免疫脂质体范文（精选7篇）
免疫脂质体 第1篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
BalB/c纯系小鼠,由河南省实验动物中心提供,动物合格证号为SYXK(豫)2005-0012,4-6周龄,体重16～18 g,健康,清洁级饲养,60只,雌雄各半;小鼠H22肝癌细胞由BalB/c 小鼠腹腔传代,引自河南省医学科学研究所;新城疫病毒losota 株由河南农业大学牧医学院微生物教研室卢中华教授惠赠。大豆卵磷脂(PC),上海油脂一厂;胆固醇(CH),日本株式会社;十八烷氨(SA), sigma;牛血清白蛋白,B1B公司;新生小牛血清,天津正江高新技术开发公司;淋巴细胞分离液, 上海劲马生物科技有限公司; β-榄香烯,大连金港制药有限公司。Beckman高速低温离心机, Beckman公司; Eppendorf高速低温离心机C5417R, Eppendorf公司;CO2培养箱,美国A1SCO;旋转蒸发仪,上海玻璃仪器二厂;倒置显微镜,日本OLYMPUS;酶联免疫检测仪,第四军医大学。
1.2 方法
1.2.1 新城疫病毒修饰H22肝癌细胞及可溶性抗原的制备
参照文献[1]进行。
1.2.2 脂质体的制备及包封率测定
参照我所建立的方法[1,2,3]略加改进。
1.2.3 瘤苗的治疗实验
1.2.3.1 分组
将60只 BalB/c小鼠随机分为为3组,每组再分为两部分,一部分用于观察生存期,另一部分用来检测淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤效应。第1组为脂质体包裹NDV修饰的H22抗原组(LVAg组),第2组为脂质体共包裹β-榄香烯和H22抗原组(LEAg组),第3组为脂质体共包裹β-榄香烯和NDV-H22抗原组(LEVAg组)。
1.2.3.2 免疫治疗程序
第1天各小鼠腹腔接种H22 肝癌细胞1.1×106个/0.1 ml,24 h后腹腔接种各种疫苗0.1 ml,每毫升疫苗含3×107个H22 肝癌细胞所含的抗原,第一次免疫后一周强化免疫一次。
1.3 淋巴细胞对H22肝癌细胞的体外杀伤试验
1.3.1 脾淋巴细胞悬液的制备
第二次免疫后4 d,将用来检测细胞毒作用的小鼠取出,常规腹部消毒,无菌取脾,D-Hanks冲洗,玻璃匀浆器匀浆后过200目金属网,淋巴细胞分离液分离、制备淋巴细胞,用培养液调至5×105个/100 μ1。
1.3.2 脾淋巴细胞对H22
肝癌细胞的体外杀伤试验 参照黄永年[4]等的方法进行。
1.4 小鼠生存期的观察
每天记录各组小鼠存活数量,从接种之日起,连续观察50 d,存活>50 d者,认为长期存活。
1.5 统计学方法
用SPSS 11.5软件,应用方差分析ONE-WAY-ANOVA对生存期和淋巴细胞毒活性进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KCl法提取的可溶性抗原的蛋白含量
每106个 H22肝癌细胞所抽提的蛋白为107μg,每106个NDV修饰后H22肝癌细胞所抽提的蛋白为119 μg。
2.2 脂质体的包封率
脂质体对LVAg、LEAg、LEVAg的包封率分别39.45%, 44.38%和39.45%,对β-榄香烯的包封率为81.36%。
2.3 不同免疫治疗的效应观察
2.3.1 不同的免疫治疗对BalB/c小鼠生存期的影响
对荷瘤小鼠分别用不同的疫苗制剂间隔1周进行连续两次的免疫后,LVAg组、LEAg组和LEVAg组的平均生存期分别为(35.2±5.5)d、(37.8±3.7)d和(45.8±3.8)d,3组间差异有显著性(F=15.823,P<0.001),其中,LEVAg组的平均生存期长于LVAg组(P<0.001)和LEAg组(P<0.001),而后二者之间差异无显著性(P=0.197)。
2.3.2 不同免疫治疗组小鼠脾淋巴细胞体外杀伤H22肝癌细胞活性观察
在效靶比为50:1时,LVAg组、LEAg组和LEVAg组的脾淋巴细胞毒活性分别为:(30.0±2.8)、(29.0±1.5)和(46.4±1.9),3组间差异有显著性(F=210.105,P<0.001),其中,LEVAg组的脾淋巴细胞毒活性强于LVAg组(P<0.001)和LEAg组(P<0.001),而后二者之间差异无显著性(P=0.322)。
3 讨论
脂质体包裹可增加抗原的颗粒性,较可溶性抗原更易被抗原提呈细胞吞噬和提呈[5]。巨噬细胞对脂质体具有优先摄取,脂质体包裹的抗原可经巨噬细胞的MHC-Ⅰ途径激活CD+8T细胞,发挥主要的抗瘤作用,同时又可经MHC-Ⅱ途径激活CD+4T细胞,CD+4T细胞(包括Th细胞)被激活后释放细胞因子,一方面促进激活的CD+8T细胞的细胞毒活性,另一方面促进B细胞产生体液免疫,促进机体的抗瘤免疫作用。
病毒用于抗肿瘤免疫治疗最初源于“病毒异种化作用”的概念,即通过使肿瘤细胞表面带有外来病毒相关抗原,增强其免疫原性,易于为宿主的免疫系统识别。NDV是禽类的一种副粘液病毒,对癌细胞具有较强的亲和力,可在癌细胞内大量复制,而对正常细胞影响不大[6]。体外实验中,NDV致敏可显著增加DC-CIK对于胃癌细胞株的杀伤力[7]。在临床研究中,NDV修饰的自体肿瘤细胞疫苗能改善晚期结肠癌患者的生存[8]。
榄香烯为脂溶性的非细胞毒性的广谱抗肿瘤药物,同时又具有免疫增强作用。榄香烯能改变或增强肿瘤抗原的免疫原性,诱发或促进机体对肿瘤的免疫排斥作用[9]。此外,榄香烯能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数,增强CONA诱导的小鼠脾细胞的增殖,增加NK细胞的活性[10]。
本研究用NDV修饰脂质体瘤苗,以增强肿瘤抗原的免疫原性,更易为宿主识别,同时用免疫增强剂榄香烯来刺激机体免疫反应,获得了最强的抗瘤免疫效应,显著高于单用NDV修饰脂质体瘤苗和单用榄香烯修饰脂质体瘤苗,提示二者的协同增效作用。免疫效应的增强可能源于榄香烯的免疫增强作用,NDV的抗原异源化作用,以及脂质体包裹后的抗原提呈的作用的加强。 共包裹榄香烯和 NDV修饰的脂质体肝癌瘤苗有潜在的临床应用价值,为抗肝癌治疗提供有效的补充手段,值得临床进一步研究。
参考文献
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免疫脂质体 第2篇
1 材料
白桦脂醇标准品 (国家药品标准物质) ;白桦脂醇原料药 (宝鸡市方晟生物开发有限公司) ;注射用大豆卵磷脂 (上海晶纯实业有限公司) ;胆固醇 (上海晶纯实业有限公司) ;甲醇 (天津市科密欧化学试剂有限公司) ;无水乙醇 (天津市科密欧化学试剂有限公司) 。
2 方法
2.1 白桦脂醇脂质体的制备
2.1.1 薄膜分散法制备脂质体
