅猛，形成了一个珠三角城市群，随着城市化进程加快的同时，珠三角的热岛效应将日益突出[2]。研究表明[3～7]城市绿地是缓解城市热岛效应的有效因素，而公园绿地是缓解城市热岛效应的主力军，可称为城市热岛中的“冷岛”。刘万军[8]在沈阳大气容量研究基础上，提出了城市“冷岛”效应的概念。杨柯和谢玲[9]阐述了公园“冷岛”效应的成因，以及国内外研究“冷岛效应在”的现状及方法。

现有研究或者通过城市和郊区的多年气象资料来分析城市热环境动态，如史欣等[10]对广州郊区帽峰山森林公园的“冷岛”效应进行比较研究，或通过遥感航片分析热岛分布格局，或通过人工定点观测比较城区和郊区的温湿度差异。针对市区以人工建设为主的公园进行“冷岛”效应的研究有鲍淳松等[11]对杭州市植物园“冷岛效应”的研究。本文以广州市区以人为建设为主的公园为研究对象，通过定点连续记录公园温湿度与周边的差异性阐明“冷岛”效应及影响公园“冷岛”效应的因子，以期为今后定量研究城市绿地的“冷岛”效应提供参考。

1 研究样地概况

广州市位于北纬22°26′～23°56′、东经112°57′～114°03′，东接惠州市博罗、龙门两县，西邻佛山市的三水、南海和顺德市，北枕清远市和佛冈县及韶关市的新丰县，南连东莞市和中山市，属亚热带海洋季风气候，年均气温21.4℃～21.9℃，最高温（7月）可达38.7℃，最低温（1月）曾为-2.6℃（1963年）。年降雨量1612～1909 mm， 4～9月的降雨量占全年降雨量的85%左右。

本研究选择了位于广州市西部的雕塑公园、流花湖公园和位于广州市东部的天河公园和珠江公园作为样地进行研究。雕塑公园占地46.3 hm2，水体面积0.4 hm2，植被覆盖率95.0%，邻近白云山自然风景区。流花湖公园占地54.4 hm2，水体面积32.7 hm2，植被覆盖率88.0%。天河公园占地70.7 hm2，水体面积10.0 hm2，植被覆盖率85.0%。珠江公园，毗邻珠江，占地28.0 hm2，水体面积0.7 hm2，植被覆盖率93.2%。

2 仪器和研究方法

利用美国Oneset计算机公司生产的HOBO Pro系列温湿度记录仪（温度测量精度±0.2℃，湿度精度±3%），在每个公园的中心点和四周分别设置5个离地面1.3 m 的监测点、每个公园外围空旷的硬质水泥地设置空白对照点，每1 h整点记录一次数据温湿度（记录测量时间从2008年9月1号08：00点至9月30号23：00点）。其中，△T（℃）=空白对照点温度-5个公园样点平均温度；△RH（%）=5个公园样点平均相对湿度-空白对照点相对湿度。

对选择样地每个公园乔木密度、乔木平均树高、乔木平均胸径数据为实地设置样方调查所获得，调查方法参照朱纯等[12]。

实验数据以平均值±标准差表示，相关分析与主成分分析在STATISTICA 10.0统计软件中完成。

3 试验结果

3.1 公园“冷岛”效应

图1所示为4个公园的冷岛效应。相对于各自空白对照的水泥地，雕塑公园平均气温降低4.38±2.76℃，天河公园降低4.41±2.68℃，流花湖公园降低4.45±2.16℃，珠江公园降低4.80±2.98℃；雕塑公园平均相对湿度比之升高4.82±22.88%，天河公园升高26.17±13.39%，流花湖公园升高30.23±11.95%，珠江公园升高30.82±16.07%。可见在9月，相对于硬质水泥地，四个公园气温降低均值为4.38～4.80℃，除雕塑公园外，相对空气湿度增加较多，每个公园绿地的“冷岛”效应都较为明显。

