PCR检测范文（精选12篇）
PCR检测 第1篇
笔者在2015 年的病害调查中, 在海南省琼中县和澄迈县两地发现类似黄龙病感染的柑橘病株, 症状表现为叶片退绿黄化, 形成均匀黄化型黄梢或斑驳型黄梢, 在病梢上再长的新梢, 叶片窄小, 黄化。本研究对采集的柑橘黄化样品, 进行黄龙病病原的分子检测鉴定, 以确定柑橘病树中的黄龙病原, 为该病害的防治提供理论依据和技术支持。
一、材料与方法
㈠材料
2015 年在海南琼中县采集表现黄化病的绿橙叶片样品51 个, 澄迈县采集表现黄化病的福橙叶片样品27 个, 以及健康的实生柑橘苗做阴性对照。
㈡样品总DNA提取
撕取叶片的中脉, 参考Ahrens等的方法[6], 分别提取病样和健康样品的总DNA, 保存于-20o C冰箱备用。
㈢PCR检测
用黄龙病菌16S r DNA通用引物OI1 和OI2c[7]对样品进行PCR扩增, 以健康柑橘植株总DNA为阴性对照, 超纯水为空白对照。 引物序列为OI1 5’- GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’, OI2c 5’- TCGCGACTTCGCAACCCAT-3’。PCR体系为25 微升, 反应条件为94℃预变性4 分钟;94℃变性30 秒, 54℃退火30 秒, 72℃延伸1 分钟, 30 个循环;最后72℃延伸10 分钟。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳后, 通过凝胶成像系统中进行观察摄影并记录图片。
二、结果与分析
㈠病株症状表现
海南省琼中县的绿橙和澄迈县的福橙病树主要表现黄化症状。初发病时, 树冠上少数嫩梢新叶尚未完全转绿成熟便发病黄化, 形成均匀黄化型黄梢;或是叶片已完全转绿成熟后发病, 叶片退绿黄化, 产生黄绿相间的斑驳, 形成斑驳型黄梢。其后在病梢上再长的新梢, 叶片窄小, 多呈缺锌状花叶, 病树上原来未发病的梢上叶片也陆续呈现斑驳, 黄化脱落, 树势衰退, 产量大减。
㈡病株中黄龙病菌PCR检测结果
对海南省琼中县51 个疑似黄龙病的绿橙样品和澄迈县27 个疑似黄龙病的福橙样品, 用引物OI1 和OI2c进行PCR检测。结果发现, 51 个绿橙样品中, 有32 个为阳性, 阳性率为62.75%;27 个福澄样品中, 14 个为阳性, 阳性率为51.85%;阴性对照健康柑橘样品和空白对照超纯水均无目的片段 (图1) 。
三、讨论
本研究用PCR技术, 对在海南柑橘主产区琼中县和澄迈县出现的黄龙病疑似症状进行检测, 确定海南省琼中县和澄迈县出现的柑橘枝梢黄化等疑似症状为柑橘黄龙病菌引起, 且柑橘黄龙病的发病率较高。
柑橘黄龙病在我国发生的历史长, 分布广, 危害大, 半个多世纪以来, 严重地危害着我国柑橘产业的发展。我国有柑橘栽培的19 个省、区已有11 个遭受危害, 其面积占柑橘总栽培面积的80%以上, 产量占总产量的85%左右。而且, 由于柑橘黄龙病病原能侵染各种柑橘类植物, 对我国柑橘种质资源的保护构成严峻的挑战。
海南岛自然环境优越, 冬季低温较高, 是优越的柑橘生产地。重视海南的柑橘黄龙病, 加强种苗的检验检疫, 防治黄龙病的传毒介体柑橘木虱, 及时挖除病树, 对于保护海南的柑橘产业具有重要的意义。
摘要：柑橘黄龙病 (Citrus Huanglongbing) 是一种严重威胁柑橘生产的毁灭性病害。本研究利用柑橘黄龙病菌16S r DNA特异引物, 对海南柑橘主产区琼中县和澄迈县两地的78个疑似柑橘黄龙病样品进行了多聚酶链式反应 (PCR) 检测。结果表明, 采自海南省琼中县的51个绿橙样品中, 有32个为阳性, 带菌率为62.75%;采自海南省澄迈县的27个福澄样品中, 14个为阳性, 带菌率为51.85%。结果表明, 黄龙病在海南的主要柑橘产区均有较高的发生率, 生产上应尽快引起重视。
参考文献
[1]娄兵海, 周常勇.柑桔黄龙病研究进展[J].湖南农业大学学报.2007, ⑿.
[2]吴如健, 柯冲.柑桔黄龙病治理试验及综合防治措施[J].江西农业学报.2007, ⑼.
[3]柯穗, 唐伟文, 高乔婉, 等.柑桔黄龙病病原物提纯方法和血清学的初步研究[J].华南农业大学学报 (自然科学版) .1989, ⑴.
[4]李韬, 柯冲.应用Nested PCR技术检测柑桔木虱及其寄主九里香的柑桔黄龙病带菌率[J].植物保护学报.2002, ⑴.
[5]李韬, 陈长忠, 邓朝军, 等.福建省柑桔黄龙病虫媒木虱的野生寄主及其带毒率研究[J].江西农业大学学报.2007, ⑸.
[6]Ahrens U, Seemuller E.Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S r RNA gene.[J].Phytopathology.1992, ⑻.
PCR检测 第2篇
甘蔗线虫病抗性基因的PCR检测研究
以38份未经线虫病常规鉴定的甘蔗种质资源为供试材料,根据番茄抗根结线虫病基因和甜菜抗胞囊线虫病基因的.保守序列区域,分别设计了2条上游引物、2条下游引物,对设计的引物进行组合后,应用PCR特异扩增从中分别筛选出各1对特异引物.用抗根结线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约460bp大小的特异片段;用抗胞囊线虫基因设计的特异引物进行扩增最终获得了1条大约690 bp大小的特异片段,进一步进行了PCR-Southern杂交,确认了该2条特异引物的真实性.
作 者：吴杨 周会 潘大仁 WU Yang ZHOU Hui PAN Da-Ren 作者单位：福建农林大学作物学院,福建,福州,350002 刊 名：作物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRONOMICA SINICA 年，卷(期)： 32(6) 分类号：S4 关键词：甘蔗 抗线虫基因 基因检测 PCR-Southern杂交PCR检测 第3篇
【关键词】 EMA PCR 微生物死活菌区分 微生物检测新技术
【课题项目】重庆三峡医药高等专科学校校级苗圃工程（2014mpxz4）。
【中图分类号】G64 【文献标识码】A 【文章编号】2095-3089（2015）05-0233-01
分子生物学方法中基于PCR技术的检测方法被越来越多地应用于致病菌的检测，但是传统的PCR检测技术不仅能扩增活细胞DNA，同时自由状态的DNA或死细胞DNA也能被扩增，导致检测出现假阳性，因此一种能特异、快速、准确检测病原菌的方法极为迫切。
一、EMA-PCR检测技术原理
活菌和死菌的区别之一是细胞膜的完整性，EMA是一种DNA 结合染料，其光解后形成的氮宾化合物能够渗透进入细胞膜不完整的菌体内，与DNA分子发生不可逆的共价结合，从而抑制其PCR扩增，但不会影响活菌DNA的PCR扩增。EMA结合PCR的检测方法，仅以活菌的基因组DNA为检测靶标，能有效降低传统PCR检测的假阳性，同时能有效降低“活的但不可培养状态”（VBNC）菌在传统培养法带来的假阴性结果，使检测结果更加准确、可靠。
二、EMA-PCR检测技术应用
目前，EMA-PCR新型微生物活体检测技术已经广泛用于食品微生物、环境微生物和医学微生物的检测中。Guy等[1]用EMA结合常规PCR的方法检测屠宰场中有活性的沙门氏菌，这种EMA-qPCR方法成功地避免了检测过程中的假阳性，对食品安全评估更为准确。Pilar等[2]用v-PCR方法检测军团杆菌，结果发现，v-PCR方法与平板培养法结果比较相近或略高，但是相对于常规PCR的检测结果而言偏低或相近，表明此法能避免常规PCR检测带来的假阳性和平板培养计数法可能带来的假阴性结果，该法用于检测水体中的军团杆菌。新建立的v-PCR方法在缩短检测时间的同时保证了检测结果的准确性。Trivedi等[3]用较高的EMA浓度实时定量监测柑橘中脉中不可培养的柑橘黄龙病菌的含量，发现在感染的长春花中检测到的病原菌含量比感染的柑橘中高，对病害的流行规律研究有重要的意义。
金黄色葡萄球菌（SA）是一种常见的高致病性革兰氏阳性菌，对SA的准确检测十分重要，而检测的关键是食品中活菌是否存在和如何准确定量的问题。余以刚等[4]建立金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件模型，成功建立了DNA结合EMA与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法。
EMA-PCR检测技术有效避免了传统PCR检测方法的假阳性结果和传统培养方法带来的假阴性结果，这种新型、方便、快捷、准确的微生物活体检测技术将取代传统的检测技术成为微生物检测的新思路。
参考文献：
[1]Guy RA， Kappor A， Holicka J， Shepherd D， Horgen PA. Arapidmolecular-based Assay for direct quantification of viable bacteriain slaughterhouses. Journal of Food Protection， 2006，69（6）：1265-1272.
