破骨细胞分化因子（精选5篇）

破骨细胞分化因子 第1篇

临床工作发现,骨折区如果缺少血管营养或神经支配,断离的骨质往往难以愈合[3]。人体神经组织的生长与血管网络的形成相互作用、伴行生长[4,5]。因此笔者设想,神经因子可能在骨修复及骨再生中发挥重要作用。

神经营养因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)是近年来发现的一种重要的神经营养家族成员[6],具有维持神经元存活、促进MSC分化为神经细胞[7]和促血管新生等作用[8]。如果挖掘NT-3对MSC成骨分化的影响,将对应用NT-3和MSC的组织工程技术,促进骨组织血管、神经再生,修复骨损伤等具有重要作用。目前,以NT-3促进MSC成骨分化的研究却鲜有报道。本实验拟阐明NT-3对人MSC生长和成骨分化能力的影响,为骨组织工程研究奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组

人骨髓间充质干细胞(广州赛业生物有限公司),以含10%胎牛血清(美国Gbico公司),1μmol/L青霉素(美国Sigma公司),100 u/ml链霉素(美国Sigma公司),2 mmol/L谷氨酰胺(美国Hyclone实验室)的α-MEM培养基为MSC基础培养基。含1×10-7mol/L地塞米松(美国Sigma公司)、50 mg/L抗坏血酸C(美国Sigma公司)、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠(美国Sigma公司)的α-MEM培养基为成骨诱导培养基。

NT-3组中加入100 ng/ml人NT-3重组蛋白(美国RD公司);在成骨诱导培养基中预先加入100 mmol/L ICG-001(美国RD公司)作用30 min,0.01 mmol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗3次,用100 ng/ml NT-3刺激者为Wnt抑制剂组;无刺激者为对照组。

1.2 方法

1.2.1 噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]实验检测细胞增殖

根据MSC诱导实验的分组情况,将各组细胞按每孔2×103接种于96孔培养板,37℃、5%二氧化碳CO2培养48h,每孔中加入20μl、5 mg/ml MTT(美国Sigma公司),孵育4 h,加入150μl二甲基亚砜(美国Sigma公司),连续振荡10 min后,用Emax酶标仪(美国Molecular Devices公司)在490 nm波长检测每组样品吸光度(optical delnsity,OD)值。

1.2.2 Western blot检测Caspase-3蛋白的表达

培养每组5×106个细胞,裂解细胞,25μg蛋白样品;依次经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜、封闭等步骤;一抗使用小鼠抗人Caspase-3抗体(1∶150,英国Abcam公司),二抗使用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白G;增强化学发光法(enhanced chemiluminescence,ECL)检测蛋白表达,Image-Pro Plus 6.0软件分析各蛋白条带相对吸光度作定量计算。选用β-actin(英国Abcam公司)为内参对照组。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(enzyme linked im-munosorbent assay,ELISA)

检测碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白-1(bone morphogenetic protein-1,BMP-1)的表达。使用人ELISA试剂盒(美国RD公司)检测各实验组中ALP、BMP-1蛋白表达,严格按照说明书进行操作。

1.2.4 茜素红染色

各组MSC诱导14 d后,用0.01 mol/L PBS冲洗3遍,4%多聚甲醛溶液固定60 min,1%茜素红染色15 min,再用0.01 mol/L PBS漂洗,BIX显微镜(日本Olympus公司)观察。ImagePro Plus 6.0软件分析各组茜素红染色的光密度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用方差分析,若方差齐则两两比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSC细胞增殖检测结果

对照组细胞增殖的OD值为(0.440±0.257),NT-3组为(0.980±0.248),Wnt抑制剂组为(0.685±0.251),经方差分析,差异有统计学意义(F=20.720,P=0.000)。NT-3组与对照组的MSC增殖OD值比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.415,P=0.001),NT-3组MSC增殖OD值高于对照组;Wnt抑制剂组与NT-3实验组的MSC增殖OD值比较,经t检验,差异有统计学意义(t=3.547,P=0.001),Wnt抑制剂组MSC增殖OD值低于NT-3实验组。见图1。

2.2 MSC细胞凋亡检测结果

对照组Caspase-3蛋白相对含量为(1.250±0.254),NT-3组为(0.690±0.239),Wnt抑制剂组为(0.889±0.243),经方差分析,差异有统计学意义(F=24.080,P=0.000)。NT-3组与对照组的Caspase-3蛋白相对含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.812,P=0.001),NT-3组Caspase-3蛋白相对含量低于对照组;Wnt抑制剂组与NT-3组的Caspase-3蛋白相对含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=2.477,P=0.018),Wnt抑制剂组Caspase-3蛋白相对含量高于NT-3组。见图2。