3.2 公园“冷岛”效应日夜特征

为探讨公园“冷岛”效应的日夜特征，本文选择日间（11：00-15：00）和夜间（21：00-1：00）数据进行分析。其中，流花湖公园日间的“冷岛”效应最为明显，降低气温均值为10.32±2.13℃，增加相对湿度均值为41.82±11.58%，而其夜间的“冷岛”效应最不明显，降低气温均值为1.56±1.85℃，增加相对湿度均值为18.89±14.81%；天河公园日间降低气温均值为9.46±2.47℃，增加相对湿度均值为36.11±12.52%，夜间降低气温均值为1.86±2.13℃，增加相对湿度均值为12.5±14.81%；雕塑公园日间降低气温均值为8.94±2.49℃，增加相对湿度为1.56±17.69%，夜间降低气温均值为2.38±1.68℃，增加相对湿度为9.29±23.98%；珠江公园白天降低气温均值为8.60±2.95℃，增加相对湿度为35.34±17.66%，夜间降低气温均值为2.92±1.55℃，增加相对湿度为26.06±11.65%。结合图1、2、3结果可见，水体面积最大的流花湖公园日间降温增湿的效果最大，水体面积最小的雕塑公园和珠江公园日间降温增湿的效果最小，夜间则相反。不同公园整个九月的降温增湿虽然没有显著性差异，但是珠江公园降温增湿的效果最大，流花湖次之，雕塑公园最小。不同公园月、日间、夜间降温增湿大小规律的不一致说明影响公园“冷岛”效应的因子较复杂。

3.3 公园“冷岛”效应的相关因子

公园月、日间、夜间降低气温均值和增加相对湿度均值与公园面积、水体面积、乔木密度、乔木平均树高、乔木平均胸径的相关性如表1所示。除日间降低气温均值与水体面积呈显著相关（p<0.05），夜间增加相对湿度均值与乔木平均树高呈显著相关（p<0.05），月降低气温均值与乔木密度呈极显著相关（p<0.01）外，其他因子之间不存在显著的相关性，但两者之间的相关系数较大（如日间降低气温均值与乔木平均胸径的相关系数为0.906），为进一步探讨公园“冷岛”效应与一些环境因子之间的相关性，本研究采用多元统计方法分析公园“冷岛”效应与环境因子的真实关系。

3.4 公园“冷岛”效应主成分分析

公园月、日间、夜间降低气温均值和增加相对湿度均值与公园面积、水体面积、乔木密度、乔木平均树高、乔木平均胸径等11个因子进行主成分分析，其结果如图4所示。其中第一主成分和第二主成分轴分别解释了48.51%、44.88%的变量，累积贡献率达93.39%，可以反映了绝大部分的信息，结果理想。其中，日间降低气温均值与公园面积、水体面积和乔木平均胸径呈正相关；月降低气温均值与乔木密度呈正相关；月、日间、夜间增加相对湿度与乔木平均树高、乔木平均胸径、水体面积呈正相关。

4 结论与讨论

4.1 四个公园的“冷岛”效应明显

研究结果显示，公园降温增湿的效果较为明显，呈“冷岛”效应。日间，公园降低气温均值呈现流花湖公园（10.32±2.13℃）>天河公园（9.46±2.47℃）>雕塑公园（8.94±2.49℃）>珠江公园（8.60±2.95℃），而其降低气温值与公园面积、水体面积和乔木平均胸径呈正相关；夜间则相反。此研究结果与Saaroni等“在城市热岛的空间分布和小尺度的特征”一文中的结论[4]相同。公园绿地应该尽量满足城市居民在生活功能上对公园绿地的需求，本研究较为精确的量化数据可为城市公园的分布规划、公园内部绿地系统的布局和乔木种植规划提供参考。但是，在特定范围的城市化环境条件下，具体配套公园的用地布局、绿地系统结构等方面还需要进一步深入研究。

4.2公园水体对“冷岛”效应的真实影响

选择样地研究的结果显示日间公园的降温值与公园面积、水体面积和乔木平均胸径呈正相关，夜间则相反，这跟公园的水体布局和面积有关。一般而言，公园水体夜间起保温作用，日间则为降温作用，从而使得水体面积最少的珠江公园和雕塑公园日间的降温值显著小于流花湖公园和天河公园，但夜间时则降温值大于后者，珠江公园（4.80±2.98℃）整个九月的降温均值大于流花湖公园（4.45±2.16℃）。此研究结论类似于鲍淳松等[11]认为“西湖具有一定的气温调节功能，增强了杭州植物园白天的冷岛效应”。水体面积大的公园虽然在白天呈现的“冷岛”效应显著，但夜间释放热量，水体的“冷岛”作用不甚明显。随着城市空间发展和人口密度等因子的变化，如何规划城市公园水体面积，使公园的“冷岛”效益达到最大可以作为进一步研究的课题。