[2]Pilar DV，Lydie S，Jean MD. Viability PCR，a Culture-Independent method for rapidand selective quantification of viable legionellapneumophilacellsin environmentalwatersamples.Applied and environmental microbiology，2009，75（11）：3502-3512
[3]Trivedi P， Sagaram US， Kim JS. et al. Quantification of viable Candidatus Liberibacter asiaticus in hosts using quantitative PCR with the aid of ethidium monoazide （EMA）.European Journal of Plant Pathology，2009，124： 553-563.
[4]余以刚，田聪，肖性龙等.金黄色葡萄球菌VBNc状态的诱导条件和EMA-qPCR检测.华南理工大学学报（自然科学版），2013，1（41）：127-129.
作者简介：
禽白血病的PCR检测 第4篇
关键词：禽白血病病毒,PCR鉴定,克隆
禽白血病是由白血病/肉瘤病毒群引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。该病几乎感染所有商品鸡群, 感染鸡群呈渐进性发病, 持续的低死亡率。禽白血病病毒核酸编码区有3个主要结构基因, 从5′～3′依次为gag-pol-env, 其中gag基因编码衣壳蛋白P27, 是高度保守的群特异性抗原。试验针对P27基因使用1对引物, 用PCR扩增了来源于贵州不同养殖场的疑似病例及正常鸡的肝脏、血液, 并对其中2株病毒进行了克隆测序, 以分析贵州地区禽白血病病毒的感染情况。
1 材料与方法
1.1 材料
病料为来源于不同养殖场的疑似病鸡肝脏样本10份、正常鸡肝脏样本13份和血液样本11份;TaqDNA聚合酶、dNTP液、pMD18-T载体、限制性内切酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;胶回收试剂盒, 购自恒因生物公司;禽白血病病毒J亚群抗体检测试剂盒等, 购自世纪元亨生物公司。
1.2 ALV-J血清抗体的检测
按照禽白血病病毒ALV–J亚群抗体检测试剂盒说明书对11份血液样本进行检测。
1.3 PCR方法的建立
1.3.1 引物的合成
参考张立成等[1]发表的禽白血病病毒群特异性抗原P27基因序列合成引物:上游引物P1为5′–CCATGCCTGTAGTGATTA–3′, 下游引物P2为5′–CCCGACCCAGTTTGTCCA–3′, 预计扩增片段为793 bp。
1.3.2 病料DNA样本的提取
取待检鸡的肝脏分别剪碎, 按1∶5的比例加PBS研磨组织匀浆液, 10 000 r/min离心10 min;取上清液300 μL按蛋白酶-K法提取DNA样本。取血液250 μL用Trizol液裂解, 加酚–氯仿–异戊醇抽提2次, 吸取上清液加2倍体积无水乙醇和1/10体积乙酸钠沉淀, 抽干后加灭菌双蒸水溶解。
1.3.3 PCR反应条件的优化
通过PCR扩增得到目的条带, 对建立引物终浓度、MgCl2终浓度、退火温度和模板量进行摸索, 建立PCR的最佳反应体系。
1.4 PCR检测
对不同来源的病料样本进行PCR检测, 包括疑似病鸡肝脏样本10份、正常鸡肝脏样本13份、血液样本11份。反应体系 (50 μL) :10Buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL, 25 mmol/μL MgCl2 3 μL, 2.5 U/μL TaqDNA酶1 μL, 20 μmol/μL上、下游引物各1 μL, 模板DNA 1 μL, ddH2O 37 μL。PCR反应条件:95 ℃5 min;94 ℃30 s, 52 ℃1 min, 72 ℃1 min, 共34个循环;72 ℃10 min。然后取6 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.5 PCR产物的克隆与序列测定
1.5.1 重组质粒的PCR和酶切鉴定
为确定PCR产物的特异性, 按照DNA胶回收试剂盒说明书回收3个样本PCR产物;将回收产物与pMD18-T载体连接, 转化感受态大肠杆菌DH5α, 用蓝白斑法筛选重组质粒, 按1.4中的反应条件进行PCR反应, 取6 μL产物进行电泳, 并用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行酶切鉴定。
1.5.2 重组质粒的序列测定与分析
挑取其中2份样品送宝生物工程 (大连) 有限公司测序, 并与GenBank中的已发表毒株进行比较。
2 结果
2.1 ALV-J血清抗体的检测结果
通过ALV-J间接酶联免疫吸附试验对11份血清进行检测, 检出抗体阳性鸡血清6份。
2.2 PCR反应体系的优化结果
试验确定的最佳PCR反应条件为引物终浓度0.4 μmol, MgCl2终浓度1.5 μmol, 退火温度52 ℃, 最小检出量7.5 ng。
2.3 不同病料样品禽白血病病毒病原核酸检出率
通过优化的PCR方法对待检样品进行禽白血病病毒核酸扩增, 从部分病料中扩增出1条793 bp的条带, 与预期扩增长度相符, 结果见图1。不同养殖场的ALV–J抗体阳性鸡血液样本、ALV–J抗体阴性鸡血液样本、疑似病例肝脏样本和正常鸡肝脏样本中病原核酸检出率分别为50.0% (3/6) 、0 (0/5) 、90.0% (9/10) 和61.5% (8/14) 。
1～6.疑似病鸡肝脏组织;7～12. 正常鸡肝脏组织;M.200 bp Marker;13～18 .ALV-J抗体阴性血液样本;19～23.ALV-J抗体阳性血液样本。
2.4 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定结果
对禽白血病病毒的PCR产物经回收、连接、转化, 提取重组质粒;重组质粒的PCR产物进行电泳得到与预期相符的793 bp的片段 (见图2) 。重组质粒的产物经限制性内切酶HindⅢ和BamH Ⅰ进行酶切, 得到与预期结果相符的片段 (见图3) 。
1～3.质粒DNA;4. 200 bp Marker;5～7. 质粒DNA PCR产物。
1～3. 质粒DNA/Hind Ⅲ+BamHⅠ;4.200 bp Marker。
2.5 重组质粒的序列测定与分析结果
对2株构建的重组质粒进行序列测定与分析, 两者同源性达98.5%。将扩增的片段序列与已发表的SD0501、NX0101株核苷酸序列进行同源性比较, 同源性分别为99.2%、97.6%。证实待检鸡病料中确实含有禽白血病病毒核酸。
3 讨论
试验直接从组织中提取DNA, 并成功扩增出了禽白血病病毒核酸P27基因核酸片段, 证明直接从组织中提取DNA进行禽白血病病毒核酸PCR检测是可行的, 且PCR较RT-PCR省时省力, 值得临床应用。
试验使用ALV-J间接酶联免疫吸附试验试剂盒筛选出了6份ALV-J抗体呈阳性的肉鸡, 并以其血液作为病料提取DNA进行PCR扩增, 结果有3份血液样本未扩增出相应片段, 表明在自然条件下的感染鸡存在感染不排毒的情况, 具有潜在的威胁性;在临床应用中, 单纯以血液为样本提取DNA做核酸检测无法判断此类鸡群的存在, 需要结合血清学检测才能全面地说明鸡群的感染情况。
从鸡体中分离的禽白血病病毒有A、B、C、D、E、J 6个亚群, 其中A、B、C、D属于外源性禽白血病病毒;E亚群为广泛存在没有致病性的内源性病毒[2], P27基因是禽白血病病毒群特异性抗原基因, 用针对P27基因设计的引物进行禽白血病病毒核酸检测可以确定禽白血病病毒核酸的存在, 但不能区分不同亚群。此次笔者从外观正常鸡的肝脏样本中检测出了一定比例的禽白血病病毒核酸, 其中有可能是检测到内源性的E亚群病毒, 因此需要确定鸡群中是否存在致病的禽白血病病毒感染仍需进一步研究。
参考文献
[1]张立成, 关云涛, 陈洪岩, 等.应用RT-PCR技术检测禽白血病病毒及其在不同组织中检出结果的比较[J].中国实验动物学杂志, 2002, 12 (5) :303-305.
