O型口蹄疫病毒（精选7篇）

O型口蹄疫病毒 第1篇

FMDV属微RNA病毒科口蹄疫病毒属，是一种正链单股RNA病毒，根据血清学反应的抗原关系，FMDV可分为O、A、C、Asia I、南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ7个不同的血清型和60多个亚型，且各型之间几乎无交叉免疫反应，我国FMDV主要是O、A及Asia I型[3,4]。目前，FMDV的检测主要有病毒分离、间接ELISA和RT-PCR 3种方法。病毒分离虽然有较高的灵敏度，但对病料的要求较高，另外还有成本高、周期长、操作相对复杂等缺点，在临床检测中应用范围较窄[5,6]。间接ELISA对口蹄疫病毒的检测虽然操作相对简单，也具有很好的灵敏度，但对数量较多的病料进行检测时会出现操作繁琐，用时较长的不足，另外获得间接ELISA检测需要的大量标准抗原的也存在一定的难度[7]。RT-PCR是目前应用较为广泛的常规检测方法，具有操作简单快速、成本低、灵敏度高等特点，引物特异性的高低直接影响着RT-PCR检测的效果[8]。因此，该研究针对NCBI中公布的FMDV O、A及Asia I型序列，经过序列比对后，设计得到特异性更好的检测引物，摸索PCR反应条件及重复性，目的在于建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒(FMDV)鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台，为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

RNA提取及反转录试剂盒购自Trans公司，DNA Marker、PCR相关试剂均为TAKARA公司产品，引物设计及序列测序等均在华大基因完成。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计。

根据NCBI中公布的FMDV序列(GenBank:JF749861.1)，参照Hoffma et al[9]设计FMDV通用检测引物FP1/FP2，扩增目的条带为450 bp;根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia I型序列，分别设计FMDV分型引物FO1FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2，扩增片段大小分别为255、347、473 bp。引物序列如表1所示。

1.2.2 FMDV cDNA的获得与检测。

参照Trans公司的TRIzo试剂盒操作步骤提取病毒RNA，操作过程中尽量避免RNA酶的污染。病毒cDNA的合成按照Trans反转录试剂盒步骤进行，以RT-PCR获得的病毒cDNA为模板，利用设计的FMDV通用检测引物FP1/FP2进行PCR检测，判断是否得到可用于后续试验的cDNA片段。

1.2.3 FMDV分型PCR方法的建立及特异性检测。

以检测正确的各型cDNA为模板，利用设计好的引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2，分别进行PCR扩增试验，PCR程序为：94℃5 min;94℃30 s,55～65℃35 s,72℃30 s,72℃完全延伸10 min，探索PCR反应条件。将最终得到的各型PCR检测产物送华大基因测序，验证PCR结果的特异性。

2 结果与分析

2.1 FMDV cDNA的获得与检测

将反转录得到的cDNA利用通用引物进行检测，检测结果如图1所示，获得与预期大小一致的条带，说明成功得到可以用于后续试验的cDNA模板。

注：MDL 500;1O型FMDV;2A型FMDV;3AsiaⅠ型FMDV。

2.2 FMDV分型PCR方法的建立及特异性检测

用引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2,PCR分别扩增O、A和AsiaⅠ型FMDV及各阴性对照cDNA，结果如图2、3、4所示。可以看出，设计的引物均有很好的特异性，O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉，且阴性对照均没有扩增出条带，由此表明建立FMDV分型PCR检测方法有很好的特异性。

将PCR产物送华大基因测序，测序结果在NCBI数据库中对比显示，各型PCR结果与目前公布的FMDV各型序列具有很高的同源性(≥98%)，且各型之间无交叉，特异性较好。

3 讨论

口蹄疫最易感染的动物是牛、羊、猪等偶蹄动物，具有传播速度快、传染性强、发病率高等特点，在新流行地区该病发病率几乎达到100%。虽然感染口蹄疫的动物死亡率较低，但是患病动物生产力明显下降，同时与其相关的动物制品也限制上市，造成的经济损失难以估量[10,11]。因此，快速有效的诊断技术在预防和治疗口蹄疫方面是不可或缺的，也是有效控制和消灭该病的前提，而进一步的口蹄疫分型鉴定，对于制订口蹄疫的有效防治措施必不可少。

注：MDL 1000;1FO1/FO2 PCR检测O型的cDNA;2、3FO1/FO2 PCR检测A型、AsiaⅠ型的cDNA。

注：MDL 1000;1FA1/FA2 PCR检测A型的cDNA;2、3FA1/FA2 PCR检测O型、AsiaⅠ型cDNA。

注:MDL 1000;1FAS1/FAS2 PCR检测AsiaⅠ型的cDNA;2、3FAS1/FAS2 PCR检测O型、A型的cDNA。

O型口蹄疫病毒 第2篇

1 材料

1.1 细胞

杂交瘤细胞株4C3为抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体, 属IgG1亚类, 由兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室研制。

