黄酮提取方法范文（精选12篇）

黄酮提取方法 第1篇

一、乙醇提取法

醇提取异黄酮, 是一种传统的提取大豆异黄酮方法, 工艺简单, 可操作性较强, 但也存在问题, 如实验步骤繁琐、产率较低等。因此, 现在有好多关于醇提法的优化研究, 主要两个方面改进:一方面提取异黄酮的产率;另一方面要求蛋白质的提取量低。如:郭睿等以大豆为原料, 乙醇为溶剂, 通过单因素实验和正交试验得到了最佳提取条件, 大豆粉过40目筛, 提取温度80℃, 搅拌速300r/min, 乙醇体积分数为70%, 料液比为1:20, 提取次数为2, 时间为2h。在上述提取条件下从大豆中所得粗异黄酮质量分数为0。4%, 异黄酮的提取率可达92%。朱仕房等用正交实验筛选了大豆异黄酮的提取方法, 以染料木黄酮、黄豆苷元和大豆黄素混合对照为指标, 用HPLC法进行测定。结果发现最佳条件为:80%的乙醇, 不小于18:1的物料比 (溶剂:原料) , 时间1h, 温度不超过50℃。

二、水解法提取

大豆异黄酮绝大部分是以苷的形式存在的, 研究表明异黄酮苷元形式比其糖苷形式有更高的生物活性, 水解法是将大豆异黄酮苷水解为其苷元后再用溶剂萃取, 这种方法经济、安全、有利于大豆异黄酮的分离, 纯化等。李明元等以大豆为原料, 采用先酸水解、后碱水解的方法提取大豆异黄酮苷元, 对碱水解工艺进行了研究:最佳工艺条件为碱解温度50℃, 碱解时间1h, 碱解p H值9.0, 在此条件下大豆异黄酮苷元的提取率可达73.51%。

三、超声提取

超声提取是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出、提取;另外, 超声波法与常规提取法相比, 超声波提取速度快、时间短、收率高, 并防止了高温对提取成分的影响。孙艳等通过实验比较了醇提取法、碱提取法和超声波振荡的提取效果, 实验证明:采用超声波振荡、5%Na OH溶液经甲醇回流法提取总黄酮效果最佳。孙体健等以发酵豆粕为原料, 采用超声波提取技术, 通过单因素实验及正交实验对大豆异黄酮提取工艺探讨。结果表明:采用80%乙醇为提取剂, 料液比1 g 15 ml, 时间20 min, 提取2次, 大豆异黄酮提取率最高, 可达到0。548%。

四、微波提取

微波提取是由于微波产生的电磁场加速了被提取成分向提取溶剂界面扩散的速度;且由于吸收了微波使得被提取物细胞内部温度迅速上升, 细胞内外形成压力差导致细胞壁破裂, 从而使细胞内成分在较低温度下便可进入提取溶剂并溶解。微波提取条件具有短时、快速、高效、节能等特性。适合热敏性物料的提取工艺。付荣霞等研究微波与乙醇梯度提取大豆芽中大豆异黄酮的工艺, 比较微波提取与水浴提取的效果。通过正交设计方法探讨了微波与乙醇梯度提取大豆异黄酮的最佳工艺为:乙醇梯度95%:70%:40%, 微波功560W, 提取时间24min。。

五、超临界流体萃取

超临界流体萃取, 同传统的溶剂相比, 它具有显著的产品回收率和纯度, 改进了产品质量、降低能耗。如超临界CO2萃取, 可快速分离出所要提取物的有效组分, 此法具备无有机溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。潘利华等以脱脂豆豉为原料, 通过正交试验对超临界流体萃取大豆异黄酮的工艺进行了优化研究, 其提取率与醇提工艺相比, 提取率高56。8%, 最佳工艺为:乙醇为夹带剂, 萃取时间1h, 萃取温度为50℃萃取压30MPa, 夹带剂用量2。0mg/L。