圈养小熊猫几种病毒的PCR检测 第5篇
本文采用巢式PCR/RT-PCR方法,对我国10个动物园中无临床症状的圈养小熊猫的71个肛拭子和61个唾液拭子样品,进行犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒(CAV)和犬疱疹病毒(CHV)的检测,以评估我国圈养小熊猫是否面临这几种病毒的威胁.对阳性PCR结果进行测序分析,并与GenBank上的序列进行比较.结果,在肛拭子样品中检测到3个CPV和6个CCV阳性结果,经测序后,与GenBank上序列的同源性分别达99%和100%.而在唾液拭子样品中没有检测到任何阳性结果,且CDV、CAV和CCV的.检测结果均为阴性.从阳性CPV的肛拭子样品中分离到一株细小病毒毒株,表明圈养小熊猫已受到细小病毒和犬冠状病毒的感染,今后应加强这两种病毒的预防工作.本文所采用的PCR方法检测病毒性疾病,能检测到微量的病毒模板,可对小熊猫病毒性感染进行早期诊断.
作 者：秦琴 张陕宁 李明 魏辅文 QIN Qin ZHANG Shanning LI Ming WEI Fuwen 作者单位：秦琴,QIN Qin(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080;中国科学院研究生院,北京,100049)
张陕宁,ZHANG Shanning(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080;中国野生动物保护协会,北京,100080)
李明,魏辅文,LI Ming,WEI Fuwen(中国科学院动物研究所动物生态与保护生物学重点实验室,北京,100080)
PCR检测 第6篇
关键词：PCR技术 食品检测 微生物 多重PCR技术
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0014-02
1 概述
PCR多聚酶链式反应（polymerase Chain Reaction），是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术。自从其问世就快速的应用于食品科学的许多领域中。
2 PCR技术
2.1 PCR技术的原理和基本步骤
2.1.1 PCR技术的原理
PCR技术的基本原理是在体外对已知的，待扩增的双链DNA片段，人工合成与该DNA两条链末端互补的两条寡核苷酸引物，在体外将待检的DNA序列在酶促作用下进行高效扩增。
2.1.2 PCR技术的主要检测步骤
PCR技术的主要检测步骤包括：运用化学手段对目标DNA提取，设计并合成引物，进行PCR扩增，克隆并筛选鉴定PCR产物，DNA序列分析。
2.2 PCR技术的优点
（1）快速，PCR技术用于食品检测，仅一天就能完成检测。（2）灵敏，PCR技术能够比较准确的检测出食品中的微生物，可以避免传统检测分离所有微生物的困难。（3）操作方便，PCR技术检测食品的操作简单方便，仅一人就能完成检测。
3 PCR 技术在食品检测中的应用
3.1 食品中成分种类及有效成分的检测
进行食物中动物成分种类的鉴定，是为了防范某种特定的动物病，例如：上个世纪的疯牛病，食品、药品、饲料中的牛源性成分开始受到严格限制，2004年，李林等应用PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成分种类。进行食品有效成分的检测是因为食品中各种营养成分有了数字指标。特别是对于那些加工后的食品，如果通过传统的方法，不能判断出食材的优劣以及相关成分，而PCR技术则不受限，对于加工后的产品有效成分的鉴定有重要的作用。
3.2 PCR技术在食品微生物检测中的应用
3.2.1 PCR技术检测食品微生物的优势
PCR技术的优势是监测时限短，操作简单，灵敏度高。例如在单核细胞增生李斯特氏菌检测中，在金黄色葡萄球菌的检测中，在顽固性梭状芽孢杆菌的检测中都显现出较之传统技术其具有极高的特异性和敏感性的特点。
3.2.2 传统PCR技术及其在食品微生物检测中的应用
PCR技术在食品检验中最早是用来监测食品中的病原体，但是传统PCR检测技术需要依赖不同类型的后处理过程来解决假阳性污染和定量准确度的难题。而且处理过程繁琐，可能产生有害物质，影响操作者的健康，所以近年来，PCR改进技术迅速发展起来，通常采用传统常规型与改进型相结合的方法进行研究。
4 PCR 改进技术在食品检测中的应用
4.1 实时定量PCR技术及其在食品检测中的应用
实时定量PCR技术是在反应体系中加入荧光染料或者荧光探针，通过信号的积累来监测整个进程，然后再通过标准曲线对未知的模板进行定量分析的方法。有很多优点：快速灵敏，操作方便，全封闭反应，减小环境污染，不使用有毒试剂，操作安全，定量准确，监测结果直观等优点。
4.2 多重PCR 在食品检测中应用
4.2.1 多重PCR技术在食品病原微生物检测中的应用
食品污染的病原菌包括多种，例如：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌等。在检测时，易受其他微生物和本身的变异株的干扰。使实验结果呈现出假阳性和准确率低的现象。目前研究多采用多重PCR检测。如：肠出血性大肠杆菌利用多重PCR检测与传统的血清学方法检测相比，更高效灵敏。沙门氏菌利用多重PCR检测，可以提高食品沙门氏菌的检测率，还可以鉴定沙门氏菌的血清型和突变情况。金黄色葡萄球菌利用多重PCR检测，虽然检测结果与免疫学检测结果基本一致，但是多重PCR还可以检测一些免疫学方法不能检测的肠毒素基因。多重PCR在复杂的食品样品检测中有很好的重复性和高度的敏感性表明其是检测食品致病菌的可行性方法。
4.2.2 多重PCR技术在食品非致病菌检测中的应用
乳酸菌（LAB）是真空环境下存在的主要微生物，对致病菌的生长有着较强的抑制作用，但是乳酸菌的存在也是食品腐败的信号。乳酸菌在真空的包装中含量一般都很低，Yost等（2000）用16S rRNA、16S-23S rRNA ISR建立多重PCR检测与真空包装牛肉产品腐败相关的乳酸菌，Kye等（2006）用种特异性基因代替16S rRNA设计引物同时检测韩国泡菜发酵过程中的10种重要的LAB，随发酵的时间和菌群的变化多重PCR的检出率不断提高，试验建立的多重PCR技术重复性好，同时又解决了16S rRNA不能有效检测韩国泡菜乳酸菌的问题。
5 PCR技术在应用过程中可能存在的问题及解决方法
5.1 应用过程可能存在的问题
样品的预处理、样品DNA的提取等具体的操作过程可能会遇到不同的问题，PCR的反应过程中具体的操作，比如确定退火的温度、适温延伸时间的长短和循环数的确定等问题都是复杂的。
5.2 解决方法
在不同的反应体系中，为避免假阴性、假阳性的现象的出现，应该确定好与之相适应的反应条件。试验操作要规范化。在检测前，要进行预实验来进一步完善检测方法。
6 结语
PCR检测技术作为现代生物学技术的手段应用于食品检测，克服了传统检测方法的缺点和不足，尤其方便快捷，灵敏度高的特点，如果可以克服其缺点，前景一定会很广阔。
参考文献
[1]刘红芳，宋慧. PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用[J].现代化农业，2012，26（5）：34-36.
犬细小病毒PCR检测方法的建立 第7篇
为了进一步解决CPV在临床上的快速诊断问题, 针对VP2基因设计特异引物[2], 预扩增片段大小990bp, 并通过条件优化试验确定合适退火温度、引物浓度、合适Mg2+浓度等, 建立一个特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV核酸的PCR方法。
1 实验材料与设备
疑似犬细小病毒病的犬粪便、犬细小病毒CPV、犬流感病毒CIV、犬瘟热病毒CDV, 以及犬副流感病毒CPIV、缓冲液、Taq DNA聚合酶、d NTPs (each 10mmol/L) 、d NTPs (each 2.5mmol/L) 、DL2000 DNA Marker、实验仪器等。
2 实验方法
(1) 引物合成。根据Gen Bank中登录的犬细小病毒序列[DQ903936], 针对其VP2基因, 设计引物:CPV上游引物5-GTTCTGGGGGTGTGGGGATTT-3;下游引物5-CTCCCCCCCGTCCTGCTGCAA-3, 预扩增片段大小990bp。用dd H2O将引物稀释为20μmol/L, -20℃保存备用。
(2) 目的基因产物的PCR扩增。将以上成分混匀后, 在UNO-II型核酸扩增仪运行。运行程序如下。
94℃3min, 1个循环。94℃1 min, 55℃1 min, 72℃90s;30个循环。72℃8min, 1个循环。
在PCR扩增程序运行时, 设立不加模板的阴性对照。反应结束后, 取3μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L EB) 进行电泳检测。
(3) PCR产物电泳检测。取PCR产物5μL加入Loading Buffer 1μL混匀, 加到1%琼脂糖凝胶的点样孔中, 并设置分子量参照标准DNA Marker DL2000。先用100V电压, 50m A电流进行电泳, 待PCR产物进入凝胶后, 再以80V电压, 40m A电流继续电泳, 直到PCR产物进入凝胶一定距离后 (约30min) , 再进行凝胶成像拍照分析。
(4) 特异性实验。根据建立的犬细小病毒PCR检测方法, 抽提犬流感病毒RNA、犬瘟热病毒DNA, 以及犬副流感病毒RNA, 并进行反转录制备模板加入到犬瘟热病毒RT-PCR反应体系中进行扩增, 同时设阳性对照, 对PCR产物进行电泳, 检测该方法的特异性。
(5) 敏感性实验。抽提病毒DNA, 运用核酸蛋白测定仪进行DNA含量测定, 定量的DNA依10倍梯度依次进行稀释, 将稀释后的DNA进行PCR反应, 对PCR产物进行电泳, 检测该方法的敏感性。
(6) 临床样品检测。对疑似犬细小病毒病的15例犬粪便进行临床检测。
3 结果
(1) 特异性实验结果。分别以犬瘟热病毒 (CDV) 、犬流感病毒 (CIV) 、犬细小病毒 (CPV) 和犬副流感病毒 (CPIV) 作为样品, 同时设立阴性对照作PCR特异性检测, 结果以CPV阳性样品为模板的泳道出现明显的大小约为990bp的扩增产物, 其他样品呈阴性。结果表明, 引物对CPV具有专一性, 可区分与犬细小病毒症状相似的一些疾病。
(2) 敏感性检测结果。运用建立的犬细小病毒PCR方法对犬细小病毒进行敏感性检测。结果该引物对犬细小病毒DNA的最低检出量达到10pg, 表明该检测方法对病毒目的基因扩真具有很高的敏感性。
(3) 临床样品检测。在15例疑似犬细小病毒的临床病料检测中, 能够检测出特异性病毒的结果显示, 有13例出现大小约为990bp扩增片段, 阳性检出率约为86.66%。
通过针对VP2基因设计特异引物, 成功建立了特异性好、敏感度高、快速简便检测CPV核酸的PCR方法。
参考文献
[1]刘忠华, 钟翎, 贺星亮, 等.用PCR技术鉴定犬细小病毒弱毒疫苗株[J].中国兽医学报, 2003, 23 (5) :444-446.