1.2 主要试剂和仪器

O型口蹄疫病毒纯化抗原、小鼠抗O型口蹄疫病毒阳性、阴性血清均由兰州兽医研究所口蹄疫参考实验室研制;RPMI-1640细胞成品培养液购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;降植烷、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠lgG购自Sigma公司;0.02 mol/L磷酸缓冲液 (pH=7.6) 、0.1 mol/L柠檬酸缓冲液 (pH=3.2) 、1 mol/L硫酸铵缓冲液 (pH=7.4) 自行配制。BioRad680型酶检测仪购自上海基因公司;5 mL HiTrapTMprotein G HP亲和层析柱、HiTrapTM 1mL phenyI FF反相层析柱、AKTA快速蛋白液相色谱纯化系统仪 (FPLC) 均购自安发玛西亚生物技术公司 (Amersham Pharmacia Biotech) 。

1.3 试验动物

BALB/c小鼠 (6～8周龄、雌性) 购自兰州生物制品所。

2 方法

2.1 单克隆抗体腹水的制备

将液氮中冻存的杂交瘤细胞株4C3迅速地放入37℃水浴中使其快速溶解, 然后转到装有RPMI-1640细胞培养液 (含10%的胎牛血清) 的细胞瓶中, 放在37℃、5%CO2的温箱中进行培养。待杂交瘤细胞培养有足够数量时, 按1106～5106 个/只注射到用降植烷处理过的雌性BALB/c (8～10周龄) 小鼠腹腔中。待到第8～12天左右可看到小鼠消瘦、精神沉郁、腹部明显膨大时, 无菌操作采集腹水。腹水经1 000 r/min离心10 min, 弃去上层脂肪层, 收集中层腹水, -70℃冻存备用。下层细胞仍可按前述方法继续传代诱生腹水, 以进一步获得大量的单克隆抗体[3]。

2.2 腹水的饱和硫酸铵沉淀

将上述所收的单抗腹水经生理盐水4倍稀释后, 再加入等体积的饱和硫酸铵溶液 (pH=7.4) 混合均匀4℃沉淀1h。然后8 000 r/min离心30 min, 弃上清, 沉淀复溶于等体积的生理盐水中, 加入饱和硫酸铵溶液 (pH=7.4) 使其占总体积的45%, 置4℃沉淀1 h。经8 000 r/min离心30 min后, 将沉淀复溶于适量生理盐水中, 4℃保存备用[4]。

2.3 protein G亲和层析纯化单抗[5]

利用安发玛西亚生物技术公司的AKTA快速蛋白液相色谱纯化系统及protein G亲和层析柱 (5 mL HiTrapTM protein G HP) 进行亲和层析。首先用0.02 mol/L pH=7.6磷酸缓冲液平衡亲和层析柱, 然后用注射器吸取2 mL经饱和硫酸铵盐析的样品, 通过加样环上样, 流速为0.5 mL/min, 待样品完全进入层析柱后以同样的流速用0.02 mol/L pH=7.6磷酸缓冲液洗脱杂蛋白, 杂蛋白洗脱完后再用0.1 mol/L pH=3.2柠檬酸缓冲液进行洗脱目的蛋白, 流速为1 mL/min, 经UV-280 nm检测收集到的第2洗脱峰即为纯化的抗O型口蹄疫病毒的单抗 (具体见图1) , 4℃保存备用。

2.4 反相层析纯化单抗

利用安发玛西亚生物技术公司的AKTA快速蛋白液相色谱纯化系统及反相层析柱 (HiTrapTM 1 mL pheny I FF ) 进行反相层析。首先用1 mol/L pH=7.4硫酸铵缓冲液平衡反相层析柱, 然后用注射器吸取1mL经饱和硫酸铵盐析的样品, 通过加样环上样, 流速为0.5 mL/min, 待样品完全进入层析柱后以同样的流速用1 mol/L pH=7.4硫酸铵缓冲液洗脱杂蛋白, 杂蛋白洗脱完后再用0.02 mol/L pH=7.6磷酸缓冲液进行洗脱目的蛋白, 流速为1 mL/min, 经UV-280 nm检测收集到的第2洗脱峰即为纯化的抗O型口蹄疫病毒的单抗 (具体见图2) , 4℃保存备用。

2.5 单抗蛋白含量的测定

用紫外分光光度计分别测定280 nm和260 nm的吸光值, 并根据下列公式计算蛋白含量。蛋白含量 (mg/mL) = (1.45D280 nm-0.74D260 nm) 样品稀释度。

2.6 单抗纯度的测定

纯化的单抗用SDS-PAGE鉴定其纯度[6]。用15%的分离胶、5%的浓缩胶, 设标准分子量 (116.0KD、66.2KD、45.0KD、35.0KD、25.0KD、18.4KD、14.4KD) 。将样品和加样缓冲液混匀后在100℃加热5 min, 然后按次序上样, 开始时电压为8V/cm凝胶, 染料进入分离胶后, 将电压增加到15V/cm凝胶, 继续电泳直到染料到达分离胶底部, 断开电源, 取下凝胶进行考马斯亮蓝染色, 脱色后进行拍照观察。