称取处方量的磷脂、胆固醇和白桦脂醇, 置于250m L的茄形瓶中, 加入20m L的有机溶剂超声溶解, 减压旋转蒸发, 除去有机溶剂 (乙醇) , 向茄形瓶中加入适量的PBS, 30℃水浴洗膜, 水浴超声后过0.45μm滤膜, 即得脂质体。
2.1.2 单因素考察及工艺的优化
进行处方单因素考察, 选择白桦脂醇质量、白桦脂醇与卵磷脂质量比、卵磷脂与胆固醇的质量比及PBS的p H值4个因素, 见表1, 以包封率EE (%) 为考察指标, 进行L9 (34) 正交试验优化工艺。
2.2 白桦脂醇脂质体的制剂学研究
2.2.1 外观形态观察
在真空条件下将平铺于双面导电胶上白桦脂醇脂质体冻干粉末的表面喷金处理, 扫描电镜观察其形态。
2.2.2 粒度分布
室温条件下, 用水稀释按最佳处方制备的白桦脂醇脂质体溶液, 置于样品池中测定粒径大小及分布。
2.2.3 ζ电位的测定
取2m L用0.01M磷酸盐缓冲溶液 (最佳p H) 稀释10倍的按最佳处方制备的白桦脂醇脂质体溶液置于样品池中, 采用ζ电位分析仪测定脂质体表面的ζ电位, 每个样品测5次。
2.2.4 包封率及载药量的测定
制备3批白桦脂醇脂质体以离心法测定脂质体内包封的药物量和未包封的游离药物量, 用下式计算包封率和载药量。
式中, EE%-包封率;We-脂质体内包封的药物量;Wo-未包封的游离药物量。
2.2.5 体外释放测定
2.2.5. 1 体外释放标准曲线
称取白桦脂醇标准品1mg, 用PBS (p H7.4) 的缓冲液作为溶剂, 制备出100μg·m L-1的白桦脂醇标准溶液, 分别40、60、100、140、160、220μL。得到4、6、10、14、16、22μg·m L-1的标准溶液, 在200~400nm的波长范围内进行光谱扫描。
2.2.5. 2 体外释放曲线的绘制
量取适量白桦脂醇脂质体溶液, 置于处理过的透析袋中并扎紧袋两端, 放入装有释放介质 (p H7.4磷酸盐缓冲液) 的100 m L溶出杯中, 置于搅拌速度为100rpm·min-1, 温度为37℃的溶出度测定仪中。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h时取样5m L, 测定药物含量, 同时补加新鲜释放介质5m L。在相同的条件下考察白桦脂醇原料药的释放, 以累积释药百分率对时间作图, 分别绘制白桦脂醇脂质体和原料药的体外释放曲线。
3 结果
3.1 正交试验结果
由表2分析可知:根据R=|Kmax-Kmin|, 本次实验的各因素对实验影响的大小排序为:PBS的p H>卵磷脂的用量>白桦脂醇的用量>胆固醇的用量, 即D1>B1>A1>C2。所以, 最优处方为白桦脂醇质量为16mg, 卵磷脂的质量为80mg, 胆固醇的质量为35mg, PBS的p H为7.0。
3.2 制剂学研究结果
3.2.1 外观形态观察
由图1可观察到脂质体的大小均一, 粒子较圆整。
3.2.2 粒度分布测定
由图2可见白桦脂醇脂质体的粒径大部分都集中200~500nm。
3.2.3 ζ电位测定
由图3可见白桦脂醇脂质体的表面显负电性。
3.2.4 包封率和载药量
由表3可见平均包封率为43%, 载药量为1.22%。
3.2.5 体外释放实验结果
3.2.5. 1 标准曲线的绘制
分别对不同浓度的白桦脂醇标准溶液进样, 以吸光度 (A) 对浓度 (C) 进行线性回归, 得方程:A=0.0193C+0.0669 (r=0.9994) , 结果表明白桦脂醇在6~34μg·m L-1范围内线性关系良好。见图4。
3.2.5. 2 体外释放结果
由图5可见脂质体溶液在12h累积释放达64%, 说明其与原料药相比有一定的缓释效果。
4 讨论
白桦脂醇作为一种天然抗肿瘤药物, 其靶向制剂拥有广阔的开发前景。而脂质体是目前研究比较广泛的微粒给药系统, 其制备方法有超声分散法、薄膜分散法、乙醚注入法等[7]。本文采用薄膜分散法制备白桦脂醇脂质体, 粒径小, 质量佳, 且简便易行, 重复性高, 为白桦脂醇的靶向应用提供了可靠的依据。脂质体的包封率和稳定性与药脂比有着直接关系[6]。实验通过单因素考察选定白桦脂醇质量、白桦脂醇与卵磷脂质量比、卵磷脂与胆固醇的质量比及PBS的p H值4个因素, 以包封率为考察指标, 采用正交试验设计方法将工艺进一步优化, 得到最佳处方为:白桦脂醇16mg, 卵磷脂80mg, 胆固醇35mg, PBS p H为7.0。由此制得的白桦脂醇脂质体在电镜下观察可见大小均一, 形态圆整, 且具有一定缓释效果。为进一步观察其对肿瘤细胞的抑制作用奠定了基础。
摘要：目的:制备白桦脂醇脂质体, 优化其工艺并进行制剂学研究。方法:采用薄膜分散法制备白桦脂醇脂质体。进行单因素考察并采用L9 (34) 正交试验优化工艺。结果:最佳制备处方为白桦脂醇16mg, 卵磷脂80mg, 胆固醇35mg, PBS p H为7.0。由此制备的白桦脂醇脂质体溶液为乳白色半透明液体, 观察到其脂质体为类球形粒子, 形态圆整, 分布均匀, 平均粒径为200500nm, ζ电位为-25mv, 包封率为43%, 载药量为1.22%, 体外释放试验结果表明其具有一定的缓释作用。结论:薄膜分散法制备白桦脂醇脂质体粒径较小, 方法简便, 重复性高, 适用于白桦脂醇脂质体的制备。
关键词：白桦脂醇,脂质体,薄膜分散法,制剂学研究
参考文献
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脂质体制备方法研究概况 第3篇
1.1 薄膜分散法
薄膜分散法具有工艺简单、易于操作等特点,是最基本、最广泛应用的方法,其是将膜材(如卵磷脂、胆固醇等)以及脂溶性药物溶于适量有机溶剂中(常用氯仿),减压旋转或真空干燥除去溶剂,使其在器壁形成薄膜,然后将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中,再加入到已形成薄膜的容器中,最后利用各种机械力使之分散形成脂质体。该法主要适用于脂溶性药物,尤其适用于挥发油类脂质体的制备,如采用该法制备肉豆蔻挥发油脂质体[1],并通过测定得到其包封率为(86±5.3)%。
杨占娴等[2,3]设计合成了异烟肼磷脂衍生物1,2-二-4-(2-异烟酰基肼基)-4-氧代丁酮酰基磷脂酰胆碱,以该两亲性化合物为单一原料,用薄膜超声分散法制备脂质体。通过透射电镜(TEM)观察到脂质体呈椭球形,动态光散射(DLS)测定发现随超声时间的延长,脂质体的粒径逐渐减小。经测定,该异烟肼磷脂衍生物脂质体的药脂比为2,磷脂浓度为0.20mgmL-1时的包封率大于99.9%。
1.2 逆相蒸发法
逆相蒸发法的应用也十分广泛,水溶性药物和水不溶性药物都可以使用该法,而且具有较高的包封率。对于水溶性药物,该法先将膜材和有机溶剂混合,加入溶解了药物的水溶液,超声直至形成比较稳定的W/O型乳液,减压回收有机溶剂使之处于胶态后,加入磷酸盐缓冲溶液,水化,继续减压蒸发,超声即得。但制备过程中超声以及减压回收溶剂的温度可能会使某些热敏性药物发生变性。