天然皮革定性PCR检测方法的研究 第8篇
D N A (脱氧核糖核酸, deoxyribonucleic acid) 在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合包括离子键、氢键、范德华力等, 破坏或降低这些结合力, 就可以将核酸与蛋白分开。一般采用SDS (十二烷基磺酸钠, sodium dodecyl sulfate) 、蛋白质变性剂 (如盐酸胍、异硫氢酸胍) 、蛋白酶等。去除蛋白质通常采用有机溶剂酚和氯仿。当它们与含核酸和蛋白的水溶液一起振摇时, 可形成乳浊液, 酚和氯仿使蛋白质变性并与核酸分离。离心后可分成两相, 一般上层为含有核酸的水, 下层为有机相, 分界处为变性凝聚的蛋白质。含核酸的水相常用乙醇、异丙醇等有机试剂对核酸进行沉淀[1]。
D N A和R N A (核糖核酸, ribonucleic acid) 所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有紫外吸收的性质, 吸收峰在260nm处, 所以可以用紫外分光光度法测定DNA浓度。
采用PCR (多聚酶链式反应, polymerase chain reaction) 技术, 可以在体外模仿DNA的天然复制过程, 使得提取得到的DNA大量扩增, 以达到试验要求。根据扩增出来不同物种的特异性DNA片段的分子量的不同, 从而对物种进行区分。
因皮革中DNA破坏严重, 降解程度大, 常规的DNA提取方法所提得的DNA含量远远达不到做PCR的浓度, 因此将其分为粗提取和纯化的步骤。
1试验部分
1.1仪器设备
高温高压灭菌锅、医用冷藏冷冻冰箱、超纯水制备机、恒温水浴锅、水平振荡器、高速低温离心机、生物超净工作台、涡旋振荡器、万分之一天平、核酸蛋白分析仪、PCR仪、微波炉、电泳仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪。移液枪 (0.2~2μL、2~20μL、10~100μL、20~200μL、1000μL) 。
1.2试剂和材料
氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、二水乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na22H2O) 、胰蛋白酶、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、七水合硫酸镁、三氯甲烷、无水氯化钙、葡萄糖、酚红、异戊醇、苯酚、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇、无水乙醇、十二烷基磺酸钠、冰乙酸、蔗糖、葡萄糖, 分析纯或以上纯度。
1.3技术路线
技术路线见图1[1,2,3,4,5]。
1.4 PCR扩增
同时设置阳性对照和空白对照, 每个反应体系设置双平行。在进行未知样品检测时, 可以粗率进行判断后加入疑似的一种或者几种特异性引物, 以提高检测效率。PCR反应体系[1,4]、PCR反应循环, 如表1、表2。
注:所用试剂均为上海生工生物工程有限公司产品。
1.5扩增产物电泳检测
(1) 称取适量的琼脂糖加入1TA E缓冲溶液, 配制成浓度为1.5% (w/v) 或者2.0% (w/v) 的溶液。放在微波炉或电炉上加热至琼脂糖完全熔化, 取出摇匀。加热过程中要不时摇动, 使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜, 以减少水分的挥发。
(2) 冷却至50℃左右时, 将琼脂糖溶液倒入胶槽时, 使胶液形成均匀的胶层。倒胶时温度不宜过高, 防止胶槽因为温度过高损坏;温度也不宜过低, 否则凝固不均匀;速度不可过快, 否则容易形成气泡。待胶凝固完全后拔出梳子, 注意不要损伤梳底部的凝胶。
(3) 将胶放入电泳槽, 加入1TAE缓冲溶液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应, 样品槽附近会有一些隆起, 阻碍缓冲液进入样品槽, 所以要保证样品槽内注满缓冲液。
(4) 取20μL扩增后产物溶液与4μL上样缓冲液混匀, 用微量移液器取10~20μL小心加入样品槽。如果DNA浓度偏低, 可以按上述比例增加上样量, 但是总量不可以超过样品槽容量。每加完一个样品更换枪头, 防止相互污染。上样时要小心操作, 避免损坏胶板或将样品槽底部凝胶刺穿。
(5) 加完样后, 盖上电泳槽, 立即接通电源。控制电压在60~80V, 电流在40m A以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时, 停止电泳。
(6) 将电泳完毕的胶板移入0.5μg/m L的EB (溴化乙锭, ethidium bromide) 溶液中, 室温染色15~20min。
M:从上到下片段为:300、250、225、200、175、150、125、100、75、50、25bp Z:猪皮革N:牛皮革Y:羊皮革
M:从上到下片段为:225、200、175、125、100、75、50、25bp CK:阴性对照N-1、2:牛皮革N-3:牛肝脏Y-1、2:羊皮革Y-3:羊肝脏Z-1、2:猪皮革Z-3:猪肝脏
M:从上到下片段为:400、350、300、250、200、150、100、50bp CK:阴性对照标-1~3:牛肝脏NP-1~4:牛皮革
M:从上到下片段:400、350、300、250、200、150、100、50bp CK:阴性对照标-1、2:羊肝脏YP-1、3、4羊皮革
(7) 在波长为254nm紫外灯下观察染色后电泳胶板, 记录电泳结果。
1.6结果分析
(1) 真核生物内源基因检测
用针对真核生物18S r RNA基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR扩增, 以真核生物基因组DNA作为阳性对照, 阳性对照和待测样品均应扩增出137bp的PCR产物, 阴性对照和空白对照应不能扩增得到相应的PCR产物。如待测样品未见有该PCR扩增产物, 则说明DNA提取质量有问题, 或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在, 应重新提取DNA, 直到扩增出该PCR产物。
(2) 牛、羊、猪内源基因的检测
对样品DNA提取液进行牛内源基因的PCR扩增, 以牛基因组DNA作为阳性对照, 如果空白对照未出现扩增条带, 阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带, 则可初步判定待测样品为牛皮革, 应进一步进行确证试验, 依据确证试验的结果形成最终报告;如果待测样品未出现PCR扩增产物, 则可断定待测样品为非牛皮革。
对样品DNA提取液进行羊内源基因的PCR扩增, 以羊基因组DNA作为阳性对照, 如果空白对照未出现扩增条带, 阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带, 则可初步判定待测样品为羊皮革, 应进一步进行确证实验, 依据确证试验的结果形成最终报告;如果待测样品未出现PCR扩增产物, 则可断定待测样品为非羊皮革。
对样品DNA提取液进行猪内源基因的PCR扩增, 以猪基因组DNA作为阳性对照, 如果空白对照未出现扩增条带, 阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带, 则可初步判定待测样品为猪皮革, 应进一步进行确证试验, 依据确证试验的结果形成最终报告;如果待测样品未出现PCR扩增产物, 则可断定待测样品为非猪皮革。
(3) 确证试验
当PCR检测结果为阳性时, 可通过实时荧光定量PCR方法或其它方法 (如测序比对方法) 进行确证。
1.7天然皮革样品的检测情况
为了鉴定本标准方法是否适用于皮革样品的检测工作, 随机抽取了3份猪皮革样品、5份牛皮革样品和5份羊皮革样品进行PCR检测。
提取的3份猪皮革样品、5份牛皮革样品和5份羊皮革样品的基因组DNA电泳图谱如图2所示。电泳结果表明, 应用本标准方法可从皮革样品中提取获得较多的基因组信息, DNA提取效果较理想。
1.8 18Sr RNA基因引物对提取的皮革DNA进行PCR扩增
为验证提取的皮革DNA是否适合于进行PCR检测, 采用18Sr RNA基因引物对提取的皮革DNA进行PCR扩增。PCR产物电泳结果如图3所示, 空白对照试验没有出现扩增条带, 表明DNA在提取及扩增过程中未受到外源DNA分子的污染。与DNA marker对照, 所提取的6份皮革样品中均扩增出目的片段, 与预期相符。结果表明, 本方法所提取的皮革DNA的质量较高, 可扩增出真核生物18Sr RNA基因片段。
1.9皮革基因成分定性PCR检测