4.3公园“冷岛”效应比较结果

将东西部的2个公园单独比较得出，绿地面积大的公园日间降温增湿效果比较明显，东部的天河公园日间降温均值为9.46℃、增湿均值为36.11%，明显高于面积小的珠江公园；西部的流花湖公园日间降温均值为10.32℃、增湿均值为41.82%，也明显高于面积小的雕塑公园。完全符合“绿化覆盖率高的地区，温度比周围低”的“冷岛”效应常规定义。从4个公园的“冷岛效应”看，天河公园面积最大，为绿化覆盖率最高的区域，似乎其“冷岛”效应应该最明显，但研究显示其白天气温降低均值为9.46℃、增湿均值为36.11%，位于面积第二的流花湖公园之后。而流花湖公园的水体面积最大，表明“冷岛”效应的形成不但与绿地面积相联系，还与水体大小等因素有关。

参考文献

[1] Emmanuel R. Thermal comfort implications of urbanization in a warm-humid city：the Colombo Metropolitan Region （CMR）， Sri Lanka[J]. Building and Environment， 2005， 40： 1591–1601

[2] 江学顶，夏北成，郭泺.广州城市热岛空间分布及时域_频域多尺度变化特征[J].应用生态学报，2007，18（1）：133-139

[3] Fisher J I， Mustard J F， Vadeboncoeur M A. Green leaf phenology at Landsat resolution： Scaling from the field to the satellite[J]. Remote Sensing of Environment， 2006， 100 ： 265-279

[4] Saaroni H， Ben-Dor E， Bitna A， et al. Spatial distribution and microscale characteristics of the urban heat island in Tel-Aviv， Israe[J]. Landscape and Urban Planning， 2000， 48： 1-18

[5] Takebayashi H， Moriyama M. Surface heat budget on green roof and high reflection roof for mitigation of urban heat island[J]. Building and Environment， 2007， 42：2971-2979

[6] Wong N H， Chen Y. Study of green areas and urban heat island in a tropical city[J]. Habitat International， 2005， 29： 547-558

[7] Wong N H， Jusuf S K， Win A A L， et al. Environmental study of the impact of greenery in an institutional campus in the tropics[J]. Building and Environment， 2007， 42： 2949-2970

[8] 刘万军.城市冷岛效应[J].辽宁气象，1991（3）：27-29，34

[9] 杨轲，谢玲，公园冷岛效应的研究现状[J].2010（13）：85

[10] 史欣，吴统贵，徐大平，等，广州帽峰山森林公园‘冷岛效应’分析[J].中国城市林业，2005，3（3）：46-48

[11] 鲍淳松等，杭州植物园的“冷岛效应”[J].浙江林业科技，2001，21（5）：56-58

影响切梗水分值效应因子的通径分析 第3篇

切梗水分值影响着切梗丝的质量, 进而影响着梗丝膨化效果和成品梗丝的质量, 因此在梗丝加工中必须重视切梗水分值。本文对影响切梗水分值的室内温度、室内湿度、刮板回潮出口温度、刮板回潮出口湿度进行通径分析, 以了解它们对切梗水分值的影响程度。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1) 烟梗:汉中卷烟厂A牌号烟梗。

2) GDT15C型号贮梗柜 (秦皇岛烟草机械有限责任公司) , WQ58A型号刮板烟梗回潮机 (秦皇岛烟草机械有限责任公司) , TM710型号水分温度在线测量仪 (NDC红外技术公司) 。

1.2 试验方法

数据正态验证。通过现场调查, 随机采集室内温度、室内湿度、刮板回潮出口温度值、刮板回潮出口水分值、切梗烟梗水分数据, 并对切梗水分值实施正态验证。

本文中n=20属于小样本, Shapiro-Wilk显著水平Sig.=0.272>0.05, 所以切梗水分值服从正态分布, 可以进行回归分析。试验采用SPSS软件进行统计分析。