六、酶法提取

酶法提取是通过选用适当的酶使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质降解, 破坏细胞壁的致密构造, 减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力, 从而有利于有效成分的溶出。另一方面, 通过酶类的选择性的特点, 可以有效地使目标物溶出, 提高其溶出效率, 为后续的提取液的精制创造有利条酶法提取法具有操作简便, 对设备要求不高;反应条件温和, 能保持天然产物的构象, 有利于保持有效成分的原有药效;缩短了提取时间, 提高了有效成分的提取率, 提高了产品的药用价值。陈庆庆等在常规的醇提工艺前用纤维素酶或木聚糖酶预处理, 能明显提高大豆异黄酮的提取得率。纤维素酶的最适用量为15FPIU/g豆粕, 处理24h后, 总异黄酮含量和未经酶处理的相比, 可增加1.9倍。

总之, 在我国大豆的资源丰富, 并且由于大豆异黄酮在医药、美容、食品等领域应用前景。但是, 目前, 一些有关大豆异黄酮的提取仍停留在实验室阶段, 很难在大生产上推广。所以, 找到一种高效、简便、适用于工业化生产的方法更值得思考。

摘要：陕西国际商贸学院医药分院张爽摘要:本文通过查阅相关资料综述了大豆异黄酮的提取方法, 介绍了六种提取方法。并阐述了各种方法在提取过程中的优势。

关键词：大豆异黄酮,提取

参考文献

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[3]朱仕房等:《大豆异黄酮提取条件的研究》, 《食品科学》, 2001, 22 (3) :54。

[4]李明元等:《水解法提取大豆异黄酮苷元工艺研究》, 《西华大学学报》, 2008, 4, 119-122。

[5]孙艳等:《大豆异黄酮的提取与检验方法的研究》《职业与健康》, 2006, 222:4。

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[9]武夏明等:《黄酮类中药成分提取分离技术的应用》, 《齐鲁药事》, 2008, 7, 27。

黄酮提取方法 第2篇

分离纯化

黄酮苷类的分离方法主要用各种柱层析法。

①聚酰胺柱层析法：聚酰胺对各种黄酮苷类有较好的分离效果，其层析容量较大，适合于制备性分离，洗脱剂常用水甲醇，也有用水乙醇和甲醇氯仿。

②硅胶柱层析法：此法的应用范围最广，不仅可以分离黄酮苷，也可以分离各种黄酮苷元。

③葡聚糖凝胶柱层析：它主要靠分子筛作用分离黄酮苷类，在洗脱时，一般按分子量的大小顺序洗出柱体。李氏等[3]从夏至草乙醇提取物的乙酸乙酯部位中，利用Sephadex柱色谱从中分离出2个黄酮类化合物。杨氏等[4]利用Sephadex LH20柱色谱对分蘖葱头进行分离纯化，分得4个黄酮苷类化合物，其中一个为新的黄酮类化合物。

研究结果表明，AB8树脂较宜于葛根黄酮的提纯，经AB8树脂吸附分离后，提取物中黄酮含量提高近1倍。⑤HPLC法：应用HPLC法分离黄酮苷类化合物的报道较多。邬氏等[8]对18种黄酮及黄酮苷类化合物在C8、C18和CN 3种固定相上的`梯度洗脱、RPHPLC法分离做了研究，结果表明，C18柱基本可以对植物黄酮苷元和配基实现分离，但对极性大的苷部分洗脱出慢峰，总洗脱时间增长和分离效果不太理想，而C8填料极性介于C18和CN二者之间，因而对黄酮苷类的分离比较理想，峰形和分离度也最好。