2.7 单抗的活性测定

采用间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行测定[7]。将纯化的O型口蹄疫抗原用包被液稀释成1∶800进行包被, 4℃过夜后用洗涤液冲洗3次, 拍干, 用5%的脱脂奶粉以100μL/孔37℃封闭1h, 洗板3次, 然后将腹水、纯化的单抗从1∶1000倍比稀释后加入, 同时设阳性、阴性、空白对照, 37℃反应30 min, 洗涤3次, 拍干, 酶标二抗按本实验室的工作浓度 (1∶10 000) 100 μL/孔加入, 37℃反应30 min, 洗涤3次, 拍干, 加入四甲基联苯胺 (TMB) 底物溶液100 μL /孔, 37℃反应10 min, 最后加入50 μL /孔硫酸 (2 mol/L) 终止反应, 用酶标仪检测OD450 nm。

3 结果

3.1 单抗的纯化

无菌采集腹水为含有杂交瘤细胞的血性腹水, 经离心杂交瘤细胞沉于管底, 上面为脂肪层, 中层为单抗腹水。单抗腹水经50%的饱和硫酸铵和45%的饱和硫酸铵两次沉淀得到初提的单抗。将初提的单抗用Protein G纯化, 得到两个不同洗脱峰的曲线 (见图1) , 第1峰为非结合峰 (杂蛋白峰) , 第2峰为所需的目的峰 (单克隆抗体峰) , 两峰间分离良好, 但第1峰往往高于第2峰。用反相层析柱纯化同样得到两个峰 (见图2) , 第1峰为杂蛋白峰, 第2峰为单克隆抗体峰, 两峰间分离良好, 但目的峰往往高于杂蛋白峰。

3.2 单抗的纯度

SDS-PAGE结果显示 (见图3) , 经Protein G层析纯化的单抗纯度较高, 没有杂蛋白条带出现, 只有清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带。经反相层析柱纯化的单抗纯度次于亲和层析纯化的单抗, 除了清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带外还有其它的杂蛋白条带。

3.3 单抗的活性和含量的测定

用建立的间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 对所纯化的抗体进行活性测定, 其结果表明经纯化的抗体均具有良好的活性。样品的效价分别为:单抗的腹水效价为1∶100 000, 亲和层析纯化的单抗效价为1∶25 000, 反相层析纯化的单抗效价为1∶50 000。用分光光度计测得的蛋白含量为:亲和层析的蛋白含量为2.814 mg/mL, 反相层析纯化的蛋白含量为3.925 mg/mL。

1:亲和层析纯化的单抗;M:蛋白质分子质量标准;2:反相层析纯化的单抗

4 讨论

试验中用的亲和层析柱其主要成分 (Protein G) 为链球菌表面所具有的1种蛋白, 它具有两个IgG结合位点, 作为IgGFc受体能与IgGFc段结合, 与葡萄球菌A蛋白相比, 能与更多种属的IgG结合, 并对各种属IgG有更高的亲和性和更强的结合能力[8]。除对小鼠IgG有高度亲和力外, 对人类各亚类IgG、兔、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、大鼠IgG均有很强的亲和力, 故已被用于纯化多种单抗 (IgG) 和各种多克隆IgG。应用基因工程制备的链球菌G蛋白, 去除了天然链球菌G蛋白与白蛋白结合的部位, 故具有更高的特异性。用Protein G亲和层析柱纯化的单抗经SDS-PAGE电泳显示其纯度达到100%, 间接酶联免疫吸附试验 (ELISA) 显示纯化的单抗具有良好的活性, 但回收率低于反相层析, 获得高纯度的抗O型口蹄疫病毒的单体, 将为建立简便、快速的O型口蹄疫病毒检测方法提供良好的基础材料。反相层析柱的主要介质是亲脂性的苯基, 能吸附疏水性基团但不吸附极性基团, 当盐析的样品流经层析柱时, 杂蛋白在1 mol/L pH=7.4硫酸铵缓冲液中变为极性基团不被吸附, 目的蛋白的疏水性基团暴露在外面可吸附在反相层析柱上, 用0.02 mol/L pH=7.6磷酸缓冲液冲洗时吸附的目的蛋白又变为极性基团从而被冲洗下来, 从本试验的层析图谱和活性分析上可知反相层析法可获得高效价的抗体, 但其纯度低于亲和层析, 不适于制备高纯度的抗体。除了上述两种方法外, 单克隆抗体的纯化方法还有离子交换层析、凝胶过滤、凝胶色谱、高压液相离子交换层析等, 纯化单抗时应根据单抗的来源、类和亚类的特点采用不同的方法进行纯化。

摘要：为了获得有效纯化抗体的方法, 将杂交瘤细胞株 (4C3) 用细胞培养液扩大培养后制备腹水, 所得腹水依次用50%和45%的饱和硫酸铵沉淀后再分别用亲和层析和反相层析进一步纯化抗体, 并用SDS-PAGE和间接酶联免疫吸附试验分析其纯化抗体的纯度和活性。结果表明, 亲和层析获得了较高纯度的抗体, 并且抗体活性没有丧失, 反相层析获得的抗体有较好的活性, 但抗体中还有微量的杂蛋白。因此亲和层析是单抗纯化的较好途径, 所获得的高纯度单抗将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究提供良好的物质基础。

关键词：亲和层析,反相层析,O型口蹄疫病毒,单抗

参考文献

[1]谢庆阁.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社, 2004.