2 结果分析

2.1 各效应因子与切梗水分值多元回归方差分析

各效应因子总体与切梗水分有极显著的回归关系 (F=36.034>F0.01=4.89) 。对数据进行逐步回归分析以了解各个效应因子是否都对因变量切梗水分有显著回归关系。

2.2 最优线性回归方程的建立

1) Pre dictors: (Cons tant) , 刮板回潮出口湿度。

2) Pre dictors: (Cons tant) , 刮板回潮出口湿度, 刮板回潮出口温度。

在进行多元线性回归分析时, 利用逐步回归分析剔除没有显著效应的自变量。由通径系数 (Standardized Coefficients) 可以看出刮板回潮出口湿度、刮板回潮出口温度对Y的直接作用分别是:P1y=0.827、P2y=-0.351。显著性检验结果表明, 刮板回潮出口湿度、刮板回潮出口温度的偏回归系数的显著性均小于0.05, 说明自变量与因变量之间存在显著性差异。因此, 最优线性回归方程如下:

式中X1为刮板回潮出口湿度 (%) , X2为刮板回潮出口温度 (℃) 。

2.3 各效应因子与切梗水分值的通径分析

从表4的Pearson Correlation输出结果可得到自变量与因变量、各自变量间的相关系数。由通径分析的理论可以算出简单相关系数、通径系数及间接通径系数的关系, 如表5。

由表5可知, 显著效应因子中刮板回潮出口湿度X1对切梗水分值的影响最大, 直接作用影响显著。刮板回潮出口温度X2对切梗水分值的产生间接影响比X1大, 但是由于P1y值较大, 从而使刮板回潮出口湿度X1对Y的影响较大, 二者的简单相关系数达到了0.879。因此, 刮板回潮出口湿度X1对切梗水分值Y具有重要作用。

3 结论

本文经通径分析后发现, 刮板回潮出口湿度和温度对切梗水分值有显著影响, 其中刮板回潮出口湿度对切梗水分值的直接作用影响最大, 因此可以通过合理调整刮板回潮设备控制参数来调控切梗水分值, 并为成品梗丝的质量提供了及时可靠的信息保障。

参考文献

[1]陈良元.卷烟生产工艺技术[M].河南科学技术出版社, 2002.

因子效应 第4篇

TLRs是一类天然免疫受体家族, 在机体的固有免疫反应中起重要作用。TLRs是一种模式识别受体, 能够识别不同的损伤相关分子模型 (damage-associated molecular patterns, DAMPs) 和病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) [5]。在肿瘤的发生发展过程中, 伴随肿瘤细胞的凋亡、坏死及胞吐 (exocytosis) , 有大量的DAMPs和PAMPs释放。越来越多的证据表明, TLRs通过识别肿瘤组织中的DAMPs和PAMPs参与包括肝癌在内的多种炎症相关肿瘤的发生和发展[6]。近年来在肝癌组织中TLRs的表达情况受到关注, 现有研究已经证实肝癌组织中TLR2和TLR4均有表达, 并且影响肝癌细胞的增殖等生物学行为[7]。但是, 目前关于TLRs在癌旁组织中的表达情况结论并不一致, TLRs表达与不同增殖相关蛋白表达的关系亦无定论[8]。

由于TLRs及其下游信号转导通路在炎症免疫、肿瘤免疫及肿瘤发生发展过程中发挥的重要作用已经成为治疗的潜在靶点。但新的治疗策略必须建立在对TLRs作用机制更清晰地揭示和更深入地理解的基础之上, 因此关于TLRs在肿瘤发生发展过程中的作用成为研究的热点。本实验通过免疫组化检测TLR2和TLR4蛋白在肝癌组织及癌旁组织中的表达, 并采用Western-blot与Real-time RT-PCR实验方法检测正常肝组织和肝癌组织中TLR2、TLR4和Cyclin D1、p70s6k等增殖相关因子蛋白及m RNA的表达, 以探讨TLR2、TLR4与各增殖相关因子在肝癌组织中表达的相关性, 并结合其表达与临床病理参数之间的关系, 初步探讨TLR2和TLR4在肝癌组织中表达的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及来源

