免疫细胞荧光论文（精选8篇）
免疫细胞荧光论文 第1篇
1 对象与方法
1.1 对象
本研究收集2008年1月~2010年6月在我院进行孕前检查的108例女性,年龄21~32岁,抽取空腹静脉血5 ml,离心分离血清后置于-80℃冰箱保存,用于CMV-IgM抗体的检查。
1.2 试剂及检测方法
CMV-IgM试剂盒(ELISA)购于德国罗氏公司,严格按照试剂盒说明书步骤操作,采用美国宝特ELX808酶标仪进行检测,波长设为450 nm处检测OD值,每份标本重复检测3次,取其均数。实时荧光定量-PCR送中山大学达安基因公司检测,引物系列:sense 5'-GTG CAC AGT CCT AGG ATT AA-3',anti-sense 5'-GAG TAA CGA TTC GAA CCG TA-3',逆转录反应条件为37℃1 h,然后95℃3 min;实时荧光定量-PCR反应为93℃3 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,共40个循环。主要仪器为ABI 3900台式高通量DNA合成仪,科大创新HC-3018R高速冷冻离心机,ABI 9700 PCR仪,ABI 7500全自动荧光定量PCR仪。
1.3 统计学方法
计量资料采用均数±标准差表示,所有数据均采用SPSS 15.0软件进行分析,组间比较采用oneway-ANOVA比较,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
两种检测方法CMV-IgM阳性率比较,实时荧光定量-PCR法阳性率高于ELISA法,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
与ELISA法比较,*P<0.05
ELISA法检测为阳性的62例妇女采用实时荧光定量-PCR检测也为阳性,其余18例实时荧光定量-PCR法检测为阳性的妇女ELISA法检测均为阴性。笔者分析发现,此18例标本血清CMV-IgM抗体拷贝数均明显较低(拷贝数<10-4/ml)。
3 讨论
本研究表明,采用实时荧光定量-PCR检测孕前筛查妇女外周血CMV-IgM抗体水平较传统的ELISA法敏感性及准确率高,对于孕前筛查可能具有较好的临床价值。
我国是CMV感染高发的国家,且多数人感染后无明显临床症状,表现为潜伏感染[2]。然而,孕妇近期感染CMV后,不仅会对孕妇产生严重影响,如流产、早产、死胎等[3],CMV还可通过胎盘屏障到达胎儿体内,导致胎儿畸形、发育迟缓和神经系统发育异常等[4]。检测孕前妇女外周血CMV-IgM抗体水平是评价CMV近期感染的重要检测指标[5],目前也为广大临床医师所重视。CMV-IgM抗体一般在病毒感染3~5 d后出现,可维持12~16周,具有出现早、消失快的特点[6]。病毒感染的早期或恢复期,血中CMV-IgM抗体水平较低。因此,采用敏感性高的检测手段对CMV感染的早期准确诊断具有重要的临床意义。既往多采用ELISA法,近年来随着实时荧光定量-PCR技术的普及,有研究报道实时荧光定量-PCR检测血清CMV-IgM抗体水平也具有较好的敏感性及准确率。
笔者选择108例孕前妇女,同时采用实时荧光定量-PCR和ELISA法检测外周血CMV-IgM水平,其中实时荧光定量-PCR阳性率为74%,而ELISA法为57%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析发现,其中18例实时荧光定量-PCR阳性的妇女外周血CMV-IgM抗体水平均为低拷贝数(拷贝数<10-4/ml),提示对于病毒低拷贝数的人群,采用实时荧光定量-PCR法检测可在一定程度上提高诊断的敏感性及准确率。实时荧光定量-PCR具有快速、准确、敏感性高的特点,笔者认为利用其这些特点可以在一定程度上提高CMV感染检测的敏感性及准确率,但其费用较传统ELISA法高,这可能也在一定程度上限制了这种技术的临床运用。
总之,笔者认为,实时荧光定量-PCR对孕前妇女CMV-IgM抗体水平的检测较传统ELISA法具有较高的敏感性及准确率,值得临床推广使用。
参考文献
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[3]方群,杜涛.先天巨细胞病毒感染胎儿的临床研究[J].中国优生与遗传杂志,2004,24(1):72-73,76.
[4]尚世强,陶然.儿童巨细胞病毒感染的诊断[J].实用儿科临床杂志,2006,21(22):1598-1600.
[5]消育权,叶小雅,邱秀群,等.993例女性巨细胞病毒抗体检测分析[J].现代医院,2009,9(5):79-80.