[2]Yang PC, Chu RM, Chung WB, et al.Epidemiological characteristics and financial costs of the1997foot and mouth dis-ease epidemic in Taiwan[J].Vet Rec, 1999 (145) :731-734.

[3]Aggarwal N, Barnett P V.Antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV) :an analysis of the specificities of anti-FMDVantibodies after vaccination of naturally suscepti-ble host species[J].J Gen Virol, 2002 (83) :775-782.

[4]李一经, 李海滨, 贾永清, 等.聚乙二醇硫酸铵沉淀法对不同亚类单克隆抗体活性的影响[J].黑龙江畜牧兽医, 1998 (3) :6-7.

[5]徐向荣, 马国昌, 王昌梅, 等.层析法除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素[J].生物工程学报, 2008, 24 (1) :159-163.

[6]萨姆布鲁克J, 拉塞尔D W, 等.黄培堂, 等译.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社, 2002, 1474-1480.

[7]John R Crowther.The ELISA Guide Book[M].New Jersey:Humana Press, 2002.

O型口蹄疫病毒 第3篇

1 材料与方法

1) 待检血清。2011年10-11月, 在玉树藏族自治州囊谦县、称多县、杂多县和治多县采集牛O型、Asial型口蹄疫双价苗接种后1个月的牦牛血清共计306份 (表1) , -20℃保存, 检测前自然解冻。

注:“O/I”中O代表口蹄疫O型疫苗检测;I为口蹄疫Asial型疫苗检测。下同。

2) 诊断试剂。牛O型、Asial型口蹄疫抗体检测液相阻断ELISA试剂盒检测试剂盒, 由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。

3) 结果判定标准。牛O型、Asial型血清抗体与保护力的关系为:抗体效价以≥1∶128的滴度为标准, 效价≥1∶128, 99%以上, 保护;效价1∶16, 不保护;效价介于1∶22~1∶90, 50%保护。

注:“-”代表数据缺失。

2 结果与分析

玉树4县O型、Asial型FMD抗体检测血清数及效价分布见表2, 四县O型、Asial型FMD抗体保护效价百分比分布见表3。结果表明, 玉树地区牦牛口蹄疫O型、Asial型疫苗抗体具有50%以上保护力的比例分别为90.00%和86.33%;玉树地区整体免疫情况良好。各县O型疫苗的保护力均比Asia型疫苗略高。囊谦县、称多县O型、Asial型免疫情况均良好;杂多县、治多县保护力相对较低。

3 讨论

1) 免疫接种的目的是保护易感动物, 预防口蹄疫的有效手段是免疫接种。理论上讲, 根据现行的口蹄疫疫苗的免疫效力, 注射密度达到80%就能起到阻止流行的作用。但在具体操作过程中, 存在免疫间隔期长、部分牲畜免疫后期抗体效价达不到抵御外界病毒侵袭的水平等问题。可通过提高动物免疫密度、保证免疫质量, 来有效防止动物疫病的发生, 保障畜牧业健康发展。本试验结果显示, 玉树地区牦牛口蹄疫疫苗免疫效果整体良好, 但杂多和治多两县免疫抗体水平较低, 应加强牦牛口蹄疫免疫工作。

2) 通过免疫接种提高畜群整体抗体水平, 是预防口蹄疫的主要手段之一, 抗体水平检测是对免疫效果的一种直观评估。铁富萍等[1]在海晏县对80份牦牛口蹄疫O型、Asial型疫苗抗体用试管凝集法进行检测, 结果具有50%以上保护力的比例分别为85.50%、96.25%, 本次检测口蹄疫亚洲Ⅰ型抗体和O型抗体达到50%以上保护的分别为90.00%和86.13%, 说明玉树各县牦牛口蹄疫免疫预防效果较理想, 亚洲Ⅰ型抗体略高于O型抗体, 可能与疫苗制造过程中有效成分配备有关。

3) 在玉树牧区, 牦牛以放牧饲养为主, 牦牛习性近于野生动物, 防疫过程中牛保定难度大, 免疫质量和密度难以保证。应加大动物预防基础设施建设, 大力推广牛、羊免疫注射栏, 以提高免疫质量和免疫密度。