为了确定所提取的皮革样品的种类, 采用特异性基因扩增引物对皮革DNA进行PCR扩增, PCR产物电泳结果如图4~图6所示。图4结果显示所提取的5份牛皮样品中含有牛源性基因。图5结果显示所提取的4份羊皮样品中含有羊源性基因。图6结果显示所提取的7份猪皮样品中含有猪源性基因。
M:从上到下片段为:400、350、300、250、200、150、100、50bp CK:阴性对照标-1、2:猪肝脏ZP-2~7猪皮革
2结论
采用改进的DNA提取方法 (大量粗提取后纯化, 使DNA在质和量上都达到做PCR的要求) 从经过鞣制的皮革中提取DNA, 利用PCR技术、DNA探针和实时荧光定量PCR等技术, 对常见的几种皮革的种类进行定性分析。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 通过对比阳性样品、空白对照以及Marker的电泳条带位置, 可以定性判断皮革的种类。
摘要：采用改进的DNA提取方法, 从经过鞣制的皮革中提取DNA, 大量粗提取后纯化, 使DNA在质和量上都达到做PCR的要求。利用PCR技术、DNA探针和实时荧光定量PCR等技术, 对常见的几种皮革进行定性分析。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 通过对比阳性样品、空白对照以及Marker的电泳条带位置, 定性判断皮革的种类。
关键词：天然皮革,DNA提取,PCR扩增
参考文献
[1]沃兴德, 范春雷, 丁志山.生物学实验教程[M].杭州:浙江教育出版社, 2004
[2]兰宏, 王文, 施立明.麂属动物陈旧皮张样本的DNA提取及PCR扩增[J].动物学研究, 1995, 16 (2) :146-152
[3]朱玉贤, 李毅, 郑晓峰.现代分子生物学[M].北京:高等教育出版社, 1997
[4]Weaver R F.Molecular Biology[M].USA:McGraw Hill Higher Education, 2011
PCR检测 第9篇
1 材料与方法
1. 1 弓形虫虫株及菌株
弓形虫国际标准强毒株RH速殖子, 由南方医科大学免疫抗体工程研究所惠赠, 小白鼠传代保种; 大肠杆菌O157∶ H7、沙门氏菌, 由东莞市动物疫病预防控制中心实验室分离、鉴定、保存。
1. 2 样品来源
野生老鼠共32 只, 分别采自东莞市常平镇三鸟批发市场和东莞市厚街屠宰场; 猪淋巴结, 采自东莞市万江区屠宰场, 共50 份。
1. 3 检测试剂
弓形虫荧光PCR试剂盒 ( 批号为2014002) , 中山大学达安基因股份有限公司生产; DNA试剂盒, 美国Promega公司生产; 蛋白酶K, Ta Ka Ta公司生产; 吉姆萨染色液, 北京鼎国生物技术有限公司生产。
1. 4 试验动物
试验小白鼠 ( 合格证明编号为44002100002586) , 由南方医科大学实验室动物中心提供。
1. 5 弓形虫RH株和阳性样品人工感染
弓形虫的复苏、传代、收集和计数参照参考文献[4,5]进行。弓形虫RH株攻虫为小白鼠, 分成2组, 每组10 只, 接种量为100 个/只, 腹腔接种, 对照组不接种, 小白鼠攻虫前后自由给水、采食。阳性样品研磨后加双抗, 3 000 r/min离心去上清液, 腹腔接种小白鼠。
1. 6 人工小白鼠腹水和内脏组织的镜检
取感染弓形虫小白鼠的腹水和组织涂片用吉姆萨染色后镜检。涂适量大小 ( 约1 cm) 的组织涂片, 等其干燥; 用滴管将2 ~ 3 滴甲醇滴于涂片上; 甲醇挥发后将5 ~ 8 滴吉姆萨染色工作液加于涂片上, 轻轻用手摇匀染色液使其覆盖整个涂片, 静置30 min;30 min后用水冲洗2 min, 晾干, 镜检。
1. 7 样品DNA的提取
1.7.1腹水的消化裂解
弓形虫RH株经小鼠传代, 从其腹水收取弓形虫速殖子, 计数后按Promega试剂盒Wizard SV Genomic DNA Purification System使用说明书, 将含有弓形虫虫株的小鼠腹水样品12 000 r / min离心1 min, 弃上清液, 保存在1. 5 m L EP管底部的沉淀, 加入275 μL消化反应体系, 结果见表1。混匀后置于37 ℃水浴锅中消化过夜。
1.7.2组织的消化裂解
分别取人工感染组小白鼠、对照组小白鼠、野生老鼠的内脏组织 ( 心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏) 、猪淋巴结组织约50 mg, 剪碎, 加入1. 5 m L PBS液, 在- 80 ℃ 和37 ℃ 水浴中反复冻融3 ~ 5 次, 每次3 ~ 5 min, 加玻璃珠约占体积的1 /3, 漩涡振荡30 min。加入275 μL消化反应体系, 结果见表2。混匀后置于37 ℃水浴锅中消化过夜。
μL
μL
1.7.3 DNA的提取
消化好的虫体悬液、样品和菌株按Promega试剂盒Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System使用说明书提取DNA。 取250 μL Wizard SV Lysis Buffer加入水浴消化后的离心管中 ( 组织消化样品, 可将液体换到新的离心管中, 然后再加Wizard SV Lysis Buffer) 漩涡振荡, 混匀。取微型柱 ( Sv. minicolumns) 置于收集管中, 将样品移入柱中, 13 000 r/min离心4 min。离心后弃收集管中的液体, 向微型柱中加入650 μL Wizard SV Wash Solution, 13 000 r / min离心2 min。离心后弃收集管中的液体, 将微型柱放回收集管中, 重复上一步骤清洗4 次。最后一次离心后, 弃收集管中的液体放回微型柱, 13 000 r/min空离心3 min, 甩干管壁。将微型柱放到新的1. 5 m L离心管中, 加入30 μL Nuclease - Free Water, 室温放置2 min, 然后13 000 r / min离心2 min。 再加入30 μL Nuclease -Free Water, 室温放置2 min, 然后13 000 r / min离心2min。弃微型柱, 用封口膜封好离心管, 将所提DNA样品置于-20 ℃ 冰箱中保存, 备用。弓形虫RH株经小鼠传代后腹水提取的DNA供特异性和敏感性试验。
1. 8 荧光PCR方法
按照弓形虫PCR反应液40 μL、Taq酶3 μL配制反应体系, 分别加入2 μL DNA提取液、阴性对照、临界质控样品和强阳性质控样品。PCR反应条件:93 ℃ 2 min; 93 ℃ 45 s, 55 ℃ 60 s, 共10 个循环;93 ℃ 30 s, 55 ℃ 45 s, 共30 个循环。结果判定, 阴性质控无扩增曲线或Ct值等于30, 阳性质控Ct值小于27, 结果成立。
1. 9 敏感性试验
用上述DNA制备法提取的弓形虫DNA, 以10倍递减稀释成含1 000, 100, 10, 1 个速殖子的DNA后, 用上述荧光PCR方法检测其敏感性。
2 结果与分析
2. 1 弓形虫RH株和阳性样品人工感染情况
试验将小白鼠分成两组, 每组10 只, 一组为攻虫组 ( 5 只接种RH株、5 只接种阳性样品) , 另一组为健康对照组, 感染后小白鼠的精神状态记录, 结果见表3。感染后第5 天, 攻虫小白鼠被毛散乱无光泽、精神萎靡、弓背、腹部膨大、颤动等症状, 健康小白鼠喜食、活泼面。说明小白鼠易感染弓形虫, 这次人工感染试验成功。
2. 2 人工感染小白鼠腹水和内脏组织的镜检结果
人工感染的小白鼠5 d后处死取腹水和内脏组织涂片经过吉姆萨染色后, 在显微镜下观察涂片, 用40 倍目镜, 100 倍油镜, 可看见一端较尖, 一端较钝圆呈新月型弓形虫速殖子 ( 见266 页彩图1) , 说明人工感染试验成功。
2. 3 弓形虫荧光PCR特异性试验检测结果
试验中检测弓形虫RH株样品DNA、大肠杆菌样品DAN、沙门氏菌样品DNA, 强阳性质控、临界阳性质控和阴性质控成立, 弓形虫RH株检测结果为阳性, Ct值为15. 34, 大肠杆菌和沙门氏菌均无扩增曲线, 检测结果均为阴性, 检测结果见表4。说明荧光PCR方法具有较高的特异性。
2. 4 弓形虫荧光PCR敏感性试验
试验将提取的弓形虫DNA以10 倍递减稀释成含1 000, 100, 10, 1 个速殖子的DNA后, 用弓形虫荧光PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子 ( 见表5) 。说明荧光PCR方法具有高度的敏感性。
2. 5 动物试验检测结果
随机抽取5 份人工感染的小白鼠不同组织样品, 分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏, 采用荧光PCR方法检测, 结果均为阳性 ( 见表6) , 扩增曲线见图2。其中心脏Ct值为6. 78, 肝脏Ct值为3. 21, 脾脏Ct值为2. 41, 肺脏Ct值为3. 38, 肾脏Ct值为7. 12。随机抽取5 份健康组的小白鼠不同组织样品, 分别为心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏, 用荧光PCR方法检测, 结果均为阴性。表明小白鼠内脏组织均能感染弓形虫, 脾脏的Ct值最低, 说明弓形虫在脾脏中的含量最高, 依次为肝脏、肺脏、心脏、肾脏。