细胞骨架组分的荧光染色观察 第2篇
细胞骨架组分的荧光染色观察
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一、实验原理
鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用。因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。
二、实验目的
1．掌握细胞骨架的显示方法 2.掌握荧光显微镜的使用方法
3.了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构
三、实验器材 1.材料：
CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 2.试剂：
PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液。4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液。3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、荧光显微镜 4.其它用品：
盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。
四、方法与步骤
由于上节课鸡胚成纤维细胞被污染，本次实验所用细胞为CHO细胞（1）准备好实验器材。（本次实验无需在超净台中进行）
（2）将上节课进行细胞爬片的培养皿从培养箱中取出，取出盖片，于小平皿中。（3）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100处理约10min(1mL)（5）37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)（7）37℃预温 PEM洗3次
（8）55nM Alex-phalloidin 10µL湿盒中室温染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。（10）37℃预温 PEM洗数3次，滴加10µL Ho.33342复染色。（11）荧光显微镜下观察并拍照。
五、注意事项
1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。2.注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 3.各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 4.荧光观察注意避光操作，防止荧光淬灭。5.节约试剂。
六、实验结果
本次实验我们对CHO细胞爬片结果进行了荧光染色，在荧光显镜下用不同波长的激发光对细胞骨架微丝结构及细胞核进行了观察、拍摄照片并将结果叠加。得到以下的实验现象：
图1.CHO细胞微丝荧光染色图
图2.CHO细胞核荧光染色图
图3.CHO细胞微丝及细胞核荧光染色合成图
从拍摄的照片可以较为清晰的看到CHO细胞骨架的微丝被染成了绿色，细胞核被染成蓝色；微丝的形状为长条的纺锤状细丝，遍布整个细胞，在细胞中起到了类似骨架般的支撑作用；细胞核为椭圆形，之后再将两图合成，可观察到细胞核被遍布的微丝结构包围。实验较为成功。在实验时要注意荧光染料均存在淬灭问题，所以要尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。每步洗涤要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀释下一步的抗体或试剂，这样才能得到清晰的荧光图像。
【参考文献】
免疫细胞荧光论文 第3篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
病例为肾脏病理证实的肾小球疾病患者30例,患者为2003年4月～2007年12月在空军总医院住院或门诊患者。男18例,女12例。年龄12～68岁。病理诊断IgA肾病16例,肾小球微小病变10例,非IgA肾病的系膜细胞增殖性肾小球肾炎3例,局灶阶段性硬化性肾炎1例。临床明确诊断的非肾小球性血尿患者25例,包括一过性血尿14例,泌尿系统结石3例,泌尿系统肿瘤1例,泌尿系感染7例。
1.2 试剂与设备
①荧光标记的兔抗人THP抗体(一抗)、TRITC标记的山羊抗兔抗体(二抗)均购自尚柏生物公司,荧光显微镜为奥林巴斯IX81;②UF-100全自动尿液分析仪及配套试剂;③相差显微镜
1.3 方法
1.3.1 尿红细胞THP免疫荧光检测
①留患者尿5ml,4000r/min离心5min取出后倾去上清液加少量PBS重新混悬,离心后取沉淀铺片。②PBS洗3次,3min/次。③10%山羊血清封闭20分钟。④滴加适当比例稀释的一抗,4℃过夜。⑤从4℃冰箱取出,恢复至室温。PBS洗3次,3min/次。⑥避光滴加1:100稀释好的荧光二抗,37℃孵育1.5小时。⑦PBS洗3次,3min/次⑧用抗淬灭封片剂封片。⑨先在普通光源下计数总的红细胞数,然后切换至荧光下观察计数荧光阳性红细胞。每例计数至少100个红细胞,以荧光阳性细胞>70%为肾性血尿,<30%为非肾性血尿。染色阳性标本红细胞着清晰的黄绿色的荧光,容易和染色阴性的红细胞相鉴别。
1.3.2 尿红细胞相位差检测
①取新鲜尿液5ml,离心1500r/min,5min。②弃去上清液,留0.5 ml均匀涂片。③检查10个视野,计数100个红细胞,观察红细胞形态。④多形性红细胞>80%为肾性血尿,<20%为非肾性血尿。