2.3 细胞的ALP和BMP-1的表达

对照组、NT-3组和Wnt抑制剂组的ALP、BMP-1蛋白浓度比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.01)(见附表)。NT-3组ALP和BMP-1蛋白与对照组比较,经t检验,差异有统计学意义(t=10.497和19.792,P=0.001),NT-3组ALP和BMP-1蛋白均高于对照组;Wnt抑制剂组ALP和BMP-1蛋白浓度与NT-3组比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.474和10.919,P=0.001),Wnt抑制剂组ALP和BMP-1蛋白浓度均低于NT-3组。见图3。

2.4 细胞茜素红染色结果

对照组茜素红染色的光密度值为(0.426±0.145),NT-3组为(0.857±0.187),Wnt抑制剂组为(0.706±0.159),经方差分析,差异有统计学意义(F=31.780,P=0.000)。NT-3组茜素红染色的光密度与对照组比较,经t检验,差异有统计学意义(t=7.727,P=0.001),NT-3组茜素红染色的光密度高于对照组;Wnt抑制剂组茜素红染色的光密度与NT-3组比较,经t检验,差异有统计学意义(t=2.610,P=0.013),Wnt抑制剂组茜素红染色的光密度低于NT-3组。见图4。

1)与对照组比较,P<0.01;2)与NT-3组比较,P<0.01

A:Western blot检测各组Caspase-3蛋白的表达;B:各组Caspase-3蛋白的相对含量比较;1)与对照组比较,P<0.01;2)与NT-3组比较,P<0.01

(n=18,±s)

A:各组细胞的ALP表达;B:各组细胞的BMP-1表达;1)与对照组比较,P<0.01;2)与NT-3组比较,P<0.01

A:对照组(×200);B:NT-3组(×200);C:Wnt抑制剂组(×200);D:各组茜素红染色光密度比较;1)与对照组比较,P<0.01;2)与NT-3组比较,P<0.01

3 讨论

目前,以组织工程技术进行骨损伤的治疗方法主要有自体或异体骨移植及利用羟基磷灰石、脱钙骨等技术制作人工骨组织材料等[9],虽然,这些方法各有优点,但同时也面临着诸如二次手术损伤、供体来源限制或存在免疫排斥反应、传播疾病、医学伦理等诸多问题[10]。

目前,骨组织工程成为促进骨质修复的重要手段,高分子支架材料适应于MSC生长和骨组织的修复[11]。MSC广泛存在于人体骨髓、脂肪等部位,并具有向骨、软骨、血管内皮细胞等组织细胞分化的特性,被广泛应用于骨损伤、心血管系统等疾病的治疗中,并取得较好的疗效。若在MSC培养基中加入地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠,能够较好地促进MSC分化为成骨细胞[12],笔者的实验以上述经典的成骨诱导培养基为基础进行实验。若单独应用MSC修复骨缺损,往往难以达到理想效果,MSC向成骨细胞分化及促进成骨细胞增殖代谢等,还需要BMP-1、表皮细胞生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等成骨诱导生物活性因子参与[13,14]。如果找到合适的骨活性因子,促进MSC成骨能力,必将加快成骨效果,对骨损伤修复具有重大意义。

临床工作发现,缺少神经支配或神经支配减弱的骨骼容易骨折或骨质疏松,笔者考虑神经因素在骨修复中扮演极为重要的角色。神经血管病变,会使骨组织失去神经血管支配或营养,而导致骨组织重塑修复功能障碍[15]。上述研究结果提示笔者,与其利用细胞因子单纯的促进MSC向成骨细胞分化,不如寻找一种能够促进神经、血管新生,并对MSC成骨分化具有效果的多功能细胞因子。

NT-3作为神经营养因子家族的重要成员,能够激化Trk C发挥生物学效应,促进脊髓损伤平面神经元存活及其轴突再生。NT-3还能够激活Wnt通路,Wnt通路在胚胎血管、肢体等形成或发育过程中发挥重要作用。Wnt通路活化,可以使胞质内的β-catenin积聚,导致下游Kremen、Ngn2、Pax6等基因高表达,促进血管内皮细胞、神经轴突等迁移,重塑肢体骨骼形成[16,17]。同时发现,NT-3也可有效地促进MSC向神经元分化[18]。近年来发现,NT-3与血管内皮细胞表面的Trk C受体结合,在血管新生的过程中发挥重要作用[19],NT-3修饰的MSC能有效地促进MSC增殖并分化为血管内皮细胞,加快糖尿病性小鼠皮肤溃疡的愈合[12]。而脑源性神经营养因子、神经肽Y、NT-4能够促进MSC向成骨细胞分化[20],但有关NT-3对骨组织再生及修复的研究鲜见报道。