鼠抗人TLR2多克隆抗体和鼠抗人TLR4多克隆抗体购于Abcam公司, 鼠抗人p70s6k多克隆抗体购于Cell signaling公司。兔抗人Cyclin D1多克隆抗体和鼠抗人Ki67单克隆抗体购于北京中杉生物技术有限公司。鼠抗人多克隆GAPDH抗体购于Sigma公司。HRP标记的羊抗鼠Ig G和HRP标记的羊抗兔Ig G购于武汉博士德生物有限公司。免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。PCR引物、DNA分子量标准和Real-time RT-PCR试剂盒购于大连宝生物公司。其他试剂如二甲苯、乙醇等化学试剂购自国药集团。显微镜购自Lesia。

1.2 标本及临床资料

收集中国医科大学附属盛京医院2008年3月-2010年9月手术切除102例肝癌标本。所有标本均经病理确诊为肝细胞癌, 术前均未进行化疗和放疗治疗。其中男性59例, 女性43例, 年龄在39~79岁之间, 平均55岁。组织学分化分级:高分化例43, 中分化例41例, 低分化18例。淋巴结转移35例, 未转移67例。按国际抗癌联盟 (UICC) 分期标准进行分期, I期+II期66例, III期+IV期36例。肝癌标本均为乙型肝炎病毒阳性, 同时取材癌旁组织标本 (距离肿瘤>2 cm) 作为炎症组织对照。102例肝癌病例均有完整的随访资料, 无复发生存时间的计算从手术日期到发现复发和转移的日期或随访日期 (2012年9月) 。术后半年内每3个月、半年后每6个月复查1次AFP、B超或CT。收集同期肝血管瘤瘤旁肝组织 (距离肿瘤>1 cm) 标本17例作为正常肝组织对照, 均无肝炎和肝硬化。102例肝癌组织标本手术取材后经甲醛固定, 常规脱水、包埋, 以供免疫组化分析。其中, 60例肝癌组织标本和17例肝血管瘤组织标本具备手术时立即取材的新鲜冰冻组织标本, 置液氮冷却后送-70℃冷冻冰箱保存, 以供Western-blot与Real-time RT-PCR检测。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化分析

所有标本蜡块做4μm连续切片, 用二甲苯及乙醇脱蜡处理, PBS洗片后, 用羊血清工作液封闭30 min, 分别加入TLR2、TLR4和Ki67抗体37℃孵育45 min, 生物素标记的二抗37℃孵育40 min, PBS洗片后DAB显色, 苏木精复染, 组织透明, 树胶封片。每次检测均以0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。

SP法免疫组化染色及结果判定:阳性判断标准以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性, 评分标准采用综合评价法, 每张切片随机观察100个细胞。染色范围评分标准:无阳性细胞为0分, 0%~30%阳性细胞为1分, 31%~60%阳性细胞为2分, >60%阳性细胞为3分。染色强度评分标准:无染色为0分, 染色颗粒黄、细、成堆为1分, 染色颗粒深黄、粗、成片为2分, 染色颗粒棕黄、粗大、成片为3分。两个评分相加即为肿瘤细胞的免疫组化染色得分, 0~3分为低表达, 4~6分为高表达[9]。

组织病理学评估:所有的切片苏木精-伊红染色结果均有两位病理专家独立观察, 在不了解患者其他临床数据情况下, 评估不同抗体的表达情况以及肿瘤分化程度, 如二者出现不一致, 则由另一位病理专家再次观察得到最终结果。

1.3.2 免疫印迹实验 (Western blot)