臧国栋等[4]采用逆相蒸发法制备维生素A修饰的姜黄素脂质体,所得粒径小于1.58μm的脂质体粒子平均占有率为57%,平均包封率为(89.3±0.62)%,维生素A的平均结合率为(61.3±0.79)%。通过体外释药实验测得其在48h内的累计释放量在85%以上。
1.3 离子梯度法
离子梯度法是根据待制备成脂质体的药物及其他成分的酸碱性的不同,通过调整制备过程中各个阶段的pH值,使得药物和其他成分在不同的制备阶段以不同的形式存在,从而在脂质双分子层内外自由出入。在制备脂质体中,常用的离子梯度法有三种,分别为pH梯度法、硫酸铵梯度法以及其他离子梯度法(如CH3COO-、Mn2+等)。硫酸铵梯度法以及其他离子梯度法能够将药物载入脂质体内的最根本动力都可以归因于pH梯度,只是pH梯度的产生方法有直接和间接之分。离子梯度法克服了被包裹药物早期的突释和泄露,适用于不同的脂质包材和配方,包埋后生成的脂质体具有包埋效率高,不需清除外部游离药物的特点。该法适用于两亲性药物,如弱酸、弱碱性和生物碱类药物。
1.4 溶剂注入法
该法常用的溶剂有乙醇、乙醚,是将脂溶性药物和脂质溶于适当的溶剂中,然后将此药液注入缓冲液中,超声即可得到。乙醇注入法具有重现性好,操作简单、制备温度较低等特点,适用于醇溶性药物,能够避免挥发油类药物受热分解,如川芎挥发油脂质体的制备[5]。但制备速度较慢,仅可用于少量制备,不适合大量制备,且用于水溶性药物的脂质体制备时包封率低。
乙醚注入法操作简单,乙醚易挥发、容易除尽,膜材(卵磷脂、胆固醇等)在乙醚中的溶解度大于在乙醇中的溶解度,适合脂溶性药物脂质体的制备。制备过程中加入表面活性剂可以防止脂质体粒子之间发生膜溶合,维持体系的稳定。在没有表面活性剂的情况下,脂质体整个体系的粒径分布不均匀,容易发生凝聚现象;当表面活性剂用量过多时,表面活性剂分子会镶嵌到脂质双分子层中,使双层膜上出现泄漏点,从而降低包封率[6]。
1.5 冷冻干燥法
冷冻干燥法所制备的脂质体具有粒径小(200nm以内)、稳定性好、灭菌贮存方便等特点,特别适合于对热敏感的药物脂质体的制备。其是将类脂高度分散在水溶液中,冷冻干燥,然后再分散至含药的水性介质中,从而形成脂质体,因此常与其他制备方法合用以增加脂质体制剂的稳定性。其也是用来包裹蛋白质、多肽等在水溶液中不稳定的物质的主要方法[7],用此法制备脂溶性药物如尼莫地平时,包封率可达90%左右[8]。
1.6 联合制备法
联合制备法是指在脂质体的制备过程中,将两种或两种以上的制备方法结合起来使用的一种方法。多种方法联合用于脂质体的制备,可使得所制备产品的质量更佳、性状更稳定。如采用pH梯度结合逆向蒸发法制得的槐定碱纳米脂质体[9]还具有一定的缓释作用。
采用该法可提高脂质体的稳定性,延长保存时间。如姜素芳等[10]采用薄膜-超声-冷冻干燥法制备丹皮酚前体脂质体,选择合适的冻干保护剂制备丹皮酚前体脂质体,并对水合后脂质体的形态、粒径、包封率和稳定性进行考察。结果显示,选择10%的蔗糖为保护剂时制得的丹皮酚前体脂质体经水合后主要为单室脂质体,粒径分布较均匀,平均粒径为149.7nm,药物包封率为73.9%,在25℃条件下可贮存6个月,外观、含量及包封率与采用单一方法制备的脂质体比较无明显变化。此外,用于脂质体制备的方法还有复乳法、熔融法等[11,12]。
2 结语
脂质体由于具有靶向、缓释、可控、减毒、提高药物稳定性以及保护包封药物等特点而越来越受到重视并得到广泛应用。脂质体的制备方法不仅影响脂质体的结构还影响脂质体粒径的大小及体内分布,因此脂质体制备方法的选择在制剂设计过程中是非常重要的。但脂质体目前的制备方法均存在各种各样的问题,如包封率和稳定性低等;靶向作用主要集中在肝、肾、脾等器官,对其他组织器官的靶向性则不明显;制备脂质体磷脂双分子层的材料较少,有时难以达到有效血药浓度;有些脂质体制备工艺较复杂,还存在灭菌、去除残留溶剂等问题。目前的脂质体均是以单体作为药物,对于中药而言,要制备出单体脂质体除存在上述问题外还有中药有效成分提取、分离、精制等方面的问题,而以中药有效部位或复方作为药效基础进行脂质体的研发难度则显得更大。
随着技术的革新和脂质体制备工艺研究的深入,脂质体制剂的制备方法将会更加完善、成熟、创新,对脂质体质量的评价方法会更加合理、可靠、科学,还会有更新型的脂质体出现,以有效部位或复方为药效物质基础的脂质体也将会越来越多。同时,还会开发出更多用于脂质体制备的磷脂双分子层材料,且该类材料与人体具有更好的生物相容性,使得脂质体的药效更好地发挥,脂质体的应用将会更加广泛。
摘要：脂质体是一种药物新剂型,其具有提高生物利用度、降低或减少药物不良反应、增加水溶性等特点,具有广阔的应用前景,尤其在抗癌药物方面具有独特的应用价值。综述脂质体制备方法的研究状况,为脂质体的进一步研发提供参考。
关键词：脂质体,制备方法,药物剂型
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中药脂质体的制备方法进展 第4篇
1 中药脂质体的制备材料
磷脂和胆固醇是制备中药脂质体也是形成双分子层的基础物质, 磷脂类包括天然的卵磷脂、脑磷脂、豆磷脂等以及合成磷脂, 如合成二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、合成磷脂酰丝氨酸等。胆固醇具有调节膜流动性的作用。
2 中药脂质体的制备方法
2.1 逆相蒸发法
将磷脂溶于有机溶剂, 加入含药物的缓冲液, 超声使成稳定w/o乳剂, 减压除去有机溶剂在旋转器壁上形成薄膜, 加入缓冲液使凝胶脱落, 制得水性混悬液, 通过凝胶色谱法或超速离心法, 除去未包封的药物, 即得大单室脂质体。姚亚红等采用此法制备了黄芩素脂质体, 所得脂质体平均粒径为179 nm左右, 符合肝靶向要求, 药物的体外释放符合Higuchi方程[1]。魏铭也采用逆相蒸发法制备了苦参碱脂质体, 包封率为50.08%[2]。
2.2 薄膜分散法
将类脂质与脂溶性药物溶于氯仿等有机溶剂中, 然后将氯仿溶液在烧瓶中旋转蒸发, 使在烧瓶内壁上形成薄膜, 加入含有水溶性药物的磷酸盐缓冲液, 不断振摇或搅拌即可生成脂质体。如采用此法制备的细辛脑脂质体, 包封率高达为54.1%[3]。
2.3 超声波分散法
在薄膜分散法基础上, 再经超声波处理, 制得均匀的单室脂质体:将水溶性药物溶于磷酸盐缓冲液中加人磷脂, 得到胆固醇与脂溶性药物共溶于有机溶剂的溶液, 搅拌蒸发除去有机溶剂, 残液以超声波处理, 然后分离出脂质体再混悬于磷酸盐缓冲液中, 制成脂质体的混悬型注射剂。如黄芩苷固体脂质体的制备[4]。
2.4 注入法
将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中 (一般多采用乙醚) , 然后将此药液经注射器缓缓注入加热至50℃ (并用磁力搅拌) 的磷酸盐缓冲液 (或含有水溶性药物) 中, 不断搅拌至有机溶剂除尽为止。这种方法制备的脂质体粒径较大, 不宜静脉注射。再经超声或通过高压乳匀机二次, 所得产品大多为单室脂质体, 少数为多室脂质体。靖会等采用乙醇注入法制备雷公藤甲素脂质体, 其脂质体颗粒圆整, 粒径相对均匀[5]。仵文英等用乙醚注入法制备了黄芩苷的脂质体[6]。