沙棘叶总黄酮的提取工艺优化 第3篇

【关键词】沙棘叶；总黄酮；提取工艺；正交试验

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0014-03

沙棘（Hippophe rhamnoids L.）属胡颓子科沙棘属植物，又名醋柳，被国际医药学家和营养学家誉为人类21世纪最具发展前途的医药及营养保健植物。其根、茎、叶、果实等都含有维生素、黄酮类化合物和丰富的矿物质元素等，为药食同源植物，并广泛应用于食品、医药、化妆品等多个领域[1]。沙棘1977年收载于《中华人民共和国药典》，所含的黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、降血糖、保护心血管等多种生物活性[2-3]。内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。而沙棘果实黄酮的开发已经报道很多[4-5]，从叶中提取黄酮类化合物也具有原料来源广泛、成本低廉的优势[6]。研究从沙棘叶提取黄酮，旨在筛选适合沙棘叶黄酮的提取工艺，获取高含量的总黄酮，促进沙棘资源的综合利用。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；DZKW-S-8电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）；RE-52旋转真空蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；101-2型数显电热鼓风恒温干燥箱（上海阳光实验儀器有限公司）。

1.2 材料 沙棘叶采于内蒙古乌兰察布市（集宁区）卓资县郊野，经杨鸿飞教授鉴定沙棘（Hippophe rhamnoids L.）的叶。并将其充分粉碎，过35目筛，置于干燥器中备用。芦丁对照品（批号：100080-201407，中国药品生物制品检定所）。其他试剂均为分析纯。

2 方法及结果

2.1 沙棘叶总黄酮含量的测定

2.1.1 标准曲线的制作 准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品20mg，用70%的乙醇溶解并定容至100ml，使其浓度为200μg/ml。分别取10、15、20、25、30、35、40、45ml，用70%的乙醇定容50ml，即为40、60、80、100、120、140、160、180μg/ml的芦丁溶液。各取1ml于试管中，加70%的乙醇1ml，加入0.5ml 5%的NaNO2，混匀后放置6min；然后加入0.5ml 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后放置6min；最后再加入6ml 4%NaOH，放置15min，在510nm处测定不同浓度标准品的吸光值（亚硝酸钠-硝酸铝比色法）。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。得回归方程：Y=477.38X-2.261（R=0.9979），结果表明芦丁在0～120μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。

2.1.2 样品中黄酮含量的测定 取一定量的沙棘叶黄酮样品，配制成样液。再取一定量总黄酮样液，定容至某一体积。各取1ml于试管中，采用“2.1.1”项比色法测定吸光值，计算总黄酮含量。

X=Y×V×n×100%/m。

式中，X为样品中总黄酮含量，Y为样液中总黄酮浓度（mg/mL），由回归方程可算得；V为样液体积（mL）；n为稀释倍数；m为样品量（mg）[7]。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择 取8份过35目筛的6月份沙棘叶粉碎物各1g，分别加入甲醇、乙醇、水、氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇10ml，在70℃水浴加热提取10min，过滤。用70%乙醇统一定容到50ml，各取1ml于试管中，采用2.1.1项比色法测定吸光值，计算提取率。同样方法做3次平行试验，确定提取的最佳溶剂，结果见图1。

由图1可知，沙棘总黄酮在甲醇、乙醇、水等极性溶剂中溶解度大，提取率高；在氯仿、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂中溶解度小，提取率低。在所测溶剂中，甲醇最好，但甲醇有毒，给操作带来不便。由于乙醇具有、无异味、无残留、安全性好等优点，且容易回收，故选用乙醇为提取溶剂。

2.2.2 提取原材料的选择 取5份过35目筛的5～9月份沙棘的叶粉碎样品各10g，加入50%乙醇150ml，在70℃水浴加热提取30min，过滤，蒸发乙醇，用50%乙醇定容到100ml，稀释取5ml定容到50ml的容量瓶中，取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，选择最佳提取原材料。

黄酮化合物是植物生理过程中的次生代谢产物，这些物质的往往受到植物发育阶段酶的调节和遗传机制的控制。不同发育阶段黄酮化合物含量不同。由图2可知，5月份日照时间长，植物正处在生长的旺盛阶段，故5月份黄酮含量高；随后植物生长变缓，合成量减少或转化为其他物质，故含量下降。但西北地区5月份叶子处于发芽阶段，产量低，不宜选用。7月叶子已经长成，也未结果，又出现了黄酮含量的高峰，不宜用7月份叶作为实验原材料。