本实验发现,NT-3组的MSC增殖显著增高,而Wnt抑制剂组的MSC增殖却明显降低,提示NT-3与MSC细胞膜上NT-3的特异性受体Trk C结合,激活Wnt通路[21],通过Wnt通路而促进MSC的增殖。MSC成骨分化实验中发现,与对照组比较,NT-3组的茜素红染色效果显著优于对照组,其钙化结节数量多,面积大,说明NT-3能诱导细胞聚集生长和钙盐沉积,具有明显的促MSC成骨作用;与NT-3组比较,Wnt抑制剂组的钙化结节数量明显降低,团块状也较前者小,说明Wnt抑制剂组的促MSC成骨作用明显低于NT-3组。ALP作为MSC早期成骨分化的指标,能够反映MSC成骨分化的能力。本实验发现,NT-3组MSC成骨分化效果明显,ALP表达较高,Wnt抑制剂组ALP表达降低,证明NT-3激活MSC内的Wnt通路,促使MSC向成骨细胞分化,证明NT-3能够重新启动成骨分化机制,间接证明神经因子在MSC成骨分化中的重要作用。如果在临床适当应用神经因子将加快骨折等疾病的修复和重建。也有研究发现,NT-3尚能通过激活Akt通路,而促进高糖环境MSC旁分泌血管内皮生长因子等细胞因子[8,12,20]。因此不排除NT3在促进MSC成骨分化的过程中,可能会存在Akt、Erk等信号机制[22]。

综上所述,NT-3能有效促进MSC向成骨细胞分化。NT-3具备作为良好骨诱导活性因子和促进神经血管新生的潜质。笔者将探讨MSC联合生物活性因子及生物支架,开发原位诱导性生物材料,以期达到骨组织工程支架材料的优化与整合,更好地发挥神经血管源性细胞因子和MSC等干细胞在骨再生及修复中的作用,为骨组织工程修复的发展奠定研究基础。

摘要：目的 阐明神经营养因子-3(NT-3)促进人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力,并分析Wnt通路的作用机制。方法 正常培养的人骨髓间充质干细胞为对照组;NT-3刺激的人骨髓间充质干细胞为NT-3组;加入ICG-001作用30 min后,用NT-3刺激者为Wnt抑制剂组,每组进行成骨诱导实验。利用噻唑蓝细胞增殖、酶联免疫吸附试验、Western blot检测、茜素红染色等实验分别检测各组人骨髓间充质干细胞增殖、细胞凋亡、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-1(BMP-1)等蛋白表达及钙结节形成能力。结果 与对照组比较,NT-3组间充质干细胞(MSC)增殖吸光度值增高(P<0.01);NT-3组碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达或茜素红染色效果均高于对照组(P<0.01);与NT-3组比较,Wnt抑制剂组MSC增殖吸光度值降低(P<0.01);而Wnt抑制剂组的碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达均低于NT-3组(P<0.01)。结论 NT-3通过Wnt通路,促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

破骨细胞分化因子 第2篇

体外培养小鼠卵母细胞及其生长分化因子-9基因表达

体外培养小鼠的窦前卵泡以得到第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞, 比较体外发育卵母细胞与体内生长的卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)的基因表达量, 探讨GDF-9的表达对卵母细胞体外发育成熟的.影响. 选择体外培养第2天(D2)、D4、D6、D8、D10、D12卵母细胞作为体外发育组; 同窝雌性小鼠出生后D12、D14、D16、D18、D20、D22卵母细胞作为体内发育组; 半定量逆转录多聚酶链反应技术分别检测两组MⅠ卵母细胞GDF-9基因表达量. 结果体外培养小鼠窦前卵泡可以得到MⅡ期卵母细胞, 卵泡成活率、窦腔形成率、卵母细胞成熟率分别达到89.5%、51.8%和56.6%. 小鼠卵母细胞GDF-9基因表达量随发育时间的改变而发生变化, 而体外发育D8-12卵母细胞GDF-9表达量显著低于同期体内发育卵母细胞(P<0.05). 体外发育D8-12卵母细胞GDF-9基因表达量低于同期体内发育的卵母细胞的原因之一可能是其发育潜能较低.