1.3.3 患者尿白蛋白排泄率的测定
受试者留取24小时尿液,准确记录尿量,取5ml送检。采用免疫散射比浊法在ARROY型(意大利)特定蛋白分析仪上测定各个样品中的尿白蛋白,计算尿白蛋白排泄率。
1.4 统计学处理
采用SPSS12.0软件包进行统计学处理,组间比较采用秩和检验,相差显微镜法与THP染色法两种实验的评价采用Kappa检验。
2 结果
2.1 相差显微镜法、THP染色法鉴别血尿来源准确性的比较
在30例肾小球性血尿中,以THP染色阳性作为肾性血尿的诊断依据,染色阳性28例,以相差显微镜检测尿红细胞,多形性红细胞>80%为24例,在25例非肾小球性血尿中,相差显微镜法正确诊断18例,有7例与实际诊断不符,而THP染色法正确诊断22例,3例与实际诊断不符。两种方法在敏感性、特异性、准确性、漏诊率、误诊率、等方面的比较见表1,尿红细胞THP检测法在敏感性、特异性、准确性、漏诊率、误诊率、正确率方面优于尿红细胞形态检测法,结果见表1。
2.2 肾性血尿红细胞的数量与肾脏损害严重程度的关系
表2显示,肾性血尿红细胞数相对偏少,红细胞<20/HP 25例,占83.3%。轻度血尿组、中度血尿组、重度血尿组分别进行尿微量白蛋白排泄率(UAER)的测定,结果显示三组血尿UAER无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
肾小球疾病的临床表现主要有血尿、蛋白尿、高血压等。在血尿的实验室检查中,有很多方法鉴别其来源。本文所用的相差显微镜法和THP免疫荧光染色法各有优缺点。
相差显微镜检查尿红细胞是临床最常用的鉴别尿红细胞来源的方法,若异型红细胞>80%为肾性血尿,但该方法受标本放置时间、尿理化性质和人主观因素的影响,导致了临床判断的不准确[1]。
THP是尿中构成管型的大分子糖蛋白,由肾小管髓袢升枝粗段和远曲小管近段上皮细胞分泌。肾小球来源的红细胞经过肾小管时,表面被THP包裹,而非肾小球性血尿中红细胞不经过髓袢及远端小管,因此表面不会被THP覆盖,据此可成功将二者区别开来[2]。本文采用免疫荧光染色法来检测尿红细胞THP蛋白,染色阳性红细胞>70%判定为肾性血尿[3]。此法重复性好,结果客观、稳定、可靠,但唯显不足的是该方法需要荧光显微镜,操作略显复杂。
肾活检为一种创伤性检查方式,一般不被患者所接受。尿红细胞的THP免疫荧光染色的方法与肾活检的符合率达到了90.9%,此方法能否代替尿位相和部分代替肾活检有待于今后大量临床试验证实。
肾小球肾炎时,尿中微量蛋白会有不同程度的漏出,尿微量白蛋白测定可反映肾小球的受损程度,文献报道[4],尿液中微量白蛋白浓度与肾脏病理严重程度成正相关。本文中,我们将轻微血尿、中度血尿和重度血尿组尿白蛋白排泄率进行了相关分析,说明尿红细胞的排出数量与肾脏损害程度无关。随着我们选取病例的增加,两者是否有相关性,还需要大量的实验证实。
摘要：目的:评价Tamm-Horsfall(THP)免疫荧光染色法和相差显微镜法在肾性血尿诊断中的意义。方法:对诊断明确的30例肾小球性血尿和25例非肾性血尿同时进行尿红细胞THP免疫荧光检测和相差显微镜形态检测,比较两种方法在确定血尿来源的差异,并对血尿严重程度与尿白蛋白排泄率(UAER)做相关分析。结果:在30例肾小球性血尿中,红细胞THP检测法确定肾小球性血尿28例,2例与诊断不符;在25例非肾小球性血尿中,红细胞THP检测法确定为非肾小球性血尿22例,3例与诊断不符。红细胞THP检测法灵敏度为93.3%、特异性为88.0%、准确性为90.9%、漏诊率为6.7%、误诊率为12.0%。尿红细胞的形态检测法敏感性为80.0%、特异性为72.0%、准确性为66.3%、漏诊率为20.0%、误诊率为28.0%。血尿严重程度与肾脏损害程度不相关。结论:尿红细胞THP免疫荧光法在检测血尿来源方面具有准确、客观的优点,可在临床推广使用。
关键词：肾性血尿,相差显微镜,Tamm-Horsfall蛋白,免疫荧光染色
参考文献
[1] Gold wasser P,Antignani A,Avran MM.Effect of chemistry on red cells[J]. Nephron,1991,59:328-330
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免疫细胞荧光论文 第4篇
1 材料与方法
1.1 检测对象
1.1.1 正常对照组
150例HBsAg阴性血清标本为本院输血科提供,年龄18～46岁,平均(32±14)岁,其中男性97例、女性53例。
1.1.2 乙型肝炎组
261例HBsAg阳性血清标本来源于本院门诊及住院患者,年龄2～76岁,平均(39±37)岁,其中女性164例、男性97例。
1.2 仪器、试剂
TRFIA采用Anytes2003版时间分辨荧光免疫测量仪,TRFIA定量试剂盒由广州市丰华生物工程有限公司提供,批号:20081007;RIA采用国营二六二厂生产的Cap-RIA 16检测仪。RIA定量分析试剂盒由原子高科股份有限公司提供,批号:20081121;ECLIA定量分析为罗氏2010电化学发光仪。试剂盒由德国罗氏诊断有限公司提供,批号:20080905。
1.3 方法
对以上两组血清标本分别采用两种方法(TRFIA和RIA)对其HBV标志物检测,TRFIA法和RIA法均按试剂盒使用说明书操作规程进行标本及质控物检测,其结果不一致时,用ECLIA法确诊,所有操作步骤均严格按照仪器及试剂盒说明书进行。
1.4 阳性判断标准
HBsAg>0.2ng/m L、HBs-Ab>5.0m IU/m L、Hbe Ag>0.03Ncu/mL、Hbe-Ab<2.0Ncu/mL、HBc-Ab<0.6Ncu/mL。结果为阳性。