4) 免疫抗体水平高低与牦牛的日常饲养管理水平、健康状况、疫苗保存条件以及防疫人员业务能力和实际操作能力有关。

5) 诊断与检测是利用技术手段, 准确掌握口蹄疫流行时免疫状况的科学方法, 为防疫政策、措施的制定提供依据, 因而十分重要, 玉树地区需加强诊断与监测工作。

参考文献

羊O型口蹄疫免疫抗体消长规律研究 第4篇

关键词：羊,O型口蹄疫,免疫程序,抗体消长规律,ELISA

口蹄疫是危害严重的动物疫病之一,被OIE列为法定报告的动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。为降低口蹄疫对畜牧业生产和国际贸易带来的影响,OIE和联合国粮农组织( FAO) 将其列为优先防控的动物疫病,并启动了口蹄疫全球控制策略［1 － 3］。近几年抚顺市大力发展设施畜牧业,规模养羊得到了迅速发展,给养殖户带来了丰厚的经济收入,但口蹄疫疫情时有发生的国际现状对我国畜牧业生产构成了严重威胁。试验通过监测羊O型口蹄疫母源抗体和免疫抗体消长规律,为口蹄疫科学防控供科学依据,使畜群处于有效的群体保护状态,最终实现口蹄疫免疫无疫的目标。

1 材料

O型- 亚洲Ⅰ型二价口蹄疫灭活疫苗( OS株+JSL株) ,批号为1307006,中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产; O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒,购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

2 方法

2. 1 检测方法

应用O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试验对羊血清进行O型口蹄疫免疫抗体水平检测,检测方法按照试剂盒使用说明书进行; O型口蹄疫抗体效价在1∶64 以上( 含1∶64) 为免疫达保护［4 － 7］。

2. 2 试验分组

在抚顺市的东洲区、抚顺县共选择4 家正规羊场,分别是A场、B场、C场和D场。

2. 2. 1 母源抗体监测组选取A场和B场健康状况良好的羔羊各20 只进行母源抗体基础值检测,分别在羔羊7,14,21,35,42,49 日龄时采集血清样品,进行O型口蹄疫抗体水平检测。

2. 2. 2 首免试验组由母源抗体监测组确定最佳首免时间后,在A场、B场、C场和D场分别选取20,20,10,10 只健康状况良好的羔羊按最佳首免时间进行免疫,免疫剂量为1 m L/只。在羔羊首免后第7,14,28,35,42,49 天采集血清样品,进行O型口蹄疫免疫抗体水平检测。

2. 2. 3 二免试验组由母源抗体监测组和首免试验组确定最佳首免时间和二免时间后,在A场、B场、C场和D场分别选取20,20,10,10 只健康状况良好的羔羊按上述最佳首免和二免时间进行免疫,首免和二免的免疫剂量为1 m L/只。在羔羊二免后第7,14,30,60,90,120,150 天采集血清样品,进行O型口蹄疫免疫抗体水平检测。

试验期间羔羊如出现明显疾病症状( 如严重腹泻、肢蹄伤残等) 予以淘汰。

2. 3 结果判定

抗原对照4 孔,弃去最高和最低OD492值,剩余两孔的平均OD492值的一半为50% 对照值,该值即为临界值。被检血清稀释孔OD492值大于临界值的孔为阴性,小于或等于临界值的孔为阳性,OD492值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体效价。

3 结果

3. 1 母源抗体和首免后抗体消长情况( 见表1)

由表1 可知,羔羊体内母源抗体水平在7 ~ 21 日龄时处于较高水平。随着羔羊日龄增长,其O型口蹄疫抗体水平及合格率逐渐下降。在28 日龄时O型口蹄疫抗体合格率为72. 5% ,处于临界保护线,在35 日龄时O型口蹄疫抗体合格率为52. 5% ,说明28 日龄后母源抗体保护水平显著下降。

%

首免试验组选择在28 日龄进行首免,首免后各时间段抗体合格率见表2。由表2 可知,首免后第28 天O型口蹄疫抗体合格率最高,为98. 3% 。在首免后第35 天时各试验场羊O型口蹄疫抗体合格率均降到临界保护状态,为73. 3% ,第42 天时抗体合格率为60% ,第49 天时抗体合格率仅为31. 7% 。

%

3. 2 二免后抗体消长情况( 见表3)

二免试验组选择首免后第35 天进行二免,二免后各时间段抗体合格率见表3。由表3 可知,二免后第7 天时O型口蹄疫抗体合格率达到70% ,二免后第30 天时抗体合格率最高,为100% ,之后抗体水平缓慢下降。免疫后第120 天时抗体合格率降至71. 7% ,第150 天时抗体合格率为53. 3% 。

4 小结与讨论

1) 不同羊场羔羊O型口蹄疫母源抗体合格率变化存在差异,但是其变化趋势是一致的。总体来说,随着羔羊日龄的增长,抗体水平缓慢下降,符合O型口蹄疫母源抗体在羔羊内的自然消长规律。因各场羔羊自身免疫水平不同和饲养管理水平差异,均对羔羊的母源抗体造成不同程度对影响。