作 者：彭宇洪 庄广伦 周灿权 谢守珍 程冀平PENG Yu-hong ZHUANG Guang-lun ZHOU Can-quan XIE Shou-zhen CHENG Ji-ping 作者单位：广州军区武汉总医院,妇产科,湖北,武汉,430070刊 名：动物学研究 ISTIC PKU英文刊名：ZOOLOGICAL RESEARCH年，卷(期)：27(5)分类号：Q95关键词：小鼠 培养 卵母细胞 生长分化因子9 Mice Culture Oocyte Growth differention factor-9

伴破骨细胞样巨细胞的乳腺癌一例 第3篇

关键词：伴破骨细胞,巨细,乳腺癌

患者, 女, 43岁。因发现右乳肿块4年于2001年4月20日入院。查体:右乳房外上象限距乳头3cm处可触及5cm4cm4cm肿块, 边界尚清, 活动差。同侧腋窝可触及多枚肿大淋巴结。临床诊断:右乳癌。

1 病理检查巨检

送检右乳癌根治术标本17cml2cm6cm, 在乳房外上象限距乳头3cm处可见4.5cm4cm3cm界尚清肿块, 质硬, 切面灰红间褐, 中央有出血坏死。腋窝脂肪组织中可触及肿大淋巴结14枚。镜检:肿瘤组织形态呈多样性:有的区域癌细胞呈不规则腺管状、条索状、巢状排列, 癌细胞较大, 多形性明显, 核大浓染, 核分裂像多见, 呈浸润性导管癌形象。有的区域间质内有大量粘液, 形成粘液湖, 癌细胞呈小巢状、小乳头状漂浮在粘液中 (图1) 。癌细胞呈圆形、多边形, 细胞轮廓不清, 呈合体细胞样, 可含有小空泡。肿瘤间质内可见有较多的破骨细胞样巨细胞, 弥漫分布于腺体之间或腺腔内 (图2) , 巨细胞胞浆丰富, 呈嗜酸性, 核数目多为5～20个, 大小一致, 呈圆形或椭圆形, 相互堆积, 居于细胞中央, 部分细胞内吞噬有少量的含铁血黄素, 周围可见较为丰富的充血扩张的毛细血管和吞噬有含铁血黄素的吞噬细胞, 免疫组化染色CD68阳性 (图3) 。腋窝淋巴结有10枚已发生癌转移。病理诊断 (右侧) 伴破骨细胞样巨细胞的乳腺癌伴同侧腋窝淋巴结 (10/14) 癌转移。

2 讨论

伴破骨细胞样巨细胞的乳腺癌较为罕见, 属于乳腺化生癌范畴。巨检呈边界清楚的红褐色肿块, 因此临床乳房X线摄片上易误诊为良性结节或髓样癌。在组织学上癌组织大多呈浸润性导管癌形态, 也可为小管癌、浸润性小叶癌、乳头状癌和粘液癌等形态, 本例肿瘤组织即为浸润性导管癌和粘液癌混合型。破骨细胞样巨细胞常分布于癌性腺体边缘, 其周围有新鲜或陈旧性出血灶。目前, lacocca等[1～2]大多数学者认为破骨细胞样巨细胞为组织细胞性, 是单核细胞前体融合而成, 可能是肿瘤间质成分受肿瘤细胞及其产物诱导而出现化生。对于本瘤的预后, 一般认为其生物学行为比普通型浸润性导管癌更具侵袭性, 因而预后更差[3]。

参考文献

[1]Iacocca MV, Maia DM.Bilateral intiltrating lobular carcinoma of the breast wifh osteoclast-Like giant cells[J].Breast J, 2001, 7:60～65.

[2]Stewart CJ, Mutch AF.Breast carcinoma with osteoclast-like giant cells[J].Cytopathology, 1991, 2:215～219.