1.5 统计学处理
两法比较进行四表格χ2检验。
2 结果
2.1 TRFIA敏感性试验.
按说明书提供的敏感度数据,对TRFIA法和RIA法进行两种定值血清浓度检测和比较,发现TRFIA法较RIA法敏感见表1。
2.2 TRFIA检测的重复性
用TRFIA法对1ng/mLHBsAg定值血清重复20次测定,CV值为3.5%。
2.3 特异性检测结果
TRFIA法对两组血清标本中HBSAg正确检测率为(261/261、150/150)100%,结果见表2。
2.4 TRFIA法与RIA法对411份血清标本的HBV定量检测结果比较见表3。
从上表中看出,TRFIA法与RIA法比较,HBs Ag、HBs Ab、HBe Ag、HBe Ab、HBc Ab结果符合率较高,两法的阳性符合率为99%以上,经χ2检验差异无统计学意义(χ2=0.93,P>0.05)。TRFIA法检测正确率为100%,RIA法的检测正确率为99.2%,HBs Ag假阴性2例占0.8%,其中有2份标本TRFIA法检测为阳性而RIA法检测为阴性,用ECLIA法进一步证实为弱阳性。其中有3份标本TRFIA法检测HBc Ab为阴性而RIA法检测为阳性。
2.5 抗干扰试验
取HBSAg中质血清分成四份,每份分别加入50U/L人绒毛膜促性腺激素(HCG)25U/L,促卵泡生成素(FSH)250U/L,促黄体生成素(LH),对照组加入一定量生理盐水,同时进行检测,激素的交叉反应不影响结果判断。测定结果见表4。
3 讨论
RIA法检测结果的敏感度、特异性、稳定性都较酶联免疫法理想,但是试剂保存时间短,存在放射性衰减及放射性污染问题。
TRFIA是近年来发展起来的一种新的免疫测定方法,其标记物Eu3+螯合物具有较长荧光寿命,利用时间分别荧光分析仪延缓测量时间,可排除标本中非特异性荧光的干扰,实现“零”本底测试,同时激发光与荧光的波长差别显著,其波长转变达273nm,可有效排除激发光的干扰,所得的信号完全是稀土元素螯合物发出的特异性荧光信号。标记物为原子标记,体积很小,标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被测物质的稳定性,又可实现多位点标记。标记物稳定就可以对标记物进行多次激发。通过对每次激发的荧光信号累加后取平均值的办法,可以大大减少偶然误差的产生,提高检测的准确度[3]。从表1中可以看出TRFIA法比RIA法的敏感度要高,从表2中可以看出TRFIA法的特异性强,阴性与阳性符合率为100%;从表3、表4中看出:在几种方法中,由于TRFIA不受样品的自然荧光干扰,TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身(如表5所示),具有敏感度高、特异性强、稳定性好、试剂保存时间长、检测重复性好、操作简便、示踪物稳定、可进行定量分析、无环境污染等优点。
ECLIA是目前国际上认可的一种检测HBV较好的方法[4],其敏感度和稳定性均能达到临床和科研要求,但由于仪器昂贵,试剂成本高,不适合基层医院使用。
免疫细胞荧光论文 第5篇
1资料与方法
1.1 临床资料
2009年9月-2010年4月来我院就诊的疑似乙肝病毒感染的体检及住院患者235例。其中,男152例,女83例;年龄(31.5±8.33)岁。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 试剂:
定性检测采用英科厦门新创生物技术有限公司提供的酶联免疫吸附试验试剂盒(批号为20090825)。定量检测采用苏州新波生物技术有限公司提供的配套试剂盒(批号为20090830)。乙肝两对半质控血清由卫生部临床检验中心提供(HBsAg为1ng/ml,HBsAb为30mU/ml,HBeAg为2NcU/ml,HBeAb为4NcU/ml,HBcAb为2NcU/ml),批号为0904。
1.2.2 仪器:
酶标仪由奥地利Sunrise公司提供的128C酶标仪,SYMBIO时间分辨荧光免疫分析仪由苏州新波生物技术有限公司提供。
1.3 方法
同时采用TRIFA和ELISA对235例血清标本进行乙肝两对半测定,所有操作均严格按照说明书进行。
1.3.1 TRFIA测定乙肝五项的重复性评价:
取卫生部临检中心提供的定值质控血清检测乙肝两对半,每天1次,连续检测20d,分别求得五项指标的均值(
1.3.2 TRFIA测定乙肝五项的准确性评价:
采用试剂盒提供的标准品C和E各重复测定3次,取其各自平均值,将检测结果与靶值对比,计算其比值是否在0.90～1.10之间。
1.4 统计学方法
计数资料以率(%)表示,检测结果采取χ2检验进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 TRFIA测定乙肝五项的重复性评价
各项指标的批间变异系数均在20%范围内。见表1。
2.2 TRFIA测定乙肝五项的准确性评价
各项指标的实测平均值与其相应靶值的比全部都在0.90～1.10。见表2。
2.3 TRFIA和ELISA检测乙肝血清标志物结果
2种方法在HBsAg和HBeAg的检出率上差异无统计学意义(P>0.05),其他3项的检出率差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3。
注:与ELISA相比,*P<0.01
2.4 TRFIA和ELISA检测乙肝两对半模式的结果
TRFIA共测出10种模式,而ELISA共测出11种模式。G组(2,4,5模式)TRFIA检出率显著高于ELISA检出率(P<0.05),其他模式差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。