取蛋白样品30μg~0.5 m L EP管内, 加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×, 混匀后于沸水中煮5 min使蛋白变性。取蛋白上样进行SDS-PAGE, 以内参GAPDH作为蛋白上样量标准品。配制10%分离胶及4%浓缩胶进行电泳。恒压100 V×120 min。电泳后湿转至PVDF膜, 恒压50 V×120 min。转膜结束后, 小心取出膜至干净的玻璃平皿内, 以TBST缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Na Cl和0.05%Tween-20) 洗5 min×3次, 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。弃去封闭液, TBST洗5 min×3次, 加入抗TLR2多克隆抗体 (1∶1 000, Abcam公司) 、抗TLR4多克隆抗体 (1∶2 000, Abcam公司) , 抗Cyclin D1多克隆抗体 (1∶1 000, 北京中杉生物有限公司) , 抗p70s6k多克隆抗体 (1∶1 000, Cell signaling公司) , 抗GAPDH多克隆抗体 (1∶2 000, Sigma公司) , 置4℃过夜。TBST摇床清洗5 min×5次, 最后加入HRP标记的相应二抗, 采用底物增强化学发光ECL法显色, 并利用软件Quantity One (BIO-RAD公司) 进行灰度分析。

1.3.3 Real-time RT-PCR

用Trizol试剂提取各组肝癌组织总RNA, 逆转录成c DNA第1链, 然后以c DNA为模板, 分别对TLR2基因、TLR4基因、Cyclin D1基因, p70s6k基因进行Real-time RT-PCR反应。反应体系为:c DNA 1μL, 20μmol/L的上下游引物各0.5μL, d NTP混合液3μL, Taq DNA聚合酶3 U, Mg Cl2溶液3μL, 10×PCR缓冲液2.5μL, SYBR Green I 6.25μL, 去离子水补至25μL。PCR扩增条件94℃变性5 min, 35个PCR循环 (94℃20 s;58℃20 s;72℃20 s) , 72℃延伸5min, 75℃时检测荧光信号, 绘制标准曲线。引物序列见表1。根据绘制的标准曲线得到TLR2基因、TLR4基因、Cyclin D1基因及p70s6k基因表达的相对浓度, 以目的基因与GAPDH相对浓度的比值来反映目的基因的表达量。每个样品做2个平行管, 实验重复3次。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析, 分别采用秩和检验、Spearson相关分析、Kaplan-Meier法生存分析和多因素Cox比例风险模型进行分析。P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

2.1.1 染色情况

图1所示, TLR2和TLR4蛋白阳性染色主要位于细胞膜, 细胞质亦有少量表达。Ki67蛋白阳性染色主要位于细胞核。所有肝癌组织标本均可见TLR2和TLR4表达, 其中TLR2蛋白高表达33例 (32.4%) , 低表达69例 (67.6%) ;TLR4蛋白高表达42例 (41.2%) , 低表达60例 (58.8%) ;Ki67蛋白高表达40例 (39.2%) , 低表达62例 (61.8%) 。癌旁组织中TLR2蛋白高表达13例 (12.7%) , 低表达89例 (87.3%) ;TLR4蛋白高表达9例 (8.8%) , 低表达93例 (91.2%) ;Ki67蛋白高表达14例 (13.8%) , 低表达88例 (86.3%) 。正常肝组织中TLR2和TLR4蛋白仅有极低量的表达。TLR2、TLR4和Ki67蛋白在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织和正常肝组织。

A~C: (DAB×200) TLR2、TLR4和Ki67蛋白在低分化肝癌组织中的表达;D:HE;E~G: (DAB×200) TLR2、TLR4和Ki67蛋白在高分化肝癌组织中的表达;H HE;I~K (DAB×200 TLR2、TLR4、Ki67蛋白在癌旁组织中的表达;L:HE;M~O: (DAB×200) TLR2、TLR4、Ki67蛋白在正常肝组织组织中的表达;P:HE

2.1.2 肝癌组织中TLR2和TLR4蛋白表达与临床病理参数的关系

从表2中可以看出, 肝癌组织中TLR2、Ki67蛋白的表达均与肝癌的分化程度呈正相关 (r=0.355, P<0.05;r=0.263, P<0.05) , 即低分化的肝癌组织中TLR2、Ki67蛋白的表达均高于高分化的肝癌组织。肝癌组织中TLR4蛋白的表达与肝癌的分化程度无关 (r=0.096, P=0.338) 。三者的表达均与肝癌患者年龄、性别和肿瘤大小等临床病理参数无关。

注:1) TLR2蛋白表达与TNM分期相关, r=2.263, P=0.008;2) TLR2蛋白表达与肿瘤分化程度相关, r=0.355, P=0.000;3) TLR2蛋白表达与Ki67蛋白表达相关, r=0.518, P=0.000