破骨细胞分化因子 第4篇

腺苷脱氨酶 (ADA) 是体内调节腺苷和脱氧腺苷代谢的关键酶[7]。ADA不仅降解细胞内的腺苷, 也负责降解能够引起淋巴细胞毒性的细胞外腺苷[7,8]。由于基因突变导致ADA的先天性缺乏, 会引起基因缺陷性疾病[9]。近年来的研究表明, 脱氧NTP的不足会导致严重的“复制压力”, 从而破坏细胞中的DNA, 引起炎症性疾病, 如严重的骨吸收疾病[10]。本研究主要是用大鼠的全骨髓细胞的培养体系来研究甲氨蝶呤对ADA的抑制现象, 并希望通过联合用药, 提高对风湿性颞下颌关节炎的疗效。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物:4周龄SD雄性大鼠, 清洁级, 体质量100~120 g和5周龄雌性Lewis大鼠, 清洁级, 体质量100~120 g, 由九动株式会社 (鸟栖, 日本) 提供, 所有的动物试验都是根据九州大学制定的护理和使用动物指南而进行的。主要试剂及仪器:α-Minimum Essential Medium (α-MEM;cat#12000-022) 、胎牛血清和青霉素购于Invitrogen公司 (大岛, 纽约) 。1, 25- (OH) 2D3购于英国普利茅斯生物研究实验室。ADA抗体 (H-300) SC-25747购于圣克鲁斯生物技术 (美国) 。第二抗体:过氧化物酶偶联的抗兔Ig G和抗体 (ECL) 试剂盒购于Amersham Biosciences公司 (白金汉郡, 英国) 。甲氨蝶呤、核苷、脱氧核苷、TRAP染色试剂盒和转录-聚合酶链反应试剂盒购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓培养系统

全骨髓细胞培养系 (破骨细胞形成系) :将4周龄SD雄性大鼠用异氟烷麻醉后, 无菌条件下取其胫骨和股骨, 剪掉骨垢端暴露骨髓腔, 然后用25号注射针冲出全骨髓细胞, 调整细胞浓度, 用24孔培养板 (1×106cells/孔) 或10 cm培养皿 (1×106cells/皿) , 在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养, 培养液为含15%FBS的α-MEM培养液。其中添加1α, 25-二羟维生素D3 (浓度为10-8mol/L) , 加热处理ROS17/2.8细胞培养基 (HT-ROS CM) 浓度为10%。培养4或5 d后, 进行TRAP染色, 其中含有3个以上的核的TRAP阳性细胞作为破骨细胞样多核细胞进行计数[11]。

药物添加: (1) 在24孔培养板中分别加入甲氨蝶呤及核苷4行10列, 每行的药物添加顺序为:对照组 (0) , 甲氨蝶呤+腺苷, 甲氨蝶呤+鸟苷, 甲氨蝶呤+胞苷, 甲氨蝶呤+尿苷, 甲氨蝶呤+脱氧腺苷, 甲氨蝶呤+脱氧鸟苷, 甲氨蝶呤+脱氧胞苷和甲氨蝶呤+胸苷。甲氨蝶呤的质量浓度为1μmol/L;核苷和脱氧核苷的质量浓度为200μmol/L。每列添加4孔 (n=4) , 第1列为对照组, 不添加药物。 (2) 在10 cm培养皿共有3组, 每组的药物添加顺序为: (1) 对照组 (0) , 不添加药物; (2) 甲氨蝶呤质量浓度为1μmol/L; (3) 甲氨蝶呤1μmol/L+脱氧腺苷200μmol/L, 用来提取总RNA。

1.2.2 定量RT-PCR

使用TRIzol试剂 (Invitrogen公司, 美国, 加州) , 根据manufacturer法从培养的细胞来提取细胞总RNA, 并使用RT-PCR试剂盒 (Takara, 京都, 日本) 来进行半定量RT-PCR。此试验主要是在全骨髓细胞培养系中, 分析甲氨蝶呤如何影响ADA mR-NA的表达。用于PCR的引物, 如表1所示。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳和用溴化乙锭染色后, 在UV光下显色。

1.2.3 统计学分析

使用SPSS 10.0统计学软件, 采用单因素方差分析, 对2种不同细胞系不同浓度药物处理后TRAP阳性细胞进行统计学处理, 各组与第二组 (MTX=1μmol/L) 作比较, 并采用Newman-Keuls多重比较, 以P<0.05为差异有显著性意义, ***:P<0.001。

2 结果

2.1 在核苷中脱氧腺苷和腺苷可拮抗甲氨蝶呤对破骨细胞形成的抑制

细胞试验结果显示:低剂量的甲氨蝶呤能够显著的抑制破骨细胞的形成, 只有脱氧腺苷和腺苷能够有效地拮抗甲氨蝶呤对破骨细胞形成的抑制 (图1) 。

2.2 甲氨蝶呤在全骨髓细胞培养系中抑制了ADA mRNA的表达

在全骨髓细胞试验体系中, 用半定量RT-PCR来进行评估并发现甲氨蝶呤抑制了ADA mRNA的表达。当加入脱氧腺苷后, 甲氨蝶呤对ADA的抑制作用有所减弱 (图2) 。