2.5 复乳法
将少量的水相与较多量的磷脂油相进行乳化形成W/O的反相胶团, 减压除去部分溶剂, 然后加入较大量的水相进行乳化, 形成W/O/W型复乳, 减压蒸发除去有机溶剂, 即得脂质体。毛世瑞等用此法制备了葛根素固体脂质纳米粒[7]。
2.6 冷冻干燥法
将磷脂与胆固醇分散于水中后, 加人支持剂混合均匀、冻干后支持剂呈蜂巢状, 脂质体膜分散附于蜂巢外部。当加人药物水溶液时, 脂质体膜因水浸泡, 缓慢弯曲最终成球状脂质体并包裹药物。该方法对遇热不稳定的药物尤为适宜。张晓云等采用卵磷脂-甘露醇保护剂摩尔比1:8, pH为7.2磷酸盐缓冲液为水合介质, 制得鬼臼毒素冻干脂质体, 包封率达到93.72%[8]。
2.6 熔融法
将磷脂表而活性剂加少量水相溶解, 胆固醇熔融后与之混合, 然后滴入65℃左右的水相溶液中保温制得。许汉林等精密称取卵磷脂和胆固醇分别置于烧杯中, 加少量PBS溶解卵磷脂, 倒入已经熔化的胆固醇中, 搅拌, 加入姜黄素溶液5 ml, 混匀后倒入水浴65℃40 ml的PBS溶液中, 水浴放置10 min即得姜黄素脂质体[9]。
2.7 冻融法
该法制备未包封药物的小单室脂质体, 在冻干前将待包封的药物加入, 在快速冷冻过程中, 由于冰的形成、使形成的脂质体膜破裂, 形成冰的片层与破裂的膜同时存在, 此状态不稳定, 在缓慢融化过程中暴露出脂质膜相融合重新形成脂质体; 储茂泉等用该法制备丹参酮脂质体[10]。
2.8 微射流法
微射流法是将粗分散体加高压 (压力范围通常在30～150 MPa) 形成超音速流, 并在孔径仅50um的十字形通孔中央发生高速冲击对撞, 产生强的撞击力、超声波作用以及高度湍流分散作用而导致颗粒瞬间超微破碎、乳化、分散。通常采用这种方法可获得粒度小、分布窄且分散稳定性高的微纳颗粒分散体系。如即莪术油脂质体的制备[11]。
2.9 硫酸铵梯度法、pH梯度法
黄义昆等采用硫酸铵梯度法制备了盐酸川芎嗪脂质体, 具体方法是取磷酸和胆固醇适量, 加入十八胺, 溶入3 ml氯仿中, 于茄形中旋转蒸发成均匀薄膜加入3%硫酸铵溶液超声使膜脱落, 再于45℃水浴孵化30 min, 将空白脂质体装于透析袋中用0.9%NaCl溶液透析, 透析后的脂质体中加入药液, 摇匀, 于37℃水浴锅中保温20 min, 即得[12]。郑庆忠等采用pH梯度法制备氧化苦参碱脂质体平均包封率为 (50.18士2.87) %, 平均粒径162 nm。[13]
2.10 表面活性剂增溶法
脂质薄膜、多层脂质体或单层脂质体与胆酸盐、脱氧胆酸盐等表面活性剂混合, 通过离心法或凝胶过滤法或透析法除去表面活性剂, 就可获得中等大小的单层脂质体。如茶多酚脂质体的制备[14]。
2.11 离心法
罗云等称取卵磷脂、胆固醇、硬脂胺、补骨脂素、VE分别溶于30 ml氯仿-甲醇溶液后, 置于茄形烧杯中, 加入玻璃珠若干粒, 于40℃水浴上旋转蒸发至形成薄膜 (A) , 取10 mlPBS加热至55℃, 倒入A中, 并浸入55℃水浴中搅拌30 min, 经Sephadex G 50分离去掉游离的补骨脂素, 40℃度离心得到补骨脂素脂质体[15]。
2.12 喷雾干燥法
储茂泉等先采用薄膜法将丹参酮制备成脂质体混悬液, 然后采用喷雾干燥法将其制备成前体脂质体。前体脂质体水合而重建的脂质体的粒度分布与喷雾干燥前的脂质体无明显差别, 脂质体中的丹参酮和大豆磷脂在喷雾干燥过程中均较稳定[16]。
2.13 其他方法
可采用多种方法、多种技术联用, 如白铭等采用薄膜法联用微射流法制备的辣椒素脂质体具有粒径小而均匀、稳定性好的特点[17]。张雅铭采用薄膜超声分散法并冷冻干燥制备了蕨麻索脂质体, 制备工艺简单可行, 脂质体包封率高、粒径均匀[18]。王琳等用乙醇注入式硫酸胺梯度法制备马钱子碱长循环脂质体, 其脂质体颗粒圆整、稳定性良好, 体外释放度优于马钱子碱磷酸盐缓冲液[19]。
脂质体制备方法还有表面活性剂处理法、钙融合法、振动干燥法、粉末床研磨法、法兰西挤压法等。但用于制备中药脂质体的报道甚少。目前中药脂质体制备的研究报道很多, 但其研究成果绝大多数还停留在实验室阶段, 中药的一些自身缺陷限制了其发展。如:中药成分复杂, 存在分离、提取、精制困难的问题;中药特别是复方脂质体由诸多成分协同发挥疗效, 在选择脂质体理想质量控制指标方面存在困难;中药脂质体载药量少, 有时难以达到有效血药浓度;中药脂质体稳定性差, 渗漏现象的解决还存在一定难度;某些脂质体制备工艺复杂, 大规模生产还需克服许多技术问题。随着科学技术的进一步发展, 新材料、新设备的涌现, 中药分离、提取技术的改进, 将会促进中药脂质体的深入研制。中药脂质体也有望在临床上得到充分的应用。
摘要：本文介绍了近5年来中药脂质体的制备方法。
盐酸伊立替康脂质体的制备 第5篇
盐酸伊立替康是经过化学修饰的天然喜树碱的衍生物[1],是一种疗效确切、毒副作用较小的抗癌新药,是晚期大肠癌的特效药,对于经含5-氟尿嘧啶化疗失败的患者,本品可作为二线药治疗。同时它对于经过小细胞和非小细胞非癌及宫颈癌和卵巢癌亦有疗效。
伊立替康是拓扑异构酶Ⅰ(Topo-Ⅰ)的特异性抑制剂[2],Topo-Ⅰ是在DNA复制和转录的过程中必不可少的核酶。CPT-11在大多数组织中经羟酸酯酶的作用产生活性代谢产物SN-38、SHI cpt-11对拓扑酶Ⅰ的抑制活性的100-1000倍[3]。CPT-11和SN-38的细胞毒效应是通过与DNA-Topo-Ⅰ复合体的稳定结合,引起DNA单键断裂,使DNA产生不可逆损伤最终导致细胞的死亡。伊立替康在体内和体外研究中均有广谱的、很强的抗肿瘤活性,重要的是伊立替康和它的代谢产物对表达多要耐药的肿瘤仍然有效。
研究表明[4],多种肿瘤细胞,特别是结肠癌、宫颈癌、卵巢癌等细胞内的Topo-Ⅰ含量大大高于正常组织,尤其在S期肿瘤细胞中含量打幅提高。由于伊立替康独特的作用机制,是的其拥有其对上述肿瘤细胞有着较高的选择性,从而降低对正常细胞的毒性。
脂质体(liposome)是人工制备的,脂质双分子定向排列而成的类似生物膜结构的封闭囊状结构。其制备简单,对于机体无毒、无免疫原性、体内生物降解、可以提高药物治疗指数、降低药物毒性、增加药物稳定性、减少药物剂量、延长药物作用时间及易实现靶向性等特点而备受重视。
脂质体药物开发中的难题之一就是使制备工艺可以满足大规模生产的需要和提高产品的存放稳定性。不同的载药方法、不同药物的不同物理化学特性等都会影响并决定着脂质体的制备工艺、药物包封率和稳定性。目前脂质体的制备方法一般可以细分为薄膜分散法、反向蒸发法、有机溶剂注入法等,而根据药物装载的机制不同,可以将制备脂质体的药物的方法分为被动载药和主动载药两大类。本文分别采用了薄膜分散法、乙醇注入法、反向蒸发法、硫酸铵梯度法制备了盐酸伊立替康脂质体,并对硫酸按梯度法进行了研究。