%

2) 28 日龄时O型口蹄疫母源抗体均值降到临界保护线处,35 日龄时O型口蹄疫母源抗体合格率降至52. 5% 。故口蹄疫首免日龄应选择在28 日龄为宜。

3) 在首免后O型口蹄疫抗体水平在第28 天时合格率最高。随着羔羊日龄增长,抗体水平及合格率逐渐下降,在首免后第35 天抗体均值降至临界保护线,故二免时间应选择在首免后一个月为宜［8］。

4) 二免后第30 天左右O型口蹄疫抗体合格率达到高峰,随后开始缓慢下降,但抗体合格率维持高水平时间较长。二免后第120 天时抗体合格率一直处于合格群体保护率内,第150 天的抗体合格率低于国家规定的群体保护率,应进行加强免疫。

通过对羊口蹄疫免疫抗体消长规律的研究,获得了母源抗体、免疫抗体等基础数据,为抚顺地区制订口蹄疫防控政策和优化免疫程序提供了技术支撑。

参考文献

[1]OIE.The South-East Asia and China Foot and Mouth Disease(SEACFMD)Campaign[EB/OL].(2006-09-15)[2015-06-16 ].http//www.rr-asia.oie.int/actibeities/sub-regional-programme/stanz/seacfmd/

[2]FAO and OIE.The Global Foot and Mouth Disease Control Strategy[M].Rome and Paris:FAO and OIE,2012.

[3]The Progressive Control Pathway for FMD Cotrol(PCP-FMD)[R].Rome:FAO,2011.

[4]赵鑫,杨军旗,邹迎梅,等.液相阻断ELISA在奶牛A型口蹄疫抗水平检测中的应用[J].北京农业,2010(24):6-8.

[5]钟召兵.规模场奶牛O-Asial、A型口蹄疫免疫抗体消长规律观察[J].山东畜牧兽医,2014,35(10):6-7.

[6]排合尔丁·穆太力甫,李建玲,马正海.乌鲁木齐地区牛口蹄疫O型Asia-I型双价灭活疫苗免疫效果的检测与分析[J].安徽农业科学,2014,42(27):9400-9401.

[7]赵彬竹,赵德丰,石伟革,等.两种试剂盒检测牛羊口蹄疫O型抗体的对比试验[J].广西畜牧兽医,2015,31(1):29-30.

O型口蹄疫病毒 第5篇

1 材料与方法

1.1 被检血清

随机采取进行了牛羊O型-亚洲Ⅰ口蹄疫双价灭活苗免疫后第21天左右的牛血液样品105份、羊血液样品各98份, 进行了猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后第21天左右的猪血液样品102份, 分离血清, 置4℃冰箱保存待检。

1.2 诊断试剂

口蹄疫O型正向血凝抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液, 由中国农科院兰州兽医研究所生产, 批号为20110320。O型口蹄疫液相阻断ELISA检测试剂盒, 由中国农科院兰州兽医研究所生产, 批号为20110325。

1.3 检测方法及结果判定

正向间接血凝试验 (IHA) 严格按试剂盒说明书进行操作, 其抗体效价≥1∶32判定为抗体合格。O型口蹄疫液相阻断ELISA (LPB-ELISA) 严格按试剂盒说明书进行操作。以病毒抗原对照平均OD值的50%为临界值, 被检血清OD值大于临界值的孔为阴性孔, 小于临界值的孔为阳性孔, 阳性孔的最高稀释度为该血清的抗体效价, 其抗体效价≥1∶64判定为抗体合格。

2 结果

经IHA方法检测, 牛、羊、猪O型口蹄疫免疫抗体合格率分别为81.90% (86/105) 、83.67% (82/98) 、71.57% (73/102) , 总合格率为79.02% (241/305) , LPB-ELISA方法检测牛、羊、猪O型口蹄疫免疫抗体合格率分别为80% (84/105) 、80.61% (79/98) 、71.57% (73/102) , 总合格率为77.38% (236/305) , 双合格 (两种方法检测均合格) 率为76.07% (232/305) 。详见表1。

两种方法的符合率:用IHA和LPB-ELISA两种方法检测的305份样品中共有292份样品的结果一致, 总符合率为95.74%。

3 分析与讨论

检测结果显示, IHA和LPB-ELISA两种检测方法的结果基本符合 (95.74%) , 检测同批血清的抗体效价有着明显的对应关系, 两种检测方法均有较高的敏感性和特异性, 且试验结果可靠。

(1) 检测结果中IHA方法比LPB-ELISA方法检测样品的免疫抗体合格率略高, 可能与IHA方法的结果使用肉眼判定, 存在一定主观性有关。

(2) 正向间接血凝试验虽具有使用仪器设备少、操作简便快速、抗原价格较低等优点, 但在结果判定上存在一定的主观性, 实验员的判断力不一样, 就很有可能出现不同的结果, 即便对于同一操作者, 每次的试验判断结果都可能有一定的偏差, 而且IHA对血样的要求较高, 不同批次试剂稳定性也常不一。液相阻断ELISA灵敏性和特异性高、重复性好、结果判定科学且不受检验人员主观性影响, 但要求技术人员操作熟练, 使用仪器设备多, 操作步骤繁琐, 试验所需时间长, 且试剂价格稍贵。