3 讨论

细胞试验结果显示:低剂量的甲氨蝶呤能够显著抑制破骨细胞的形成, 而且只有脱氧腺苷和腺苷能够有效地拮抗甲氨蝶呤对破骨细胞形成的抑制。而腺苷和脱氧腺苷在细胞外主要来源于凋亡细胞DNA的降解, 在细胞内主要来源于生理的核酸合成, 同时这些核苷和脱氧核苷在体内又被磷酸化而用来合成ATP或脱氧ATP并被利用合成DNA。细胞外的腺苷能够通过其位于细胞表面的腺苷受体发挥炎症介质的作用, 最近的研究表明, 腺苷通过其细胞表面受体A2bAR能够完全取消甲氨蝶呤对破骨细胞形成的抑制机制[12]。

ADA是存在于体内主要来降解腺苷和脱氧腺苷的关键酶, 抑制ADA会引起细胞外脱氧腺苷浓度异常增高从而会影响DNA的合成。据临床报道, 在风湿性关节炎患者的滑膜液中, ADA的浓度比正常人要高很多[13], 甲氨蝶呤会引起细胞外腺苷浓度的浓度升高[14,15]。而同样细胞试验也表明:甲氨蝶呤会抑制ADA的表达, 根据目前的数据可以推测, 由于甲氨蝶呤可能抑制ADA的表达, 从而引起了腺苷和脱氧腺苷的聚集, 反过来又影响了甲氨蝶呤的治疗效果。

一般情况下, 细胞内的脱氧腺苷是在细胞内生理合成 (de novo) 或者通过核苷转运由细胞外的脱氧腺苷补充, 而细胞的外脱氧腺苷的主要来源是凋亡细胞的DNA[16]。正常的生理情况下, 细胞内外的脱氧腺苷平衡是必不可少的。当病理过程发生时, 脱氧腺苷浓度平衡就有可能被打破, 脱氧腺苷的“复制压力” (replication stress) 就会发生, DNA合成就会受到抑制, 此时脱氧胞苷激酶就会发挥着至关重要的作用, 以避免“复制压力”。这种酶会将脱氧胞苷磷酸化来形成d CMP, 继而合成DNA, 它还能够将脱氧腺苷和脱氧鸟苷分别催化为d AMP和d GMP, 从而缓解脱氧腺苷的“复制压力”[17]。因此可以设想:如果把脱氧胞苷激酶引进甲氨蝶呤对炎症性骨吸收的治疗系统, 就有可能解决甲氨蝶呤疗效不良的问题。另一方面腺苷表面受体拮抗剂的研究也是解决甲氨蝶呤疗效不良的一个途径。当然新的因子的加入必然会引起整个核苷代谢系统的改变, 所以有待对炎症性骨吸收和腺苷代谢的更进一步研究。

摘要：目的:研究腺苷脱氨酶 (ADA) 和甲氨蝶呤 (MTX) 对破骨细胞形成的作用。方法:用大鼠的全骨髓细胞培养体系 (WBMCs) 来评价破骨细胞形成。用半定量RT-PCR来评估MTX对ADA mRNA水平的影响。结果:全骨髓细胞培养系中, 只有腺苷和脱氧腺苷消除了MTX对破骨细胞形成的抑制作用;MTX可抑制ADA mRNA的表达。结论:MTX抑制ADA表达, ADA表达下降使腺苷和脱氧腺苷表达升高, 使MTX对破骨细胞的抑制作用减弱。

破骨细胞分化因子 第5篇

1 材料和方法

1.1 实验材料

α- MEM培养基(Gibco,USA);阿仑膦酸钠(ALN)、TRAP染色试剂盒、前列腺素E2(PGE2)、VitD3(Sigma,USA);优质胎牛血清(Hyclone,USA);红细胞裂解液(北京博奥森);扫描电镜S- 4800(HITACHI,Japan),Rotor- Gene 3000荧光定量PCR仪(Gene company limited,USA);c57雄性小鼠,购自北京维通利华。

1.2 OB- OC共培养体系及实验分组

组织块法培养小鼠颅骨OB培养至第3代[3]。断颈处死小鼠,无菌条件下切取小鼠双侧股骨及胫骨,磷酸缓冲液(PBS)缓冲液清洗后去掉两侧干骺端,用α- MEM培养液(含100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素,15%胎牛血清)冲洗骨髓腔获得骨髓细胞,制备细胞悬液,红细胞裂解液裂解红细胞。裂解后收集骨髓细胞,与第3代OB以10∶1的比例混合;并在α- MEM培养液中加入10-6 mol/L PGE2、10-8 mol/L Vit D3 ,以诱导OC分化生成。将混合后的细胞以4105 个/cm2的密度接种于直径6 cm培养皿中,事前于皿底放置盖玻片及牙本质磨片。细胞分为对照组和ALN处理组,后者培养液内含有10-6 mol/L ALN。每2 d换液1 次。