注:与ELISA比较,*P<0.05;表中1、2、3、4、5分别代表HbsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbcAb
3讨论
目前,临床上检测乙肝血清标志物应用最多的是ELISA,由于其操作简便快速,成本低廉,适于大批量样本检测,灵敏度、特异性基本满足乙肝标志物定性检测的要求,但该法影响因素较多,检测结果易受污染、操作手法、前带现象[1]等多种因素的影响,会出现假阳性或假阴性,从而造成漏诊和误诊。该法只能定性判断无法定量判断,对于病情监测、疗效观察及预后评估带来诸多不便。TRFIA是近20年来发展起来的一种微量分析方法,它采用镧系稀土元素及其螯合物(如Eu3+)作为示踪标记抗体或抗原来检测标本中相应的抗原或抗体。镧系元素及其螯合物有较长的荧光寿命[2],利用时间分辨荧光分析仪在激发后延迟测量时间,避免了非特异性荧光的干扰,提高了检测的特异性。根据镧系元素发光时Stokes位移大[3],可达290nm,有效地避免了由于Stokes位移小、激发光谱和发射光谱部分重叠而造成的干扰,提高了光谱的分辨率。
本文TRFIA阳性而ELISA阴性的11例HBsAb中,浓度介于(13.78±13.87)U/ml,与黄宪章等[4]报道一致;TRFIA阳性而ELISA阴性的18例HBeAb中,浓度介于(0.42±0.37)PEU/ml;TRFIA阳性而ELISA阴性的27例HBcAb中,浓度处于(1.83±0.76)PEU/ml。TRFIA对乙肝五项测定的重复性及准确性试验均达到要求。TRFIA检测乙肝五项与ELISA符合率均在90%以上,灵敏度均在99%以上,特异性依次为98.7%、85.1%、99.0%、88.3%、78.7%。本文结果显示TRFIA乙肝五项的检出率均高于ELISA,但HBsAg和HBeAg 2项的检出率与ELISA无统计学意义(P>0.05),而HBsAb、HBeAb及HBcAb的检出率显著高于ELISA(P<0.01),以上提示TRFIA测定乙肝标志物的灵敏度较ELISA高尤其是在抗体的测定上,可检测出低浓度的标志物,对减少HBV感染的漏诊及误诊有重要意义。
TRFIA能准确检测各项乙肝血清标志物的具体浓度,弥补了ELISA只能定性判断的不足,对乙肝病程、治疗及预后起到了一个全面动态监测作用,为临床指导用药提供可靠实验依据。定量监测HbsAg及HbsAb,可反映急性乙肝是否处于恢复期;定量监测HbeAg及HbeAb,可反映病情变化及治疗效果;定量监测HbcAb可反映病毒感染状态;有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。HbsAb浓度的定量监测,有利于对乙肝疫苗免疫力进行评价[5],对高危人群尤其是少年儿童预防乙型肝炎方面具有重要意义。本文两对半模式测定TRFIA共测出10种模式,而ELISA共测出11种模式。TRFIA共检出4例1,2,3,5模式、3例1,2,4,5模式以及2例1,3,4,5模式,这明显比ELISA的检出率高。可能是HBV病毒发生变异后,表达量较低,也可能是处于血清学转换阶段,常规ELISA测不出低浓度的抗原或抗体。以上提示,TRFIA具有极高的敏感性,可检测出常规ELISA测不出来的抗原或抗体,对亚临床型、非典型感染以及不同亚型HBV感染有较高的检出率。本研究I组(4,5模式)、J组(2模式)、K组(全阴模式)及L组(5模式)TRFIA检出率均低于ELISA,而G组(2,4,5模式)、H组(2,5模式)TRFIA检出率均高于ELISA,其中G组(2,4,5模式)TRFIA检出率显著高于ELISA(P<0.05),提示TRFIA在乙肝两对半模式尤其是抗体模式的检测上和ELISA有差异,可能是TRFIA较敏感,可检测出ELISA测不出的低浓度抗体。
综上所述,TRFIA不仅是目前最具发展前途的超微量分析技术[6],而且是一种比较理想的乙肝血清标志物的定量测定方法。TRFIA具有灵敏度高、特异性强、示踪物稳定、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等优点[7],与ELISA相比,其操作避免人为因素所造成的干扰,结果更加客观。随着TRFIA仪器及试剂国产化、检测费用的降低,TRFIA将逐步推广。
摘要：目的 比较时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对乙肝两对半的测定结果,探讨TRFIA在乙肝两对半测定中的应用价值。方法 采用TRFIA对其配套两对半试剂盒进行准确性和重复性测试。对235例临床标本采用TRFIA和ELISA2种方法同时测定乙肝两对半,并对结果进行分析。结果 TRFIA试剂盒测定乙肝五项指标具有良好的准确性和重复性。与ELISA相比,TRFIA在HbsAg与HBeAg的测定上差异无统计学意义(P>0.05),而在HbsAb、HbeAb及HBcAb的测定上差异均有统计学意义(P<0.01)。在两对半模式的测定上,TRFIA与ELISA相比在HbsAb、HbeAb、HbcAb模式的检出率显著增高(P<0.05),其他医学模式相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TRFIA较ELISA特异性强、灵敏度高,是一种比较理想的定量检测方法。TRFIA通过乙肝两对半的定量测定为乙肝诊断、治疗及预后提供全面动态监测,并为疫苗接种提供可靠依据。
关键词：时间分辨荧光免疫分析技术,酶联免疫吸附试验,乙肝两对半
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免疫细胞荧光论文 第6篇
1 材料
1.1 试验动物