O型口蹄疫病毒 第6篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及血清

在石家庄地区随机选择3个免疫O型口蹄疫疫苗的规模化猪场, 每个猪场采30份猪血液样本, 共采集90份, 分离血清, -20℃冰箱冻存。

1.1.2 检测试剂

(1) 口蹄疫O型正向血凝抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液:中国农业科学院兰州兽医研究所生产。

(2) O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒:中国农业科学院兰州兽医研究所生产。

(3) 猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体检测试剂盒:武汉科前动物生物制品有限责任公司生产。

1.1.3 主要仪器和设备

精密移液器、酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、台式离心机、96孔V型血凝板。

1.2 方法

1.2.1 检测方法

正向间接血凝 (IHA) 试验、阻断夹心ELISA和间接ELISA按生产厂家说明书进行操作。

1.2.2 免疫判定标准

猪O型口蹄疫抗体按正向间接血凝试验的检测结果, 即抗体滴度≥1:128判定为免疫合格。

O型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试剂盒的检测结果按说明书进行判定。即抗体滴度≥1:64, 99%以上保护, 为免疫合格;<1:4不保护;1:4~32, 50%保护。

猪O型口蹄疫病毒ELISA抗体试剂盒的检测结果按说明书进行判定。即样品OD630nm值≥0.4时判为阳性, 为免疫合格;样品OD630nm值<0.4时判为阴性。

2 结果

对A猪场的30份血清分别用正向间接血凝、阻断ELISA、间接ELISA方法进行检测, 免疫抗体合格率依次为90%、80%、83.3%;对B猪场的30份血清分别用正向间接血凝、阻断ELISA、间接ELISA方法进行检测, 免疫抗体合格率依次为86.7%、83.3%、86.7%;对C猪场的30份血清分别用正向间接血凝、阻断ELISA、间接ELISA方法进行检测, 免疫抗体合格率依次为93.3%、80%、80%。结果见附表。

3 讨论

正向间接血凝是当前最为快速、简便和经济的检测血清方法[2]。是将灭活的各型病毒致敏绵羊红细胞制备的诊断试剂, 当其遇到相应型的血清时即可发生红细胞凝集现象。可检测出猪和牛发病及疫苗免疫后10~150天的血清抗体。其灵敏度高于中和试验和琼脂扩散试验, 但缺点是不同批号的产品效价有波动, 重复性较差。

注:*表示与正向相比, p<0.05, 为差异显著;*表示与正向相比, p<0.01为差异极显著。

液相阻断夹心ELISA法是1986年Hamblin等建立[3], 应用此法检测口蹄疫病毒抗体, 血清样品中特异性抗体将阻断病毒抗原与包被的抗体酶结合物之间的结合。间接ELISA法是采用猪O型口蹄疫病毒VP1基因工程表达产物包被微孔板, 在试验中, 加入待检血清, 经温育后, 若样品中含有猪口蹄疫病毒VP1的特异性抗体, 则将与检测板上抗原结合。

李凤玲等采用IHA和液相阻断夹心ELISA方法分别检测奶牛O型口蹄疫的免疫抗体效价, 结果表明IHA的检测合格率明显高于液相阻断夹心ELISA的合格率, 并且差异显著[4]。本试验结果表明IHA的免疫抗体检测合格率明显高于两种ELISA方法的免疫抗体合格率 (P<0.05) , 说明IHA与ELISA检测方法不具有平行相关性。造成这种差异的原因是抗原的特异性、敏感性问题, 还是被检测抗体的成份含量与抗原检测的类型不同所致, 值得进一步探讨[5]。虽然用液相阻断夹心ELISA进行检测的免疫抗体合格率低于间接ELISA, 经分析表明两个试验结果的差异无统计学意义, 说明两者相关性良好。

应用间接ELISA检测一批样品耗时4~5小时、应用正向间接血凝方法耗时2~3小时, 而应用阻断夹心ELISA需一天一夜才能出结果。从时间上看正向间接血凝和间接ELISA优于阻断ELISA。

4 结论

本试验表明间接ELISA和阻断夹心ELISA结果的相关性较好, 结果较精确、准确性也高, 因此在进行猪的O型口蹄疫抗体监测时, 应优先采用此两种方法检测, 但存在检测成本高, 技术与设备要求也较高等缺点, 因此在一些实验室检测经费较紧张或条件不具备的县区, 可以将正向间接血凝作为基层单位普查的首选方法。

参考文献

[1]吴清民.兽医传染病学[M].北京:中国农业大学出版社, 2000.