2 脂质体中药物含量及包封率测定方法的建立
2.1 盐酸伊立替康测定方法的确立:
HPLC测定条件
色谱柱:C18柱(5μm,250×4.6mm)
流动相:乙腈--pH4.0的0.1mol/L磷酸氢二钾缓冲液
流速:0.8mL/min,检测波长:254nm。
2.1.1 线性关系的考察
精密吸取100μg/mL盐酸伊立替康溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,稀释定容至10mL,制得一系列浓度的标准溶液,进行HPLC测定,进样量20μL。以浓度对峰面积值作图绘制标准曲线以浓度(C,μg/mL)对峰面积值(A)进行线性回归
得回归方程:A=213692C+4296.9 (r=0.9999)线性关系良好
2.1.2 重现性考察
配制2.0、6.0、10.0μg/mL (低、中、高)3个浓度的盐酸伊立替康标准溶液,HPLC测定,计算日内日间精密度,即重现性的考察。
RSD<2%,重现性良好
2.2 脂质体中药物含量的测定
精密吸取含药脂质体适量,加入少量10%曲拉通(Triton X-100)溶液破坏脂质体,使成澄清透明溶液,稀释定容至10 mL,进行HPLC测定,将测得的峰面积值代入标准曲线得到对应的浓度C,即为脂质体中药物浓度
2.3 辅料的干扰测定
精密吸取空白脂质体0.1mL,同上(药物含量测定)操作,结果显示在药物出峰时间7min左右无色谱峰出现,表明辅料对测定无干扰。
2.4 加样回收率实验
精密吸取100μg/mL药物溶液0.2、0.6、1.0 mL于10mL容量瓶中,分别加入0.1mL空白脂质体,同上操作。将测得的峰面积值代入标准曲线得到对应的浓度C determined,计算回收率。
2.5 脂质体中药物包封率的测定
2.5.1 空白柱回收率实验
密吸取低、中、高3个浓度的药物标准溶液,即0.5、1.0、2.0 mg/mL各0.5mL上SephadexG50柱,收集游离药物于100mL容量瓶中,HPLC测定。
2.5.2 加样柱回收率试验
精密吸取低、中、高3个浓度的药物标准溶液,即0.5、1.0、2.0mg/mL各0.mL以及空白脂质体0.5mL同时上凝胶柱,收集游离药物于100mL容量瓶中,HPLC测定。
2.6 小结讨论
试验条件有限,采用HPLC紫外检测的方法,利用其在254nm波长处有最大吸收,摸索得到比较合适的检测条件,以此测定脂质体中药物含量。
脂质体包封率的测定,采用SephadexG-50凝胶柱分离一紫外在线监测的方法,对脂质体和游离药物进行分离,由于CPT具有黄绿色荧光,因此在选定分离条件下可以明显地观察到脂质体带和游离药物带,然后分别接收测定两部分的药物含量,计算包封率。此法直观、方便、可信。
3 盐酸伊立替康脂质体的制备
3.1 脂质体的制备
3.1.1 薄膜分散法
SPC:Chol 3:1,加入适量氯仿再加入10mg/mL盐酸伊立替康的水溶液,55℃左右水化约2h,即得伊立替康脂质体。
3.1.2 乙醇注入法
SPC:Chol 3:1加入适量无水乙醇,再加入10mg/mL盐酸伊立替康的水溶液,55℃左右搅拌减压蒸发,即得伊立替康脂质体.
3.1.3 反相蒸发法
SPC:Chol 3:1加入,氯仿:乙醚(1:1),再加入10mg/mL盐酸伊立替康的水溶液,短时超声3min成乳减压蒸发除去有机溶剂成胶态,加水水化,继续旋转蒸发,形成脂质体。
3.1.4 硫酸铵梯度法
SPC:Chol 3:1,加入适量氯仿溶解后减压蒸发成膜,用硫酸铵溶液水化,制备空白脂质体,依次通过0.8、0.45、0.22和0.1μm的微孔滤膜,150mmol/LNaCl溶液透析,加入一定量的盐酸伊立替康水溶液,水浴孵化,得盐酸伊立替康脂质体.
采用不同的制备方法,最终得到的伊立替康脂质体包封率有较大差异。传统的被动包封方法如薄膜分散法、反相蒸发法、乙醇注入法制备的伊立替康脂质体包封率均较低,均低于50%;而采用主动载药方法—硫酸铵梯度法制备的伊立替康脂质体具有较高的包封率,在90%以上。
3.2 硫酸铵梯度法制备过程中不同工艺因素对包封率的影响
3.2.1 孵育温度的影响
3.2.2 孵育时间的影响
孵育时间对硫酸铵梯度法制备伊立替康脂质体的包封率略有影响,随着孵育时间的延长包封率有所增加,10min达到最高,然后有下降的趋势。
3.2.3 不同粒径空白脂质体的影响
空白脂质体的粒径大小对硫酸铵梯度法制备的伊立替康脂质体包封率有较大影响,随着脂质体粒径的减小包封率增加,当脂质体通过粒径为220、100nm的微孔滤膜后最终的药物包封率最高。
3.2.4 硫酸铵浓度的影响
内水相中硫酸铵的浓度对药物的包封有着重要的影响,随着硫酸铵浓度的增加伊立替康脂质体的包封率提高,当其浓度增加到200mmol/L时包封率可达到最高,然后趋于稳定。
4 关于盐酸伊立替康脂质体制备方法的讨论
4.1 脂质体制备方法的选择
①较高的包封率(>90%)和较大的药脂比。
②在包封的过程中将药物载入具有酸性环境的内水相中,能够保护其内酯形式不发生转变,从而保证其在体内的活性。
4.2 主动载药机制
4.3 孵育温度和时间的影响
孵育温度和时间对硫酸按梯度法制备盐酸伊立替康脂质体也有一定影响,随着温度的升高包封率略有增加,50～60℃时包封率接近100%且几乎保持不变。而随着孵育时间的延长包封率有所增加,10min达到最高,然后有下降的趋势。
4.4 脂质体粒径大小的影响
脂质体的大小对药物的包封率以及pH梯度的稳定情况有很大影响,采用挤出装置对脂质体进行整粒,随着粒径的减小包封率增加,在220及100 nm时包封率最高。
摘要：目的结合脂质体这种新型给药载体的特征将盐酸伊利替康(Irinotecan，OPT-11)制备成脂质体以解决喜树碱类药物在生理条件下其结果中的内酯环易发生水解反应转变为羟酸盐形式，从而失去活性这个难问题．方法以包封率为主要评价指标，比较了传统的脂质体制备方法(薄膜分散法、乙醇注入法、反向蒸发法等)与主动载药方法-硫酸铵梯度法对伊立替康脂质体制备的影响．结果采用硫酸铵梯度法制备伊立替康脂质体可以获得较高的包封率、较大的药酯比．结论硫酸铵溶液的浓度、孵育时间和温度空白脂质体的粒径大小等是影响伊立替康脂质体包封率的主要因素．
关键词：伊立替康,脂质体,主动载药,硫酸铵梯度法
参考文献
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[3]Tsao YP,Russo A,Nyamuswa G,et al.Interaction between replication forks and topoisomerase I -DNA cleavable complexes:studies in a cell-free SV 40 DNA replication system [J].Cancer Res,1993,53(24):5980-5914.