1.脾脏;2.肝脏;3.肺脏;4.心脏;5.肾脏;6.强阳性质控;7.临界阳性质控。
2. 6 弓形虫荧光PCR方法临床样品检测结果
2.6.1东莞市野生老鼠组织弓形虫荧光PCR检测结果
试验检测的野生老鼠样品来源东莞市常平镇三鸟批发市场和东莞市厚街屠宰场, 不同野生老鼠组织样品共32 份, 荧光PCR检测阳性样品1 份, 阳性检出率为3. 12% ( 见表7) 。取阳性病料制成悬液后腹腔接种小白鼠, 小白鼠出现感染症状, 处死后取腹水涂片后镜检可见一端较尖, 一端较钝圆呈新月型弓形虫速殖子 ( 见266 页彩图3) 。
2.6.2东莞市万江区屠宰场猪弓形虫荧光PCR检测结果
试验检测的猪来源于东莞市万江区屠宰场, 随机抽取猪肺门淋巴结样品共50 份, 荧光PCR检测阳性样品0 份, 阳性检测率为0。
3 讨论
根据试验结果, 应用建立的弓形虫荧光PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子, 1 个弓形虫速殖子的检测结果为可疑, 而对大肠杆菌O157∶ H7、沙门氏菌和对照组小白鼠内脏检测结果均为阴性, 与谢德华等[6]建立的PCR方法的敏感性差异不大。在检测感染的弓形虫小白鼠的内脏中, 脾脏的Ct值最低, 为2. 41, 说明弓形虫在脾脏中的含量最高, 依次为肝脏、肺脏、心脏、肾脏。结果表明, 试验建立的弓形虫荧光PCR方法具有特异、敏感、快速、操作简便等特点, 适合动物组织弓形虫的大规模监测。
根据临床样品的检测结果, 在野生老鼠中检出1 份阳性样品, 经过动物回归试验后, 镜检观察到弓形虫的速殖子, 说明东莞市野生老鼠存在感染的情况。张端秀等[7]应该正向间接血凝试验, 在2005—2006 年对东莞市犬、猫血清学调查中, 犬的抗体阳性率为0. 66% , 猫为0。徐斌等[8]应用ELISA对重庆地区猪弓形虫抗体进行检测, 检测结果为75. 95% 。陈淑芳[9]应用ELISA宁波某地猪弓形虫血清阳性率进行检测, 平均达到28. 40% 。肖芳萍等[10]应用正向间接血凝试验对贵阳地区猪弓形虫进行检测, 抗体阳性率为16. 06% 。于迪等[11]应用正向间接血凝试验对辽西地区宠物弓形虫抗体进行检测, 阳性率为14. 2% 。翟佳等[12]应用正向间接血凝试验对武汉家犬弓形虫抗体进行检测, 阳性率为13. 4% 。各地对弓形虫抗体的血清学调查结果不同, 差异较大, 但均反映了动物不同程度感染弓形虫的情况。李亚丽等[13]用建立的PCR方法检测漯河市菜市场的猪肉, 检测弓形虫阳性8 份, 阳性率为4% 。邵晓冬等[14]应用PCR方法对洛阳地区病死猪的检测阳性率为18.5% , 屠宰猪阳性率6. 7% 。本试验应用建立的荧光PCR方法对屠宰场采集的50 份猪淋巴结进行检测, 检测结果为阴性, 未检出猪淋巴结阳性样品可能与采集的样品数量少和场点少有关, 将在以后的监测中加大样品的监测数量和监测范围。
我国人口的弓形虫感染率低于欧美等国家, 可能与中国人肉类食品消费量低, 且多为熟食方式有关[15]。我国今后的弓形虫感染方式可能会逐渐变化, 与进食感染肉类的关系将逐渐加重, 因此试验使用近年发展起来的荧光PCR技术应用于动物组织的弓形虫检测, 为弓形虫病的防控提供依据。
布鲁氏菌PCR快速检测方法的建立 第10篇
本研究通过设计引物, 优化条件, 建立了可以快速准确地检测布氏菌属的PCR方法。
1 材料
1.1 菌株
1.1.1 布鲁氏菌菌株
B.abortus 544A和104M;B.melitensis:Rev-1和16M;B.Suis S2和1330S;B.canis RM6/66;B.ovis 63/290;B.neotomae 5K33标准株, 由中国预防医学科学院流行病学微生物所布病室提供。
1.1.2 其他菌株
Y.enter O9来源与布氏菌相同, E.coli O157:H7和S.typhimriecm 47729由本室保存。
1.2 引物
按B.abortus 31 KD (BCSP-31) 蛋白基因设计P1、P2引物, 由大连Ta Ka Ra公司合成。
1.3 实验试剂
4 d NTP、Taq酶、RNA酶、蛋白酶K为Promega公司生产, 国内分装, SDS、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、氯化钠、Tris、EDTA等试剂均为国产分析纯。
1.4 主要仪器
PCR仪 (PTC-WOTM型) , JM In C., 高速台式离心机 (TGL, 16G) , 上海安亭离心机厂产品;电泳仪 (DYY-3型) , 北京六一仪器厂产品;紫外透射反射分析仪 (WP型) , 永嘉上塘教学仪器厂产品;凝胶自动成像系统, 英国UVA公司产品;可调式恒温水浴箱, 美国PA-LYST HUBER公司产品, 空气浴摇床 (HZS-H) , 哈尔滨市东联电子技术有限公司产品;恒温培养箱 (DHP-120) , 上海实验仪器总厂产品;微波炉 (HR-8805T) , 青岛海尔微波制品有限责任公司产品;移液器 (P2-1000) , 法国洁尔森公司生产。
2 方法
2.1 细菌DNA提取
2.1.1 煮沸法
各菌株培养物以三馏水制成菌悬液, 经100℃煮沸10 min, 12 000 r/min, 离心10 min, 取上清即可用于PCR扩增反应。
2.1.2 酚提法
各菌株培养物加入ST液, 制成菌悬液, 然后加入Na Cl液、TE液、SDS、RNA酶、蛋白酶K处理, 再加入重蒸饱和酚、氯仿异戊醇、再经乙醇沉淀等步骤即可备用。以紫外分光光度计测DNA含量。
2.1.3 试剂盒法
该试剂盒为Promega公司生产, 按照说明进行提取。
2.2 反应程序
总反应为25μl体系, buffer2.5μl, 4 d NTP 1μl (10 m M) , B4、B5引物 (10 pmol/μl) 各1μl, DNA 1μl (96.7 ng/μl) , 双馏水17.5μl, 瞬间离心煮沸10 min, 加入Taq E、液体石蜡。95℃作用5 min, 进入循环, 93℃变性30 s, 62℃退火30 s, 72℃延伸1min, 共计30个循环, 然后72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳, 电压3~5 V/cm, 时间20~30 min, EB染色观察结果。PCR操作在PTC-100型PCR扩增仪上进行。
3 结果
3.1 3种DNA提取方法的比较
我们用煮沸法、酚提法和试剂盒提取法从104M菌株提取DNA进行试验, 其结果见图1, 由图1可见3种提取方法对B4、B5引物扩增结果影响不大。
3.2 Taq E对扩增的影响
以煮沸法从104M菌株提取的DNA为模板, 用不同Taq E量 (0.1 U、0.2 U、0.3 U、0.4 U、0.5 U、1.0 U、1.5 U、2.0 U) 进行扩增, 结果表明0.5 U以上均可以扩增, 0.4 U以下未见扩增, 1 U酶量最佳, 故在以后试验中均采用1 U酶量。
3.3 Mg2+浓度对扩增的影响
Mg2+浓度对PCR反应是有影响的。其他条件固定, 观察0.2～10 mM/L的Mg2+浓度, 其结果表明低于0.2 m M/L不产生扩增, 高于8 m M/L产生非特异扩增。
注:1.MARKER DL 2000;2.煮沸法提取DNA;3.酚提法提取DNA;4.试剂合提取法提取DNA。
3.4 d NTP对扩增的影响
检测20、40、60、80、100、200、400、800μmol/L d NTP浓度的扩增效果, 结果表明在40~400μmol/L均有特异性扩增。
3.5 扩增的特异性
对6个种的布氏菌株扩增和对非布氏菌种的扩增结果见表1, 对6种布氏菌的扩增结果见图2, 由图2表明, PCR对6个种均能扩增。对阴性对照菌的扩增见图3。
注:1.Re v-1;2.S2;3.104M;4.1330S;5.16M;6.544A;7.DL2000 Mar ker;8.阴性对照。
结果表明104M阳性对照有扩增, 未加模板阴性对照无扩增, 而Y.enter O9、S.Typhi及E.Coli.O157均无扩增。
3.6 反应的敏感性
以104M菌株DNA为模板, 将其稀释成不同剂量, 使其每微升含96.7、9.67、0.967、0.096 7、0.009 67、0.000 967、0.000 096 7 pg以引物扩增, 其结果见图4。
图3为特异性扩增注:1.Y.ent er O9;2.S.Typhi;3.104M阳性对照;Mar ker DL2000