雌性Balb/c SPF小鼠,购于北京华阜康生物科技有限公司。所有小鼠饲养在单独的隔离器中,食物和水均经过高压灭菌。小鼠长到8~10周龄后颈椎脱臼处死,并取小鼠肠道,用10%福尔马林固定,备用。
1.2 主要试剂与仪器
小牛血清,浙江天杭生物科技有限公司生产;兔抗鼠RegⅢγ一抗、CY3标记的山羊抗兔Ig G二抗,Bioss公司生产;DAPI,Sigma公司生产;0.01 mol/LLPBS(p H值为7.2)、3%CH3OH-H2O2溶液、0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(p H值为6.0),吉林农业科技学院动物医学检测中心提供;荧光倒置显微镜(型号为IX51),OLYMPUS公司生产;恒温箱(型号为3111),Thermo公司生产。
2 方法
2.1 石蜡切片的制作
取颈椎处死的小鼠肠道置于10%福尔马林溶液中固定,固定时间分别设置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h[10,11,12,13]。之后于自来水中冲洗过夜,经50%~100%梯度乙醇脱水各梯度均30 min,无水乙醇二甲苯1∶1混合溶液30 min,二甲苯透明30 min,60℃浸蜡2 h,并进行石蜡包埋。连续切4μm厚的石蜡切片,40℃水浴展片,60℃烤箱烤片50 min,二甲苯脱蜡20 min共2次,梯度乙醇及纯化水水化。
2.2 最适抗原修复条件的确定
将制备好的组织切片PBS浸洗5 min共2次,加3%CH3OH-H2O2溶液封闭10 min,PBS清洗5 min共2次,0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液95℃水浴加热[14]。根据参考文献[10,13],将加热时间分别设置为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。加热修复后滴加抗原修复液孵育10 min,缓慢冷却至室温。PBS浸洗5 min共3次,加入10%小牛血清抗原封闭30 min。无抗原修复组,切片脱蜡复水后PBS浸洗,其他步骤与抗原修复组相同。
2.3 免疫荧光抗体最佳工作浓度的确定
兔抗鼠RegⅢγ一抗最佳稀释浓度的确定:根据兔抗鼠RegⅢγ一抗说明书推荐的稀释浓度1∶500~1∶1 000,并根据参考文献[15-16]将一抗的稀释浓度做了更大范围的探索,选取同一肠段的已阻断处理的小鼠肠道组织切片。二抗的稀释浓度固定为1∶200,分别对一抗进行1∶200,1∶300,1∶500,1∶700,1∶1 000,1∶1 200倍的稀释。4℃孵育过夜,37℃复温1 h,PBS清洗5 min共3次。选择荧光明亮清晰且稀释倍数最大,稀释度为一抗最佳工作浓度。
山羊抗兔Ig G二抗最佳稀释浓度确定:综合二抗说明书及参考文献[15-16]的稀释范围将二抗稀释倍数定为1∶100,1∶200,1∶300,1∶400,1∶500,1∶600。依次加入组织切片中,37℃温箱避光孵育1 h,PBS清洗5 min共3次,常规DAPI复染,镜检。
2.4 设置其他试验分组
重复试验组,取相同批次的小鼠小肠组织切片、一抗、二抗及DAPI,设置相同条件进行重复性试验,观察荧光强度是否有所改变,检验本方法是否具有重复性。自发荧光组,切片脱蜡复水后直接滴加0.01 mol/L PBS,置于荧光倒置显微镜下,检测样本是否存在自发光现象。空白对照组,用PBS替代一抗,进行间接免疫荧光试验,检测二抗本身是否有非特异性反应并设阳性对照组。
2.5 观察结果
对所有石蜡切片进行镜检,观察组织完整度、机构清晰性,衡量抗原修复和染色方法对组织的破坏程度;观察蛋白阳性荧光信号强度,评定检测方法敏感性;观察阴性样品表达荧光信号,评定染色方法特异性。所有照片均未经过对比度、亮度等调节处理,以最终样本荧光染色后的图像作为观察指标,衡量检测方法的优劣。
3 结果与分析
3.1 不同固定时间对免疫荧光结果的影响
对颈椎脱臼处死的小鼠肠道以相同体积分数的甲醛作为固定液,用不同时间进行固定,根据不同固定时间组织固定是否充分、组织切片蛋白交联程度,最终确定小鼠肠道RegⅢγIFA试验中,确定6 h为最佳固定时间。
3.2 不同抗原修复时间对石蜡包埋组织的影响
对于已知有表达RegⅢγ的阳性标本,未见抗原修复组染色不良,见289页彩图1A。柠檬酸盐缓冲液95℃修复15 min染色良好,对比修复20 min荧光强度相同,且组织形态更完整,结构清晰,见289页彩图1 B、C。修复30 min组织结构模糊,表明过长时间的修复使组织遭到破坏,见289页彩图1D。提示高温热修复15~25 min均能表达较高的敏感性。而对于组织结构完整性和清晰度,由高到低顺序为:高温修复15 min组>高温修复20 min组>高温修复25 min组。
3.3 抗体最佳工作条件的确定
根据镜检结果,判定特异性荧光强度和荧光蛋白的数量,在保证既避免非特异性荧光的干扰,又有特异性荧光以便观察的条件下,一抗的稀释度为1∶300~1∶700时均可见明亮的特异性荧光。3个稀释梯度中以1∶500时镜检结果最为清晰,背景染色低,特异性最强;一抗的稀释度为1∶700时荧光强度微弱,对RegⅢγ表达情况难以做出判断;一抗的稀释度为1∶300时可见荧光强度非常高,考虑到实际应用时染色成本以及染色结果的特异性,确定1∶500倍稀释作为最适稀释浓度。
当二抗稀释度为1∶300~1∶500时均可见特异性荧光,荧光亮度为1∶300时强度最亮且特异性最好,RegⅢγ蛋白呈现亮红色荧光带,分布于小肠黏膜表面,特异性荧光最明显;稀释度为1∶400时荧光已变弱,特异性降低。确定山羊抗兔Ig G荧光抗体的最适稀释浓度为1∶300,见289页彩图2。