2.1.3 肝癌组织中TLR2、TLR4与Ki67表达的关系

肝癌组织中TLR2蛋白的表达与Ki67蛋白的表达呈正相关 (r=0.518, P<0.05) 。TLR4蛋白的表达与Ki67蛋白的表达无明显相关性 (r=0.019, P=0.847) 。此外, TLR2蛋白与TLR4蛋白的表达无明显相关性 (r=0.060, P=0.546) 。

2.1.4 预后分析

结合免疫组化结果和随访信息对影响肝癌预后的因素进行单因素和多因素分析。截止至随访结束, 102例患者术后无复发生存时间为6~36月, 无复发中位生存时间为26.3月。KA-PLAN-MEIER法生存分析结果见表3, TLR2蛋白高表达和低表达的患者术后无复发中位生存时间分别为20.4月和29.3月, 两组相比较差异显著 (Log rank:P<0.05) , 由患者的生存函数曲线可以看出, TLR2蛋白的表达与患者预后生存率相关性很高 (图2) 。Ki67蛋白高表达和低表达的患者术后平均无复发生存时间分别为23和28.6月, 两组相比较差异显著 (Log rank:P<0.05) 。而TLR4蛋白高表达与低表达患者之间, 比较术后平均无复发生存时间无显著性差异。在临床病例参数中, TNM分期 (P<0.05) 、肝癌分化程度 (P<0.05) 和有无淋巴结转移 (P<0.05) 对术后平均无复发生存时间均有明显影响。

将TLR2蛋白表达、Ki67蛋白表达、TNM分期、肝癌分化程度和有无淋巴结转移进行多因素Cox比例风险模型分析, 结果见表4, 从表中可见TLR2蛋白表达 (P<0.05) 、Ki67蛋白表达 (P<0.05) 、TNM分期 (P<0.05) 与预后明显相关。肝癌分化程度 (P=0.217) 和有无淋巴结转移 (P=0.286) 与预后无明显相关。

2.2 Western Blot与Real-time RT-PCR结果

2.2.1 表达情况

Western Blot结果:TLR2和TLR4蛋白表达情况与免疫组化结果相似, 所有肝癌组织和癌旁组织标本均有表达, 分别于95 k D和93 k D处出现单一条带, 正常组织中分别2例和3例有表达, 表达率分别为11.7%和17.6%。Cyclin D1蛋白在32例肝癌组织均于36 k D处出现单一条带, 表达率53.3%;癌旁组织中2例出现阳性条带, 表达率3.3%;正常肝组织中1例出现阳性条带, 表达率1.7%。p70s6k蛋白在47例肝癌组织均于70 k D处出现单一条带, 表达率78.3%;癌旁组织中39例出现阳性条带, 表达率65%;正常肝组织中3例出现阳性条带, 表达率17.6%。TLR2、TLR4、Cyclin D1和p70s6k蛋白在肝癌组织中的表达相对含量显著高于癌旁组织和正常肝组织 (P<0.05) (图3) 。

1:低分化肝癌组织;2:高分化肝癌组织;3:癌旁组织;4:正常肝组织;柱形图依次TLR2、TLR4、Cyclin D1、p70s6k

Real-time RT-PCR结果:TLR2和TLR4 m R-NA在所有肝癌组织和癌旁组织标本均有表达, 正常组织中分别2例和4例有表达, 表达率分别为11.7%和23.5%。Cyclin D1 m RNA在34例肝癌组织有表达, 表达率56.7%;癌旁组织中3例有表达, 表达率5%;正常肝组织中1例有表达, 表达率1.7%。p70s6k m RNA在49例肝癌组织有表达, 表达率81.7%;癌旁组织中41例有表达, 表达率68.3%;正常肝组织中5例有表达, 表达率29.4%。以正常肝脏组织平均表达量为参照, 肝癌组织中TLR2、TLR4、Cyclin D1与p70s6k m RNA相对表达量显著高于癌旁组织和正常肝组织 (P<0.05) (图4) 。