[2]薛景山, 李树春, 陈广印, 等.国际口蹄疫的监测与控制[J].中国兽医科技, 1991, 21 (7) :44-46.

[3]HAMBLINC, BARNETT R, CRAWTHER J R.A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot and mouth disease virus[J].J Immunology Methods, 1986, 93:123-129.

[4]李凤玲, 张振岚, 臧鹏伟.奶牛O型口蹄疫免疫抗体良好检测方法的比较[J].畜牧与兽医, 2011, 43 (5) :104-105.

O型口蹄疫病毒 第7篇

1材料

1. 1主要器材与试剂

常州国华电器有限公司生产的ZW - A微量振荡器,上海安亭科学仪器厂生产的WGP - 350型隔水式电热恒温培养箱,96孔110 °V型医用血凝板。口蹄疫血凝抗原,口蹄疫阴性对照血清,口蹄疫阳性对照血清,O型口蹄疫正向稀释液,均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1. 2样品采集

采自西宁市2个镇( 乡) 和3个办事处的规模化养殖场及散养户的牛血80份、羊血80份,及时分离血清,于 - 20 ℃保存。

2方法

2.1疫苗免疫

春季防疫开始后及时到西宁市动物疫病预防控制中心领取口蹄疫A型苗和O - 亚洲Ⅰ型口蹄疫双价苗,并迅速派发到各个镇、办。在整个春防过程中监督防疫员对牲畜进行准确及时的疫苗注射,牛、羊采取颈静脉分点同时注射两种疫苗。对所有免疫牲畜均做登记,绝不遗漏。对临产牛羊及犊牛、羔羊在产后或达到免疫年龄时及时进行补免。

2.2血液采集

在疫苗免疫后第21天采集全血,摆斜面静置,析出血清后立即送往西宁市动物疫病预防控制中心兽医实验室进行检测。

2.3利用正向间接血凝试验对样品进行检测

抗体检测参照中国农业科学院兰州兽医研究所正向间接血凝试验口蹄疫抗体检测试剂盒说明书进行。

2.3.1加稀释液在血凝板上所有孔各加稀释液50μL。

2. 3. 2稀释待检血清取待检血清50 μL加入第1孔,依次倍比稀释至第10孔,第10孔混匀后弃去50 μL。此时1 ~ 10孔待检血清的稀释倍数依次为: 1∶2,1∶4,1 ∶ 8,1 ∶ 16,1 ∶ 32,1 ∶ 64,1 ∶ 128,1 ∶ 256,1 ∶ 512, 1∶1 024。

2. 3. 3阴性对照稀释方法同待检血清,在第1孔加阴性血清50 μL,倍比稀释至第4孔,混匀后从该孔弃去50 μL。此时阴性对照血清的稀释倍数依次为: 1∶2,1∶4,1∶8,1∶16。

2. 3. 4阳性对照稀释方法同待检血清,最终阳性血清稀释倍数依次为1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64, 1∶128,1∶256,1∶512,1∶1 024。

2.3.5加血凝抗原被检血清各孔及阴、阳性对照血清各孔均加血凝抗原25μL。

2. 3. 6振荡混匀将血凝板置于微量振荡器上振荡1 min,观察各孔红血球完全混匀即可。盖上玻板,置于恒温培养箱中37 ℃ 静止1 ~ 1. 5 h或者静置于室温下( 25 ℃) 2 ~ 3 h判定结果。

2. 3. 7结果判定按照试剂盒说明书进行判定,阳性血清效价达到1∶1 024,阴性血清≤1∶4时试验结果成立,牛、羊口蹄疫疫苗免疫抗体效价≥1 ∶256 ( 即8 lb; 第8孔呈现“ + + ”凝集) 为免疫合格。

3结果

3.1免疫情况调查结果

对西宁市规模化养殖场及散养户的牛羊全部进行口蹄疫A型苗和O - 亚洲Ⅰ型口蹄疫双价苗的免疫注射,免疫覆盖率达100% 。

3.2抗体检测结果

抽样采集西宁市2个乡镇和3个办事处的规模化养殖场及散养户的牛、羊血各80份,其中牛O型口蹄疫免疫效价达到合格的有76头,免疫合格率为95. 0% ,结果见表1; 羊达到合格的有77只,免疫合格率为96. 3% ,结果见表2。

4讨论

根据以上检测结果可以看出,2013年春季西宁市口蹄疫的免疫合格率达到国家要求,但有少数血清抗体未达到要求。分析原因可能为: 1) 疫苗注射时对于体型较大牲畜,通用的注射剂量可能略有不足; 2) 对于活动力特别强的牲畜,疫苗注射后可能会有少量漏掉; 3) 可能是IHA法的敏感性、稳定性不太理想或肉眼判定结果会出现主观因素误差[2]。针对以上原因,对于不合格的血清先进行复检,如果复检结果仍不合格,对于不达标的牲畜及时进行二次免疫。

参考文献

[1]谢庆阁.口蹄疫[M].北京:中国农业出版社,2004.