3.4 其他试验分组结果
相同条件下对同批切片进行重复性试验,结果表明,试验结果与判定结果完全相同,荧光只有微小改变,提示本方法重复性好。样本自发荧光对照试验结果表明,阳性对照组IFA呈现明显特异性荧光,而将新的封闭处理过的组织切片滴加0.01 mol/L的PBS后直接置于荧光倒置显微镜下观察,不存在自发荧光。空白对照试验结果表明,以PBS代替一抗进行IFA试验,抗原与二抗之间无非特异性反应,免疫荧光显微镜下呈深色背景。
4 讨论
在RegⅢγ蛋白IFA检测过程中,检测条件是影响该检测方法准确性的直接因素。根据本试验的特点,笔者在试验各环节分别作了大量的尝试性试验,确定了检测RegⅢγ蛋白的最适条件。在制作石蜡切片过程中参照参考文献[10-13]发现,免疫荧光试验中常用组织固定时间为3~6 h、12 h、24 h,其中以12 h为最佳的居多[10,11]。但甲醛固定使蛋白质交联,抗原决定簇封闭[17,18,19],导致荧光抗体无法结合。笔者在前人研究结果基础上对小鼠肠道固定时间进行了长期探索,固定12 h或24 h可将小肠固定充分,肠组织交联严重,抗原修复难度大,RegⅢγ蛋白荧光敏感性降低;固定3 h组织固定时间短,固定不充分,后续试验发现组织结构完整性低。综合考虑固定充分性及组织交联情况,最终确定甲醛固定的最佳时间为6 h。小鼠肠道属于管腔结构,且组织厚度低,固定6 h既能达到充分固定,又能降低蛋白交联强度。二者达到最佳平衡点,因此可以作为肠道中RegⅢγ蛋白IFA试验组织固定时间。
抗原修复可将固定时分子之间所形成的交联打破,恢复抗原原有形态。其也成为了甲醛固定组织免疫荧光检测过程中重要的影响因素。试验中,笔者选用柠檬酸盐缓冲液95℃加热15 min后滴加抗原修复液,室温缓慢冷却。高温修复是一种强烈的修复方式,以往研究中选择沸水浴或高温高压加热10 min[10,17,18,19,20],也有研究将修复温度降低至95℃,修复时间为30 min[14]作为最佳修复条件。考虑本试验中RegⅢγ蛋白在肠道中分布量较少,小鼠肠道管壁薄且组织结构复杂,在进行抗原修复时分别设置了95℃、100℃2个温度梯度,5组不同时间。最终筛选出最佳修复条件为95℃15 min。100℃沸水浴和高温、高压修复对组织有一定程度的破坏,安全性低,95℃修复结果稳定,安全性高。15 min的修复时间既能保证RegⅢγ蛋白荧光的特异性,又大大降低了过度修复对组织结构的破坏率。10 min的修复时间修复不足,抗体结合率低,20 min以上的修复时间过长,修复过度又导致组织结构破坏,因此热修复的温度和时间必须精确把握。最终确定本检测方法中抗原修复最佳条件为95℃水浴修复15 min。
在保证抗体本身特异性的基础上,决定IFA敏感性的另一因素为抗体浓度。笔者参考抗体说明书及参考文献[15-16]将一抗、二抗浓度分别作不同稀释倍数,结果表明,一抗、二抗的最佳稀释浓度为1∶500,1∶300,同时在充分的抗原封闭条件下,并不增加背景信号。这与张舍郁[15]1∶200,1∶100的稀释浓度及李红阁等[16]1∶500,1∶500的稀释浓度的研究结果存在差异,可能与不同组织及目的蛋白不同有关。该试验选用经典的DAPI(0.1 mg/m L)衬染,将组织细胞核染成亮蓝色,与特异性红色荧光形成鲜明对比,提高了组织结构分辨率。此外,充分的二甲苯脱蜡、抗原封闭及PBS清洗均能提高试验特异性,大大降低背景荧光信号,保证试验结果清晰明亮。
5 结论
免疫细胞荧光论文 第7篇
1资料和方法
1.1一般资料本院在2013年1月~2014年12月所收治的上呼吸道感染患者200例,其中男128例,女74例,年龄3~89(56.4±2.8)岁。其中29例喉部感染,68例咽部感染,93例鼻部感染,13例并发急性心肌炎,10例并发肾炎,8例并发风湿热。
1.2研究方法
1.2.1检验试剂荧光标志的单克隆抗体试剂盒(美国DHI),针对腺病毒,呼吸道合胞病毒,流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、2、3型试剂盒。封闭液、病原体相关对照玻片,其中包含阳性对照记阴性对照的点样孔,浓缩性的洗涤液。
1.2.2检测方法操作步骤:(1)应用负压吸引器,患者鼻咽喉处析出2~3ml分泌物;(2)反复的吹打,放入离心管;(3)离心操作,转数500 r/min,8min,去除上清液;(4)使用磷酸盐液体对产生的沉淀进行清洗;(5)再次离心,去掉表面物质,,直到清液不再粘稠;(6)从设备中取出标本,然后放入0.5~1ml的磷酸盐缓冲盐溶液中,反复吹打;(7)风干点样孔,使用冷丙酮对其固定10min。荧光染色:(1)滴加荧光抗体到对照玻片样孔中的细胞中,保持其处于37℃0.5h,1~7号样孔滴加荧光标志抗体,阳性对照的单克隆抗体;(2)用蒸馏水洗涤玻璃片数次;(3)干燥并向玻璃片中滴加1滴液体,作为封闭液,盖上玻璃片,显微镜对其观察分析。
1.3诊断依据与荧光标志之后的单克隆抗体,在荧光显微镜下,变成绿色,为阳性;而未被染色结合体,被Evans蓝染为红色,未出现荧光效应阴性。对标本放大200倍,如大于或是等于2个的荧光细胞为阳性。
2结果
上呼吸道病毒感染患者感染种类及感染率。见附表。
3讨论
呼吸道发生感染的患者检测中使用免疫荧光法,其能对患者所感染病毒的种类进行辨别。在试验中主要要求试剂对关键的部分有很高的敏感性,比如其中的抗原[3],在滴入试剂后,具有高度的特异性,即单特异性抗体制剂[3]。通过人工的方法,合成了高纯度的这种双糖结构,让其和蛋白质结合成免疫原,形成单特异性抗体,经过确定其有很强的群特异性极,除此之外,近些年新发展起来的单克隆抗体制取技术,为制备各种单特异性抗体打开了另一条有效途径。本次研究中,通过对患者相对应的抗体作抗原抗体和细胞标本之间的反应,观察反应阳性与否,进而判断患者相对应的感染病毒种类。结果显示176例患者的病毒感染呈现阳性,得出其病毒感染率是87.12%。使用免疫荧光法近些检测,能准确快速的得到结果,同时免疫荧光法还可以能够准确快速的检测出所有患者感染呼吸道的种类,效果十分可靠