2.2.2 TLR2、TLR4与Cyclin D1、p70s6k表达的关系

相关分析结果显示, TLR2、TLR4蛋白表达与增殖相关因子Cyclin D1和p70s6k蛋白的表达显著相关 (r=0.285, P<0.05;r=0.313, P<0.05;r=0.469, P<0.05;r=0.584, P<0.05) ;同时TLR2与TLR4 m R-NA的表达与增殖相关因子Cyclin D1和p70s6k m RNA的表达也显著相关 (r=0.627, P<0.05;r=0.261, P<0.05;r=0.324, P<0.05;r=0.174, P<0.05) 。

3 讨论

TLRs一词源于果蝇体内的Toll受体, 与人类的白介素-1受体 (interleukin-1 receptor, IL-1R) 有着相似的序列。TLRs是一类天然免疫受体家族, 其成员都是Ⅰ型跨膜蛋白, 其包膜外区参与PAMPs和DAMPs的识别;其胞内区通过髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary-response protein 88, My D88) 参与细胞内的信号转导过程。最近的研究表明, TLRs除了启动炎症反应, 在多种病理生理情况下可以直接调控细胞的增殖和组织修复, 因此其在肿瘤形成和癌变中的作用越来越受重视[10]。已经发现多种肿瘤组织表达不同的TLRs, 而且有证据表明这些表达的TLRs可能参与肿瘤增殖的调控[11]。关于TLRs如何调控肿瘤细胞的增殖, 两种机制值得关注:一是慢性炎症损伤过度修复机制, 二是肿瘤微环境致瘤分子模式识别机制。第一种机制为大家广泛接受, 在诸多与炎症相关的肿瘤中得到证实。自身免疫疾病或者病原微生物感染引起的许多慢性炎症是相应恶性肿瘤的癌前病变, 这些病原微生物包括幽门螺杆菌、人类乳头瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、EB病毒等, 它们感染机体促进消化系统肿瘤、宫颈癌、肝癌及造血系统肿瘤的发生发展[6]。TLRs信号转导通路的持续激活被认为是慢性炎症持续存在进而发展成为恶性肿瘤的重要因素[12]。第二种机制近年越来越引起人们的重视, 已有研究发现肿瘤细胞内的某些成分可以通过胞吐、分泌以及细胞坏死等方式释放到细胞外, 促进肿瘤的发生和发展[13]。这些致瘤分子模式包括S100家族蛋白复合物, 血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA) , 透明质酸的片段, 过氧化物酶基因1 (peroxiredoxin 1) , 以及需要热休克蛋白家族运载的各种活性短肽[14]。这些致瘤分子模式能够激活TLRs及其下游的信号转导通路, 调节肿瘤细胞的增殖、侵袭及其他生物学行为。肝细胞癌是一种公认的与炎症密切相关的恶性实体肿瘤, 其生长过程中常常伴有细胞的坏死和裂解, 因此TLRs与肝癌的发生发展关系密切。

本组研究选择了102例具有乙型肝炎背景的肝细胞癌组织作为免疫组化方法研究对象, 距离肿瘤组织>1 cm的癌旁组织作为炎症组织对照, 另外选择17例肝血管瘤距离肿瘤>2 cm的瘤旁组织作为正常肝组织对照。结果显示, TLR2、TLR4蛋白在肝癌组织中的表达显著高于癌旁炎症组织和正常肝组织 (P<0.05) , TLR2、TLR4蛋白在癌旁炎症组织中的表达显著高于正常肝组织 (P<0.05) 。说明TLR2和TLR4蛋白的表达与肝细胞癌的发生密切相关, 可能参与乙型肝炎病毒感染基础上的癌变。结合肝细胞癌组织学分级发现, 低分化肝细胞癌组织中TLR2蛋白的表达显著高于高分化的肝细胞癌组织。可见, TLR2蛋白与肝细胞癌的进展密切相关。本组结果TLR2和TLR4蛋白表达与有无淋巴结转移和TNM分期无关, 提示二者均不能作为临床分期的指标。我们通过KAPLAN-MEIER法生存分析和多因素Cox比例风险模型进行分析发现, TLR2蛋白阳性是一种危险因素, 其表达程度越高, 患者术后平均无复发生存时间越短。这说明, TLR2可能促进恶性细胞的增殖, 它表达增加时肝细胞癌术后易于复发, 预后不良。