1.3 抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate- resistant acid phosphatase,TRAP)染色

于共培养第7 天,取出细胞爬片,按TRAP染色试剂盒操作步骤进行染色,显微镜下观察,计算破骨细胞数目。方法为100 倍下随机选取5 个视野,计数每视野中TRAP染色阳性细胞(细胞核≥3 个,细胞质内出现棕褐色颗粒)数目,5 个视野的平均数代表该细胞爬片的破骨细胞数目。

1.4 牙本质磨片检测

取共培养至9 d的牙本质磨片,2.5%戊二醛4 ℃固定7 min,在1 mol/L氢氧化胺中以50 Hz超声清洗5 min,再经蒸馏水超声清洗5 min,共3 次;随后2.5%戊二醛固定2 h, 1%饿酸固定2 h,乙醇逐级脱水,醋酸异戊酯置换,二氧化碳临界点干燥,镀金,扫描电镜(HITACHI S- 4800)观察吸收陷窝。每孔牙本质磨片上随机选取5 个视野(500 倍),用医学数码图像分析系统Med 6.0测量5 个视野吸收陷窝总数目及总面积,数值/5代表该磨片的陷窝数目及面积。

1.5 Real- time PCR检测

ALN处理48h后,收获2 组细胞, Trizol提取总 RNA;按照Real time PCR kit说明书将RNA逆转录合成 cDNA,所用引物见表 1。cDNA扩增后在Rotor- Gene 3000荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测。反应条件为: 95 ℃,15 s; 60 ℃,40 s; 72 ℃,15 s; 共50 个循环。2 组细胞检测均重复3 次。检测时PCR仪采集每一反应管中荧光强度的变化,并绘制动力学曲线,得出样品荧光强度增加到阈值时的平均Ct值,由分析软件自动计算出待测基因与管家基因GAPDH比较的ΔCt值,进而计算出ALN组与对照组ΔCt值比较的ΔΔCt,并依据公式基因相对水平=1/2ΔΔC计算2 组比较待测基因NFATc1、c- Fos、OPG、RANKL基因的相对水平。

1.6 统计学分析

TRAP阳性细胞数目、吸收陷窝数目及陷窝面积用undefined表示。用统计软件SPSS 11.5进行t检验。P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRAP染色

细胞培养至第7 天,2 组均形成TRAP染色阳性多核破骨细胞(图 1),但组间差异有显著性:对照组所形成的破骨细胞数量及体积均大于ALN组(P<0.01)(表 2),提示ALN对共培养体系中破骨细胞的生成产生抑制作用。

2.2 牙本质吸收陷窝观察及定量分析

细胞培养第9 天,扫描电镜下各组牙本质磨片上出现不同程度的吸收陷窝(图 2); 2 组吸收陷窝计数及陷窝面积见表 2。对照组和ALN组比较,吸收陷窝数目较多,陷窝总面积也较大(P<0.01);上述结果说明ALN对共培养体系中OC骨吸收功能产生抑制作用。

A: 对照组; B: ALN组

A: Control group; B: ALN group

注: ①组间比较, P<0.01

2.3 Real- time PCR 检测

经Real- time PCR检测,各组NFATc1、c- Fos、OPG、RANKL基因mRNA水平经过换算,其相对浓度见图 3。ALN组与对照组相比NFATc1、c- Fos、OPG、RANKL相对浓度分别为0.058±0.010、 0.107±0.014、 0.353±0.185、 0.244±0.148(P<0.01)。上述结果说明,在共培养体系中,10-6mol/L的阿仑膦酸钠不仅对破骨细胞的生成有抑制作用,而且抑制体系中破骨细胞相关基因NFATc1、 c- Fos、 OPG、 RANKL的表达。

A: 对照组; B: ALN组

A: Control group; B: ALN group

3 讨 论

成骨细胞和破骨细胞是参与骨代谢的效应细胞,在骨代谢过程中成骨细胞生成骨质,破骨细胞吸收骨质;2 种细胞的共同作用维持机体内骨的动态平衡。以往的研究表明,成骨细胞和破骨细胞间的功能活动并不是孤立存在的,二者之间存在着直接或间接的交互作用(信号交谈);其中,OPG/RANKL/RANK信号轴对破骨细胞分化、生成及骨吸收功能发挥着重要作用,是成骨细胞和破骨细胞之间信号交谈的重要传导通路[4,5]。