注:1.Mar ker DL2000;2.96.7 pg;3.9.67pg;4.0.967pg;5.0.0967 pg;6.0.009 67 pg;7.0.000 967 pg;8.0.000 096 7 pg。
4 讨论
通过对B.abortus 31 KD (BCSP-31) 蛋白基因引物对6个种布氏菌进行PCR扩增试验, 其结果显示, 对布氏菌扩增具有良好的特异性。该引物对6个种布氏DNA都有清晰的扩增, 而对布氏菌有相同抗原、且具有强烈交叉反应的Y.enter O9、S.Typhi及E.Coli O157扩增反应呈阴性。尤其指出的是Y.enter O9菌与布氏菌属细菌血清交叉反应不仅滴度高, 而且是多方位的, 用各种血清学方法都不能区别, 本试验可以将其二者进行区别。
在对布氏菌DNA扩增敏感性检查看到, 最低可查DNA 0.096 7 pg/μl, 如果按每个细菌5 pg计算, 那么这对引物扩增的敏感性约为20个布鲁氏菌。同时在试验的过程中也出现了一些样品交叉污染, 出现了一些假阳性的结果, 因此在操作的过程中一定要注意样品污染的产生。
PCR检测 第11篇
材料选择
菌株。上海汉尼公司生产，菌种号为ATCC13706，肠炎沙门氏菌；上海汉尼公司生产，菌种号为ATCC7644，单增李斯特氏菌；上海汉尼公司生产，菌种为ATCC25931，宋氏志贺氏菌；深圳出口入境检验局生产，菌种号为03C0077708VB01稻叶型霍乱弧菌；本实验室分离保存，菌种是CC008，E.coliO157：H7。
试剂选择。上海生工生物工程技术公司生产的透析袋；厦门泰京生物技术有限公司的2xTaq PCR MasterMix与DNAma rker I；lgG，Dynal公司的Dyn-abeads M-280Sheep anti-Rabbit；兰州生物制品研究所选取的H7诊断血清和志贺氏菌属四种混合多价血；本デソカ生研株式会社产品为沙门氏菌A-F群“O”多价诊断血清、单增李斯特氏菌诊断血清和“OI”群霍乱弧菌诊断血清。
引物。核苷酸虚列可以表示成：
5，-AAACTCAAAGGAATTGAC GG-3，5，-GACGGGCGGTGTGTACAA-3。
方法
纯化免疫球蛋白。上述五种菌利用饱和硫酸沉淀法进行纯化。首先使用浓度为50%的硫酸铵纯化，然后再使用30%硫酸铵二次纯化。完成沉淀后，放置在PBS中沉淀，获得纯化IgG，对IgG浓度进行测定，调节浓度，低温储存备用。
制备免疫磁珠。将磁珠放人无菌离心管内，每管100微升，然后加入一定量牛血清蛋白液搅拌，将小管放置在磁架上静置两分钟，移除液体并充分洗涤，使用上述完成的缓冲液悬浮100微升，再计人100微升纯化好的IgG，缓慢振荡30分钟，充分洗涤，用悬浮液悬浮至100微升，放置在4摄氏度下备用。
捕获目的菌。将上述五种免疫磁珠离心管各取一支，在各个管内分别加入1毫升与抗体相对的各种菌液，细菌含量为103cfu/管，摇晃一小时，充分洗涤后加入管内液体，利用100微升的超纯水对致病菌磁珠悬浮其中。
检测磁珠捕获效率。在羊汤中加入沙门氏菌培养，菌落计数后，将其浓度调整到106fu/mL。取出沙门氏菌血清免疫磁珠各100、200、400微升，同时加入沙门氏菌细菌也充分振荡后进行洗涤，PBS悬浮到100微升后，按倍稀释。取出稀释度100微升的菌落计数，重复试验。将其中稀释最好的菌落作为细菌回收率。该细菌收回列表表示磁珠捕获细菌的回收率，并与空白磁珠进行比对。
提取细菌DNA。取出已经捕获的免疫磁珠，将其分被加入无菌离心管中。同时选取没有抗体的磁珠组作为对照，包被沙门氏菌抗血清且不会吸附致病菌的磁珠作为空白比对，实施沸水浴后，离心取上清，低温保存备用。
建立IMC-UPPCR。选取提取好的核算模板作为PCR反应。PCR反应体系为2×PCR反应液12.5微升，DNA模板10微升，上下游引物各0.5微升。在94摄氏度进行5分钟反应，52摄氏度进行1分钟，72摄氏度进行2分钟，循环进行35次，再在72摄氏度进行5分钟，将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
样本检测。检测样本分被利用IMC-UPPCR方法、GB/T4789.30-2003方法、國标GB/T4789.4-2008等对食品样品进行检测。主要对单增李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和0157：H7含量进行检测，验证IMC-UPPCR方法的正确性，重复两次实施检测，对比实验结果，计算符合率。
结果
免疫磁珠捕获效率。沙门氏菌和免疫磁珠反应后，可以对免疫磁珠菌落输进行计算。经过分析发现细菌回收率在80%。不同体积磁珠悬液体无差异，吸附后空白磁珠培养无菌落生长。
IMC-UPPCR。将肠炎沙门氏菌、稻叶型霍乱弧菌、单增李斯特氏菌等加入到抗体免疫磁珠离心管内部，可以发生UPPCR反应，结果具有差异片段，现实阴性对照和空白对照无白条。
特异性反应。将各种包被有血清的免疫磁珠谱或致病菌后，进行PCR反应。结果可显示特异性片段，非对应血清无特异片段出现。
样品检测结果。使用IMC-UPPCR方法完成检测后，可以发现，沙门氏菌和单增李斯特氏菌结果完全一致。大肠杆菌O157：H7均呈阳性；利用国标法检测两种样品呈现阴性。由此可说明，IMC-UPPCR和国标方法结果符合，且比国标方法敏感。
从上述分析可以看出，IMC-UPPCR方法完全可以应用到食品中致病菌的检测中，具有灵敏性高、特异性强和检测时间短暂等特点，保证了检测质量，提升了检测率，可以广泛应用到食品致病菌检测中。
PCR检测 第12篇
1 材料与方法
1.1 参考菌株
牛结核分枝杆菌参考菌株 (GIMI-267) 购自上海研生生化有限公司。大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌菌株均为贵州大学动物疫病研究所实验室保存。
1.2 主要试剂
SDL2000 Marker、2×Taq PCRMaster Mix、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖等, 均购自天根生化科技有限公司;改良罗氏培养基, 购自上海研生生化有限公司。
1.3 引物设计与合成
参考Gen Bank数据库牛结核分枝杆菌基因序列, 设计合成1对牛结核杆菌特异性引物, 引物序列为TB-P1:5’-CCTGCGAGCGTAG-GCGTCGG-3’;TB-P2:5’-TCAGCCTCCACGC-CCGCCA-3’;预期扩增片段大小为317 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.4 牛结核分枝杆菌核酸获取
1.4.1 细菌的培养:
按照说明书配制改良罗氏培养基, 取菌液以划线方式接种于培养基上, 放置于37℃恒温箱中培养5~7 d, 待培养基逐渐由浅蓝色变为深蓝色, 收集细菌培养物, 供后续实验用。
1.4.2 细菌DNA的提取:
将1 000μL灭菌双蒸水加入固体培养基表面, 洗脱菌落, 用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌核酸 (操作步骤按试剂盒说明书进行) , 将提取的DNA进行10倍倍比稀释后置于紫外分光光度计测定其纯度和浓度。
1.5 PCR基本反应体系建立
根据PCR技术原理, 结合特异性引物Tm值, 建立PCR反应体系: (1) 25μL反应体系包括:2×Taq PCR Master Mix为12.5μL, TB-P1 (10μm/L) 和TB-P2 (10μm/L) 分别为1μL, DNA模板为2μL, 灭菌去离子水补足25μL体系。 (2) 反应条件:94℃3 min;94℃30 s, 55℃30 s, 72℃1 min, 35个循环;72℃5 min。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 观察扩增效果。
1.6 PCR最佳反应体系确定
1.6.1 模板浓度优化:
按照1.5所述基本反应体系和反应条件, 其中DNA模板1、2、3、4、5μL梯度进行PCR扩增, 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 综合考虑引物二聚体、目的条带效果等因素, 筛选DNA模板最佳反应浓度。
1.6.2 引物浓度优化:
按照1.5所述基本反应体系和反应条件, DNA模板使用1.6.1最佳反应浓度, 而引物使用0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL梯度进行PCR扩增, 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳, 综合考虑引物二聚体、目的条带效果等因素, 筛选最佳引物反应浓度。
1.6.3 退火温度优化:
在保证其他反应条件最佳的前提下, 通过调节退火温度, 在50~58℃之间浮动, 梯度为2℃, 得出其反应的最佳退火温度为52℃。