修饰性脂质体材料及其药学应用研究 第6篇
脂质体作为药物载体在体内具有一定的通透性和靶向性,可提高疗效、降低药物毒性、改变给药途径等特点[1]。虽然脂质体在药物制剂中已经取得很大发展,但仍然存在稳定性不高,靶向性差,体内循环时间不足和药效不持久等问题。脂质体表面具有吸附血液蛋白质,对脂质体在体内的滞留时间具有特殊的影响,这种吸附过程可以通过网状内皮系统的巨噬细胞间接识别出来并促进其从体内循环中清除[2]。
1 聚乙二醇及其衍生物修饰性脂质体
聚乙二醇(PEG)是无生物活性、水溶性、无毒的线性高分子。为稳定地和脂质体相连,需要引入脂溶性的并与磷脂有良好匹配性的化合物。目前多采取的方法为事先合成聚乙二醇的脂类衍生物,然后用聚乙二醇衍生物作为脂质体包材的组分之一,按照不同的脂质体载药方法制备聚乙二醇脂质体。
已经合成作为脂质体材料的有多种聚乙二醇衍生物,例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG),胆汁-聚乙二醇(Chol-PEG),甲氧基聚乙二醇胆汁(MePB)等。Li等[3]对表面携带正电荷的阳离子脂质体采用聚乙二醇对其修饰,发现聚乙二醇修饰后可以提高它的细胞摄取率,并且聚乙二醇还可以抵消脂质体的Zeta负电势,抵消Zeta负电势的幅度为每增加1%的聚乙二醇可以抵消4mV。Ducat[2]采用聚乙二醇修饰脂质体可以大量的降低血液对脂质体的清除率,从而提高脂质体在体内的滞留时间,其原因可能是降低了对血液蛋白的吸附和脂质体的聚集。
Chen等[4]用不同分子量(2000g/mol、4000g/mol、6000g/mol)的甲氧基聚乙二醇(MePEG)分别合成了甲氧基聚乙二醇胆汁(MePB)脂质体复合物(MeP2BL,MeP4BL,MeP6BL)。脂质体中的胆固醇插入双层膜中,聚乙二醇暴露在脂质体的表面形成一个亲水膜,提高了脂质体的亲水性。研究表明不同分子质量的聚乙二醇制备的脂质体没有显著的差异,意味着甲氧基聚乙二醇胆汁的链长并不是影响修饰脂质体物理化学特性的主要原因。药代实验表明:聚乙二醇2000修饰的脂质体比未修饰的脂质体在大鼠血浆中的平均滞留时间和半衰期明显提高,药时曲线也显示出具有较低的清除率,并在体内表现出缓释控释的特性。
陈国明等[5]则采用冷冻融解法结合微滤膜挤出法制备了聚乙二醇修饰的钙黄绿素脂质体。将油酰磷脂酰胆碱(POPG)和二棕榈酰磷脂酰胆碱乙醇胺聚乙二醇(DPPE-PEG)与胆固醇混合,制备钙黄绿素脂质体。钙黄绿素脂质体经过超声作用后,平均直径由150nm减小到102nm。
Yang等[6]通过PEG修饰阳离子脂质体对siRNA的转染效果的评价,结果表明:PEG修饰的脂质体可以提高脂质体在血浆中的稳定性,并随着PEG含量的升高脂质体的聚集越明显,含6%的PEG时聚集效果最明显。分析其原因是PEG修饰降低了脂质体和血浆的相互作用,增加了脂质体在体内的循环时间。通过体内siRNA的传递结果分析,PEG修饰的脂质体可被广泛的应用于掩盖阳离子,从而降低与体内携阴离子蛋白质作用引起的细胞毒性,并且减少聚沉和延长体内循环时间。
采用PEG及其衍生物对脂质体进行修饰,可以提高脂质体在体内的循环时间和血浆中的稳定性,降低清除率并具有一定的缓释控释作用。
2 泊洛沙姆修饰脂质体
泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物,是一类新型的高分子非离子表面活性剂。泊洛沙姆无生理活性、无溶血性、对皮肤无刺激性、毒性小,作为药用辅料可充当乳化剂、增溶剂、吸收促进剂、缓释材料等。作为修饰材料的主要有泊洛沙姆188。泊洛沙姆188表示共聚物中聚氧丙烯的近似分子质量为1800g/mol,聚氧丙烯的含量约为80%。
Tan等[7]采用吸附方法制备不同浓度的泊洛沙姆188(0%、2%、5%)对蜂毒素脂质体表面进行了修饰,研究了泊洛沙姆188对蜂毒素的抗癌活性和血管刺激性,体外测验了包封率、Zeta电势、颗粒大小和形态学特征等。研究表明蜂毒素脂质体的粒径随着泊洛沙姆含量的提高而显著提高,但包封率并没发生显著的改变。蜂毒素包封到脂质体内部后只能降低对血管的刺激性,而在该脂质体中加入泊洛沙姆进行修饰后则可完全消除对血管的刺激。蜂毒素脂质体加入泊洛沙姆188修饰后可显著增强蜂毒素的生物利用度,保持有效的抗癌活性并且减少副作用。
柯学等[8]则采用泊洛沙姆188对蜂毒素脂质体的修饰,考察了其在大鼠体内的药动学特征。从大鼠体内的血药浓度和药时曲线面积测定,获得了2%和5%的泊洛沙姆188修饰脂质体的药时曲线面积分别是游离蜂毒素的2.01倍和2.18倍,也表明了这种修饰性脂质体具有延长药物在大鼠体内驻留时间的特点,修饰性脂质体在大鼠体内的清除率也显著下降,提高了在体内的生物利用度;与游离的蜂毒素相比,静注2%和5%的泊洛沙姆188修饰性脂质体药物给药6h和8h后,血中浓度并未降低,药时曲线显著提高。
泊洛沙姆修饰的脂质体同样可用于基因的表达。Law等[9]采用鞘氨醇和二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)制备的脂质体用于体内外的基因转染实验,并将非离子表面活性剂泊洛沙姆188加入其中以稳定DNA/脂质体复合物。通过对添加或未添加泊洛沙姆188的脂质体复合物中基因表达的结果进行比对实验,体外表明在DNA/脂质体复合物中加入泊洛沙姆可提高基因转染进入某些细胞系的能力;体内表明加入泊洛沙姆188的DNA/脂质体在肺部、心脏、脾脏,肝脏和肾脏等主要器官中基因的表达显著增强,并且在肺部和脾脏中发现高水平延迟转染的基因。说明泊洛沙姆的修饰对脂质体的稳定性改善和基因的表达传递具有提高加强作用。
3 壳聚糖修饰脂质体
壳聚糖(TMC)是被生物体内的溶菌酶降解甲壳纲动物壳体而生成的天然物质,是一种改良的中性糖类聚合物。TMC具有很好的水溶性和黏膜粘着性,因此广泛用于药物的传递。Mohsen等[10]研究发现,壳聚糖的加入可提高脂质囊泡的稳定性,可使脂质体具有特效提升、延缓和控制释放的作用。Plessis等[11]采用壳聚糖修饰包裹脂质体对降血钙素在鼻腔和肠道中的吸收加强性能进行了实验。研究表明药物在鼻腔内的吸收加强主要归因于TMC上的2-位氨基基团呈阳性与细胞表面阴离子基团的相互作用。由于这种阳离子和阴离子基团的相互作用,使得壳聚糖修饰脂质体在口服和眼用药物中的研究应用较多。例如,Li[12]和Cao[13]等采用壳聚糖类修饰性脂质体作为口服药物和眼部药物的载体。
当然,除壳聚糖外,壳聚糖衍生物三甲基壳聚糖也常常作为修饰脂质体的主要材料[13,14]。三甲基壳聚糖是一种壳聚糖水溶性衍生物,是通过将壳聚糖的2-氨基烷基化得到部分季铵化的产物。一般季铵化程度分别为20%、40%和60%,分别标记为TMC20、TMC40、TMC60;由此所获得的修饰性脂质体平均粒径分别为1072nm±0.08nm、1222nm±0.16nm、704.3nm±0.18nm,Zeta电位分别为9.68mv、9.92mv、16.23mv;而未修饰的脂质体平均粒径为378.6nm±0.24nm,Zeta电位为-62.08 mv±2.5mv。可见修饰后的脂质体粒径增大了很多,且Zeta电势由负转变为正,这种表面电荷的转变拓展了其眼部制剂的给药。体外释药考察还表明,未修饰的脂质体与修饰的脂质体释药速率存在显著差异,但不同季铵化程度的修饰性壳聚糖包衣脂质体之间无显著差异。