破骨细胞的分化和活化受成骨细胞调节。成骨细胞分泌的OPG和RANKL对破骨细胞的分化、成熟和信号传递起着重要的调节作用[6]。OPG属于TNF- α超家族成员,以分泌的方式在胞外发挥作用。在体外OPG可以阻止破骨细胞的分化和活化[7,8,9]。OPG是 RANKL的可溶性饵受体,竞争性的与RANKL结合,阻断RANKL与破骨细胞前体细胞膜上破骨细胞分化激活受体 (RANK)的结合,从而降低了破骨细胞的形成,抑制破骨细胞性骨吸收[10,11]。OPG对OC生成的抑制作用不仅决定于OPG的分泌量,而且决定于OPG与RANKL的比例,比例越高,抑制作用越强。OPG作用于破骨细胞抑制骨吸收的路径主要有三条:① OPG与RANKL结合,阻止RANK与RANKL的结合,拮抗RANKL对破骨细胞分化和活性的影响[12]。② OPG与破骨细胞上存在的相对分子质量140 000的一种蛋白质特异性结合,直接抑制破骨细胞功能,这一过程没有RANKL及其受体RANK的参与;③ OPG通过干扰基质细胞与破骨细胞之间的相互作用,诱导破骨细胞的凋亡[6]。

阿仑膦酸盐对成骨细胞-破骨细胞共培养体系的影响较为复杂。本研究结果发现:共培养体系中加入10-6mol/L ALN抑制了共培养体系中RANKL、OPG、 c- Fos、 NFATc1的基因表达。从结果中可以分析出,共培养体系中成骨细胞表达的RANKL、OPG均明显减弱,并且OPG与RANKL的比例增高,造成RANKL与RANK的结合效率降低,随之RANKL介导的破骨细胞分化生成通路NF- КB通路、 MAPK通路受阻,其下游特异性因子c- Fos、 NFATc1表达障碍,致使破骨细胞生成及骨吸收功能减弱。

阿仑膦酸盐为临床上治疗骨质疏松类骨代谢疾病的主要药物,本实验通过体外建立OB- OC共培养体系,加入阿仑膦酸盐进行处理,发现其对体系中破骨细胞的分化生成及骨吸收功能产生抑制,并下调该体系中NFATc1、 c- Fos、 OPG、 RANKL的基因表达。这些研究结果将更好地为双膦酸盐在临床中的应用提供实验依据。

参考文献

[1]Stains JP,Civitelli R.Cell-cell interactions in regulating os-teogenesis and osteoblast function[J].Birth Defects Res CEmbryo Today,2005,75(1):72-80.

[2]Zhang Q,Badell IR,Schwarz EM,et al.Tumor necrosisfactor prevents alendronate-induced osteoclast apoptosis invivo by stimulating Bcl-xL expression through Ets-2[J].Ar-thritis Rheum,2005,52(9):2708-2718.

[3]戚孟春,胡静,邹淑娟,等.大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变[J].华西口腔医学杂志,2005,23(2):110-112.

[4]Wijenayaka AR,Kogawa M,Lim HP,et al.Sclerostinstimulates osteocyte support of osteoclast activity by aRANKL-dependent pathway[J].PLoS One,2011,6(10):e25900.

[5]Al-Dujaili SA,Lau E,Al-Dujaili H,et al.Apoptotic osteo-cytes regulate osteoclast precursor recruitment and differenti-ation in vitro[J].J Cell Biochem,2011,112(9):2412-2423.

[6]Boyle WJ,Simonet WS,Lacey DL.Osteoclast differentia-tion and activation[J].Nature,2003,423(6937):337-342.

[7]Murthy MB.Osteoimmunology-Unleashing the concepts[J].J Indian Soc Periodontol,2011,15(3):190-198.

[8]Kong YY,Yoshida H,Sarosi I,et al.OPGL is a key regu-lator of osteoclastogenesis,lymphocyte development andlymph-node organogenesis[J].Nature,1999,397(6717):315-323.

[9]Kohli SS,Kohli VS.Role of RANKL-RANK/osteoprote-gerin molecular complex in bone remodeling and its immuno-pathologic implications[J].Indian J Endocrinol Metab,2011,15(3):175-181.

[10]Anderson DM,Maraskovsky E,Billingsley WL,et al.Ahomologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function[J].Nature,1997,390(6656):175-179.

[11]徐琳,谭颖徽,何海涛.降钙素基因相关肽OPG/RANKLmRNA对兔成骨细胞表达的影响[J].实用口腔医学杂志,2005,21(3):396-399.