1.7 PCR方法性能评价
1.7.1 敏感性检测:
将提取的牛结核分枝杆菌基因组DNA (初始浓度为1.1×101μg/μL) , 按10倍倍比稀释, 各取2μL按最优PCR最优反应条件进行PCR扩增, 检测PCR方法的敏感性。
1.7.2 特异性检测:
分别提取牛结核分枝杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物DNA, 按本实验确定的最佳反应条件进行PCR扩增, 检测PCR方法的特异性。
1.7.3 应用性检测:
用已建立的PCR检测方法, 对5份已知牛结核分枝杆菌阳性奶样进行基因提取, 并进行PCR扩增, 检测PCR方法的临床应用性。
2 结果与分析
2.1 牛分枝杆菌核酸获取
用核酸测定仪对DNA样本进行纯度和浓度测定, 结果显示:D260 nm/D280 nm=1.803 2, 说明样本纯度较好, 样本DNA浓度为0.011μg/μL。
2.2 PCR基本反应体系建立
对已知样本进行检测, 结果见图1, 所建立的PCR方法25μL反应体系可扩增出已知样本317 bp DNA条带, 与预期扩增大小相符。
注:M:DL 2 000 Marker;1~3:待检样本;-:阴性对照
2.3 最佳反应条件确定
2.3.1 最佳模板反应浓度检测:
分别取1、2、3、4、5μL DNA样本按基本反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图2。
注:M:DL 2 000 Marker;1~5:1、2、3、4、5μL DNA待检样本;-:阴性对照
由图2可见, 当反应体系中加入3μL DNA样本时, PCR扩增效果最佳, 即DNA模板终浓度为3μL×0.011μg/μL/25μL=1.32μg/m L时PCR反应效果最佳。
2.3.2 最佳引物反应浓度检测:
分别取0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL引物按最佳反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图3。
由图3可见, 当体系中TB-P1 (10μm/L) 和TB-P2 (10μm/L) 引物分别加入1.25μL时, PCR扩增效果最佳, 即PCR引物浓度为0.5μm/L时PCR反应效果最佳。
注:M:DL 2 000 Marker;1~6:0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75μL引物;-:阴性对照
2.3.3 最佳退火温度检测:
分别在50、52、54、56、58℃退火条件下按基本反应体系与条件进行PCR扩增, 结果见图4。
注:M:DL 2 000 Marker;1~6:1、2、3、4、5μL DNA待检样本。
由图4可见, 当反应条件中退火温度为54℃时PCR扩增效果最佳, 即最佳退火温度为54℃。
2.4 PCR方法特性检测
2.4.1 敏感性检测结果:
对DNA模板进行10倍倍比稀释, 分别取2μL模板按最佳反应条件进行PCR扩增, 结果见图5。由图5可见, 所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法最小DNA检测浓度为8.8 pg/μL, 结果表明所建立的PCR方法均有较好的敏感性。
注:M:DL 2 000 Marker;1~6:10倍倍比稀释的DNA待检样本;-:阴性对照
2.4.2 特异性检测结果:
分别提取常见细菌大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物的DNA样本, 按最佳反应条件进行PCR扩增, 结果见图6。
注:M:DL 2 000 Marker;1~5:牛结核分枝杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌DNA待检样本;-:阴性对照
由图6可见, 大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌培养物的DNA样本均为扩增出任何条带, 而牛结核分枝杆菌DNA样本扩增出317 bp目的条带, 结果表明所建立的PCR方法具有良好的特异性。
2.4.3 临床应用性检测结果:
提取已知5份牛结核分枝杆菌阳性乳样DNA样本, 应用所建立的PCR方法进行扩增, 结果均扩增出317 bp目的条带, 结果说明所建PCR方法具有良好的临床应用性。
3 结论与讨论
3.1 牛结核病 (Bovine Tuberculosis) 是由牛结核分枝杆菌引起的人畜共患传染病, 以奶牛最易被传染[1]。结核分枝杆菌可随鼻汁、痰液、粪便和乳汁等排出体外, 污染饲料、饮水、空气等周围环境, 使其在人畜之间相互传播[2]。人结核病可以传染给牛, 牛结核病也能传染给人, 人们饮用未经消毒或消毒不完全的患病牛的牛奶就可能被传染[3]。1996年, 张高迪等[4]通过试验发现牛结核病中有7%系人分枝杆菌感染, 而结核病人中10.6%为牛分枝杆菌感染, 世界上结核病人中约有15%是因饮用结核病牛的奶而致病。因此, 牛结核病的及时诊断、发现并采取净化措施, 是防控人、牛结核病的关键。
3.2 目前, 奶牛结核病的检测依然依赖提纯结核菌素皮内变态反应试验[5], 但随着养殖规模的扩大, 发展高通量、快速、准确、简便的新型检测技术显得十分迫切。不同地区结核分枝杆菌流行株在基因型上存在较大差异, 其预防与控制措施也需随机应变。国内外最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术[6~8]进行分析, 但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段[9,10], 可以进行结核分枝杆菌传播途径追踪和综合防制技术研究。
3.3 本实验在国内外研究者的工作基础之上, 筛选适合我市奶牛结核病检测的新技术, 使我省在结核病检测技术发展和应用上得到提高。通过设计合成特异性牛分枝杆菌引物, 建立PCR方法, 并对所建立方法的体系和条件进行优化, 评估方法的敏感性、特异性和临床应用性, 结果显示, 所建PCR方法模板浓度、引物浓度和退火温分别为1.32μg/m L、0.5μm/L、54℃时最佳。该方法具有良好的特异性和敏感性, 最小可检出结核分枝杆菌DNA浓度8.8 pg/μL。本快速检测方法的建立为我省奶牛场结核病综合防控提供关键技术。
摘要：随着牛结核病疫情日趋严重, 快速、高效的分子生物学检测方法建立显得十分必要。试验设计合成了牛结核分枝杆菌特异性引物, 优化反应条件, 建立了牛分枝杆菌PCR检测方法。结果显示, 所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法可有效检测牛结核分枝杆菌, 在模板浓度、引物浓度和退火温度分别为1.32μg/mL、0.5μm/L、54℃时最佳;性能评估显示, 该方法具有较好的特异性、敏感性和临床应用性, 为我省牛结核病的综合防控提供关键技术。
关键词：牛结核分枝杆菌,PCR检测,方法建立
参考文献
[1]Stefano M, Marco M, Manuela D P, et al.A case-control study on bovine tuberculosis in the Veneto Region Italy[J].Preventive Veterinary Medicine, 2008, 34:87~95.
[2]王忠仁.牛结核病与人结核病的相互关系[J].中国防痨杂志, 2005, 27 (2) :123~125.
[3]朱建国, 华修国.牛结核病研究进展[J].中国预防兽医学报, 2005, 27 (5) :422~426.
[4]张高迪, 杨醉宇, 邢新华, 等.内蒙古哲里木盟人与牛结核相互传播关系的研究[J].内蒙古畜牧兽医, 1996, 2:47~49.
[5]张喜悦, 王君玮, 高云航, 等.3种方法检测结核污染牛场的比较[J].中国兽医学报, 2003, 23 (6) :555~558.
[6]杨玉英, 李士泽, 郭士玲, 等.BA-Dot-ELISA检测牛结核乳清抗体的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报, 2000, 12 (4) :51~54.
[7]牛中伟.牛γ干扰素抗原捕获ELISA检测方法的建立及初步应用[D].扬州大学, 2009.
[8]余大海, 韦一然, 蔡宏, 等.牛结核病鉴别诊断的方法研究[J].中国人兽共患病学报, 2006, 20 (10) :935~936.
[9]张书环, 杨俊兴, 晁彦杰.牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用[J].动物医学进展, 2007, 28 (7) :17~24.