葛亮等[15]用正己酰、月桂酰和棕榈酰分别对壳聚糖进行了酰基化获得了3种不同酰基化修饰性多西他赛脂质体,结果发现酰基化后的壳聚糖修饰的脂质体的体外稳定性显著增强。体外血浆释放试验表明酰基化壳聚糖修饰的脂质体多西他赛缓释效果更佳。一般来说血浆中非脂质体多西他赛注射液在4h内释放完全;普通多西他赛脂质体注射液3h后较快的释放,10h已经释放出了接近总量一半的药物,24h释放了超过70%的药物;而棕榈酰化壳聚糖修饰的多西他赛脂质体10h释放的药物不到总药量的25%,24h后释放了总药量的39%。上述结论说明酰基化壳聚糖提高了脂质体药物形成胶束能力,酰基的脂溶性长链利于插入到脂质体的磷脂双分子层中,使其在非酸性溶液中的溶解度增强、表面稳定性提高。
4 聚乙烯醇对脂质体的修饰
聚乙烯醇(PVA)是由聚醋酸乙烯酯经碱催化醇解而得的,作为药用辅料具有易溶于水、成膜性优良、粘接性强、热稳定性高、安全、无刺激性等优点[16]。近年来,PVA在医药工业中应用日趋广泛,如医药制剂中用作涂膜剂、膜剂、凝胶剂等剂型的辅助材料等,作为脂质体修饰材料同样备受关注。穆筱梅等[17]采用不同质量浓度的聚乙烯醇,1g/L、2g/L、3g/L、4g/L对脂质体进行修饰可形成表面膜,使其不易与其他粒子吸附和接触。与未修饰脂质体相比较,PVA修饰性脂质体具有稳定性好,包封率较高和泄漏率较小等优势。Shehata等[18]采用聚乙二醇和聚乙烯醇混合修饰脂质体,提高了脂质体在体内的滞留时间,研究发现经聚乙二醇和聚乙烯醇混合修饰脂质体比聚乙二醇单独修饰的脂质体获得了更大的药时曲线面积,分析原因可能是肝脏中的调理素降低和去调理素的增加,使修饰性脂质体对肝的亲和力下降,降低了肝脏对脂质体的清除率,从而延长了脂质体在体循环的滞留时间。
陈亭亭等[19]考察不同含量的聚乙烯醇对拓扑替康制备的多嚢室脂质体的修饰粒径和包封率,研究发现聚乙烯醇在0.5%、1%、3%、10%几个浓度中,在一定范围内,拓扑替康脂质体随着聚乙烯醇浓度的增加而包封率增加,其中PVA的含量为1%时包封率最高达到了45.86%±0.54%,而含量为10%时则不能制得多嚢室脂质体,其原因可能是高浓度PVA乳化作用和高粘度性,不利于脂质体的修饰。
5 聚乙烯对脂质体的修饰
聚乙烯(PV)具有优良的耐低温性能(最低使用温度可达-70~-100℃),化学稳定性好,常温下不溶于一般溶剂,吸水性小等优点,但聚乙烯对于环境应力(化学与机械作用)敏感,耐热老化性差。
戈延茹等[20]研究了聚乙烯100硬脂基醚修饰长循环钆喷酸葡胺脂质体对肿瘤细胞摄取情况。他们在前期制备钆喷酸葡胺脂质体的基础上,用聚乙烯100硬脂基醚进行了修饰,获得了长循环脂质体。与普通脂质体平均粒径824.0nm相比,修饰性脂质体的平均粒径为362.7nm;修饰性脂质体不仅可以使脂质体避免巨噬细胞的吞噬,延长体内循环时间,而且脂质体进入肿瘤细胞的能力并没有减弱,反而有所增加。
6 其他
Li等[21]采用赖氨酸、组氨酸和精氨酸与胆固醇发生酯化反应,并分别制备阳离子脂质体/DNA复合物(lipoplex)作为非病毒基因的修饰载体。研究表明,血清环境下,赖氨酸脂质体/DNA复合物和精氨酸脂质体/DNA复合物是普通脂质体转染效率的10~20倍。主要因他们的氨基结构和亲水区域赋予脂质稳定性和良好的细胞摄取率,因此这2种氨基酸衍生物制备的阳离子脂质体作为非病毒载体具有非常好的前景。
同样,Heinze等[22]为提高非病毒基因载体转染效率低的问题,构建新型阳离子两亲物质作为载体。这种脂质主体结构由丙二酸二酰胺两条疏水链组成,采用不同的烷基链对疏水长链和主体结构的阳离子极性基团进行改造。体外实验表明,当脂质体/DNA复合物的疏水链上含有不饱和烃基,同时以赖氨酸作为亲水端时,非病毒载体的转染效率有很大的提高。采用这种方式修饰后的阳离子脂质体较市场上其他类型脂质体具有更高的转染率。
在脂质体的制备中,聚赖氨酸作为脂质体修饰材料,可以提高脂质体在体内的保留时间和靶组织的亲和性。Martin等[23]研究聚多巴胺/脂质体包被实验表明,由于聚赖氨酸对聚多巴胺脂质体的修饰提高了该脂质体对细胞的粘附性。
7 展望
聚乙二醇修饰脂质体可以降低脂质体同体内蛋白的作用,减少细胞上蛋白对脂质体的影响;泊洛沙姆对脂质体修饰,可以降低药物对机体的刺激和毒副作用,并且提高脂质体的生物利用度;壳聚糖修饰脂质体由于其表面阳离子性可提高脂质体在体内的聚集和与靶组织的相互作用时间,显著提高药物的体外释放,但壳聚糖衍生物之间差异并不显著。虽然对脂质体的研究活动越来越多,脂质体在临床的应用却不广泛,主要因包封率低,药物容易泄露等问题。随着新型修饰性材料的发现和脂质体研究的深入,这些缺陷将逐步得到改善。将来的发展方向涉及的磁性材料,热敏材料,肠溶性材料,胃溶型材料等对脂质体的修饰,一定能充分发挥脂质体的靶向性功能,以满足临床的最终需要。
摘要：脂质体作为药物载体具有良好的使用价值,针对现有脂质体存在的问题,采用对其相关辅料进行修饰,以改善脂质体稳定性、包封率、靶向作用、体内循环和生物利用度等,是提高脂质体治疗作用的重点研究方向之一。目前广泛应用的是对聚乙二醇、泊洛沙姆、壳聚糖和聚乙烯等高分子物质的修饰,以期改善脂质体的药学特性。对近年来的修饰性脂质体材料进行了归纳和总结,并提出展望。
中药脂质体靶向给药的研究进展 第7篇
关键词：脂质体,中药,靶向给药,研究进展
自发现脂质体双分子层结构以来, 脂质体给药系统在降低药物毒性、增加药物在靶点聚集和提高药物疗效等方面起了重要作用。我国的中药是纯天然制品并能治疗很多疑难杂症, 目前, 中药受到全世界的广泛关注。中药脂质体是指将中药包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂。中药脂质体研究起步虽然较晚, 但有其自身优势如增强药效、靶向释药等特点, 其靶向性研究备受重视。
1 脂质体靶向释药的作用机理
脂质体 (liposome) 是一种人工膜, 在水中磷脂分子亲水头部插入水中, 疏水尾部伸向空气, 搅动后形成双层脂分子的球形脂质体, 直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因或制备的药物, 利用脂质体可以和细胞膜融合的特点, 将药物送入细胞内部。脂质体理化性质和结构类似细胞膜, 又称为人工生物膜。
中药脂质体进入体内后主要被网状内皮系统吞噬, 从而通过受体等激活机体的自身免疫功能并改变被包封药物的体内分布, 使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄, 从而提高药物的生物利用度, 减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性, 减轻不良反应, 并能靶向性释药等。脂质体药物和靶细胞之间是通过内吞、融合、接触释放、吸附、脂质交换等方式起作用的。