总而言之,免疫荧光技术在微生物学快速检验的使用中,已经展示出了其很好的临床使用价值,虽然还有一些操作上的问题,但是和传统方式相比较,其优势已经非常明显,同时在以后的科学发展中,这项技术还会和其它先进技术结合,逐渐发展得更加完善,实践可行性更强。
摘要：研究中使用免疫荧光检测法,对202例上呼吸道发生感染的患者鼻咽中所分泌物行快速检测,以此来分析患有呼吸道感染的患者,其感染病毒的种类和发生的概率。有176例患者感染病毒为阳性,感染率87.12%在所有检查的上呼吸道感染患者中,大多数都发生了病毒性感染,而腺病毒感染最为严重。免疫荧光方法可以快速的检测出患者病毒感染种类,具有高敏感性,值得医院推广使用。
关键词：免疫荧光法,微生物,快速检验
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免疫细胞荧光论文 第8篇
1 资料与方法
1.1 临床资料
整群选取2012年8月—2014年8月于该院进行救治的188例乙肝患者,其中男98例,女90例,年龄25～78岁,平均年龄(47.4±2.9)岁。
1.2 仪器与试剂
HBV-M ELISA检测试剂盒由厦门新创科技公司提供;MR-96型自动酶标仪购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;TRFIA检测采用EFFICUTA全自动标本前处理系统、SYM-810时间分辨荧光分析仪(德国BMGLABTECH公司)[4]。
1.3 方法
患者取血前空腹6 h,采血管抽取静脉血后,37℃放置,分离血清后送检,并且于2 h内分别采用TRFIA、ELISA试剂盒,严格按各自说明书要求对HBV-M进行检测[5]。
1.4 观察指标
ELISA法严格按照说明书标准进行阳性判定,TRFIA法根据其浓度判断其阴阳性,若HBsAg>0.5 ng/mL、HBsAb>10 mIU/mL、HBeAg>0.03 NCU/mL、HBeAb>1.5 NCU/mL、HBcAb>0.1 NCU/mL为阳性[6]。
1.5 统计方法
采用SPSS15.0统计学软件对数据进行分析,计数资料采用χ2检验,检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两种方法检测血清学标志物阳性比较
在HBsAg和HBeAg的阳性率比较,两种方法差异不明显(P>0.05),TRFIA方法在抗-HBs、抗HBe,抗-HBc的检出的敏感度明显比ELIASA法高,差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。
2.2 两种方法检测血清标志物模式比较
两种方法在1,3,5(+)、1,5(+)、1,4,5(+)及其他模式中检出率无差异(P>0.05);TRFIA在2(+)和2,4,5(+)检测阳性率比ELSIA更显著(P<0.05),全阴性模式中TRFIA阳性率显著低于ELSIA (P<0.05),详见表2。
注:1,2,3,4,5分别为HBsAg,抗-HBs,HBeAg,抗-HBe,抗-HBc。
3 讨论
乙肝是一种全球广泛流行的传染病,而乙型肝炎的预防诊断与疗效评价等大都依赖HBV-M的检测。ELISA是目前临床上比较常用的用于检测乙肝病毒血清标志物的基于抗原抗体反应的方法之一,其优点是操作简单、快速、经济,但是其特异性和灵敏度不是很稳定,容易受到检测环境的影响,结果可靠性较差。同时由于该方法是通过采用目测颜色深浅进行判断,比较容易受到主观因素的影响,造成出现漏检和错检的现象[7]。TRFIA法则是以双功能基团的镧系元素为示踪物,通过标记抗原抗体,经解离增强技术放大有效荧光,用时间分辨技术对免疫反应产物的荧光强度进行测定[8]。因此具备高稳定性、干扰因素少等优点。有研究表明,TRFIA对HBsAg的最小可测值远远比ELISA法敏感,分别为0.05 ng/mL与2 ng/mL,这说明TRFLA较ELISA更加灵敏[9,10]。
该研究得出,TRFIA方法在抗-HBs、抗-HBe,抗-HBc的检出的敏感度明显比ELIASA法高,差异有统计学意义(P<0.05),表明TRFIA测定乙肝病毒血清标志物的灵敏度高于ELISA,这将极大的增加对HBV感染的检测率,减少其漏诊的可能性;TRFIA在2(+)和2,4,5(+)检测阳性率比ELSIA更显著(P<0.05),主要原因是TRFIA检测HBsAg灵敏度远远高于ELISA法,TRFIA法的最低检出限可以低至0.2 ng/mL,而ELISA则为2 ng/mL。即只有当血清中的HBsAg水平在2 ng/mL以上时,ELISA法才可以检测到阳性反应。谭业克团队进行的检测乙肝标志物的研究也表明,时间分辨荧光免疫法灵敏度更高,特异性更好,并且对乙型肝炎的疾病进程具有全程动态检测的作用,这也进一步增强了该方法的有效性[11]。
综上所述,在进行乙肝病毒血清标志物检测中,TRFIA法的灵敏度远远比ELISA法高,这表明TRFIA法更适合用于弱阳性标本的检测。同时,TRFIA还能进行定量,而ELISA法只能进行定性检测,定量检测的数值大小可以为判断HBV感染病情进展、病毒复制水平和治疗效果,以及疫苗注射效果等方面提供可靠依据,相信其具有越来越大的应用空间和重要性,值得在临床上广泛使用。
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