2 中药的肝脏靶向给药
2.1 肝脏的被动靶向给药
被动靶向是指载药微粒被巨噬细胞尤其是肝Kupffer细胞摄取, 因此是通过正常生理过程运送至肝、脾等器官。脂质体具有可生物降解和免疫原性小等优点, 可通过细胞内吞和融合作用, 直接将药物送入细胞内, 避免使用高浓度游离药物。未经修饰的脂质体主要分布在网状内皮系统发达的组织或脏器, 能将药物靶向到肝脏, 即脂质体有被动靶向于肝脏的作用。因此, 如果将对心脏和肾脏有毒性的药物可明显降低药物的毒性。孙锋等用反相蒸发法制备马蔺子素脂质体, 其包封率在98%以上, 粒径分布在100 nm左右。体外释放实验方程比较符合Higuchi模型。袁琼英等制备了甘草甜素脂质体, 比较健康志愿者口服甘草甜素脂质体和甘草甜素药片后的药动学, 发现甘草甜素脂质体较甘草甜素片可促进甘草甜素转变为甘草次酸以及甘草次酸的吸收。
2.2 肝脏的主动靶向给药
未加修饰的脂质体通过被动靶向过程, 只能达到系统水平的靶向, 没有达到器官或细胞水平的精确靶向。预达到器官或细胞水平的精确靶向需在脂质体上耦连某种识别分子, 即所谓的配体, 目前已有将几种不同类型的配体连接到脂质体的表面, 形成不同类型的配体改进的脂质体。这些配体有:糖、抗原、抗体、蛋白质、肽类等。姜华等以半乳糖为起始物, 采用逆相蒸发法制备乳糖衍牛物修饰的去甲斑蝥酸钠脂质体 (CNL) 和去甲斑蝥酸钠脂质体 (GNL) 。实验测得脂质体表面经化合物Gall31- (CH2-CH2-O) 2-C14-Hz9修饰后。GNL肝脏靶向效率是CNI的1.8倍, 是去甲斑蝥酸钠注射液的2.9倍。吴超等用薄膜分散法制备甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥脂质体后, 经小鼠尾静脉给药, 采用HPLC法检测去甲斑蝥素在小鼠肝肾中的浓度随时间的变化, 与去甲斑蝥素水溶液组进行比较。结果GalGAOStNC-LP组在肝脏中组织浓度明显高于NC-SOL组, 肝的靶向指数大于l, 而肾的靶向指数小于1。说明甘草次酸衍生物修饰去甲斑蝥脂质体具有肝靶向性, 能提高药物疗效, 降低毒副作用。
3 心血管的靶向给药
心脑血管疾病是危害人类生命健康最严重最普遍的疾病之一, 由于缺乏组织特异性和病变部位的靶向性, 药物用量大, 有些还会引起毒副作用。因此, 靶向性药物载体特异性将药物导人心血管病变部位, 是国内外心血管药物研究的一个重大课题。邓英杰教授领导的课题组自19世纪80年代就开始对脂质体给药载体系统进行了大量的研究。目前他们已经研制出热敏长循环脂质体、热敏磁性脂质体、主动靶向缺血心肌的脂质体给药系统、水溶性药物油溶液口服给药系统、脂质体热敏感凝胶制剂。针对大部分心血管治疗药物, 他们设计制备了心肌靶向脂质体。张灵芝用具有脑组织趋向性的甘露糖, 血小板膜纤维蛋白原受体配基RGDS肽和β受体配基烯丙洛尔参入脂质体膜中, 制备成靶向脂质体, 结果发现甘露糖脂质体携载的CGRP比单纯注射的CGRP在脑脊液和脑组织中的含量明显增加 (P<0.05或0.01) 。王新春等制备的板蓝根磷脂脂质体, 观察板蓝根磷脂脂质体对内毒素血症小鼠巨噬细胞膜脂各组成成分的影响。实验证明板蓝根磷脂脂质体具有极其显著的保护细胞膜脂各组成成分的作用。
4 肺部的靶向给药
肺靶向脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层中形成的微型囊泡。此类脂质体属于长循环脂质体, 影响脂质体靶向的主要因素是微粒的粒径大小与表面性质。研究证实粒径在7～30μm的脂质体静注后在肺部蓄积, 表面性质主要是微粒表面所带电荷及表面亲和力。罗霄的课题组应用现代制剂技术通过脂质体载药的方式制备出了具有较好肺部定位释药的灯盏花素脂质体, 以安全、无毒副作用的注射用大豆磷脂 (SPC) 为载体材料, 采用薄膜蒸发-探头超声法和冷冻干燥法制备灯盏花素脂质体。通过对灯盏花素脂质体的制备工艺、质量评价、小鼠体内的药代动力学及靶向性研究, 达到了肺靶向的作用。
5 结肠的靶向给药
结肠靶向给药治疗具有很多优点: (1) 有些药物容易被胃酸破坏或者被胰酶代谢而失去治疗作用, 而药物在结肠就不受这些影响, 制成结肠靶向给药系统可以增加其生物利用度; (2) 蛋白多肽类药物往往在上消化道中被酶降解, 口服给药困难很大, 而大肠中蛋白水解酶含量很低, 药物如运送到大肠部释放, 可以解决酶屏障问题; (3) 在夜间发作的哮喘、心绞痛、关节炎等疾病的治疗中, 药物在结肠缓慢释放, 将发挥长效作用; (4) 治疗结肠疾病如溃疡性结肠炎、出血性结肠炎、Crohn症, 药物在病变区直接释放将更有效; (5) 治疗结肠直肠癌的靶向给药系统, 可以提高局部药物浓度, 从而提高疗效, 还可以减少化疗药物对胃肠道的刺激; (6) 杀肠虫药和结肠诊断试剂的结肠靶向释放可以减少剂量和副作用。方瑾等采用新型偶联剂SATA, 将抗人体大肠癌的单克隆抗体与紫杉醇脂质体偶联制成免疫脂质体。检测结果显示, 脂质体稳定性良好制成免疫脂质体后, 单抗免疫活性不丧失。体外细胞毒实验结果显示, 紫杉醇免疫脂质体对细胞生长的抑制作用有明显的靶向专一性, 对人大肠癌细胞的体外细胞毒作用优于普通脂质体和游离药物, IC50分别为两者的6.70和88.7倍, 对非靶细胞的作用与普通脂质体相似。
6 其它靶向给药
吴燕等采用薄膜分散法制备羟基喜树碱脂质体, 用正交试验优化了处方, 并用氯化壳聚糖包被脂质体以增加其靶向性。药物平均粒径为90.9 nm, 平均包封率为68%以上。
脂质体虽然具有其他剂型不可比拟的种种优点, 但也表现一系列的不足: (1) 由于一般构成脂质体膜的主要成分为天然磷脂, 其分子中均含有不饱和的脂肪酸链, 卵磷脂的水解氧化可使膜流动性降低, 促进药物渗漏, 产生毒性。 (2) 用常规方法制得的脂质体易于聚集和融合, 有效期较短。中药脂质体除上述脂质体自身缺陷外, 还有以下不足: (1) 中药成分复杂, 存在有效成分提取、分离、精制的困难; (2) 中药, 特别是复方脂质体由“诸多成分协同作用而发挥疗效”, 在选择脂质体理想质量控制指标方面尚存在较大困难; (3) 中药脂质体载药量较小, 有时难以达到有效血药浓度; (4) 中药脂质体稳定性较差, 有待进一步解决; (5) 中药脂质体渗漏现象的解决存在一定的技术困难; (6) 某些脂质体制备工艺复杂, 要想从实验走向大规模生产还有相当一段距离要走。
总之, 随着科学技术的进一步发展, 高分子材料的不断涌现, 中药提取、分离纯化技术的改进, 新型脂质体研究进一步深入, 可以预见中药脂质体必将得到深入的研究和快速的发展。
参考文献
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