2.2.3 多因素正交试验 在单因素筛选的基础上，设计多因素试验表，见表1。取7月份叶粉碎样品1g，按照下列正交试验条件进行提取、过滤，用70%乙醇统一定容至30ml。各取1ml于试管中，测定吸光值，计算总黄酮含量，确定优化后的提取条件。

多因素正交试验结果见表1，直观分析得出：叶中提取总黄酮的影响因素的顺序是：C>B>A>D，即提取温度>固液比>乙醇浓度>提取时间，优化组合后的提取因素的选择为A2B2C3D1。方差分析的结果见表2，影响提取沙棘总黄酮各因素均为极显著因子（P<0.01）。综合考虑最佳的提取条件为A2B2C3D1，即取7月份叶，用60%的乙醇作溶剂，固液比为1∶20，在80℃提取30min，提取效果较好。

2.3 沙棘总黄酮的得率和含量测定 准确称量沙棘7月份叶粉碎物100g，按上述确定的优化提取条件进行浸提，将浸提液在60℃减压浓缩回收乙醇，将浓缩液在60℃的干燥箱干燥，称量干燥粗制品的质量，得到粗黄酮产品得率。从中取1g用70%的乙醇溶液溶解，稀释一定倍数，取1ml测定粗制品总黄酮含量，结果见表3。

由表4可知，100g叶粉碎样品经此提取条件提取，可得到8.71g粗黄酮产品，叶粗制品黄酮含量达0.14%，并且RSD为0.68%，纯化后总黄酮含量达到14.89%，表明该工艺重复性强，稳定可靠，精密度高。

3 讨论

内蒙古沙棘资源具有分布广、种植面积大、果实质量高等特点，对沙棘产业的发展十分有利[8]。且沙棘作为防护林发挥着巨大作用，种植面积也逐年增加。有研究发现沙棘所含总黄酮为叶子（876mg/100g）>果渣（502mg/100g）>鲜果汁（365mg/100g）>鲜浆果（354mg/100g），说明从叶中提取黄酮具有重要意义[9]。对于从沙棘中提取总黄酮的方法，目前有超临界CO2流体提取、微波法提取、超声波法提取、有机溶剂提取、水浸提取等。超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离；微波法和超声波法提取仅限于少量提取实验，工业化大生产不宜应用。水浸提取沙棘总黄酮提取率偏低；有机溶剂提取中甲醇和丙酮含有毒成分，因此用乙醇提取沙棘黄酮是适合工业化生产的适宜方法[10]。该方法经实验优化，60%乙醇作为提取溶剂，提取30min，既节约时间，且乙醇还可以重复利用，无毒害无残留，适合工业化扩大生产。经优化工艺提取后所得叶黄酮得率为8.71%，相对较高，但黄酮含量（0.14%）较吕敏[11]采用正交试验法优选提取山西沙棘Hippophe rhamnoids L.叶总黄酮含量（4.82%）较低，这可能与不同品种的沙棘黄酮含量不同有关。王亚辉等[12]对内蒙古不同产区同一品种沙棘黄酮含量研究发现：内蒙古和林格尔县（2.5±0.07）%>内蒙古凉城县（2.3±0.02）%>内蒙古东胜区（2.2±0.08）%>内蒙古翁牛特旗（1.8±0.01）%>内蒙古敖汉旗（1.7±0.09）%>内蒙古集宁区（1.4±0.01）%。除集宁外，5个产区的总黄酮含量均达到《中国药典》标准（1.5%）。实验选用沙棘品种恰好来自集宁区卓资山县，提取原材料并非5月份含量最高季节采收，而是产量较高的7月份采收，原料只提取1次，而吕敏实验提取三次，所以该实验黄酮含量相对较低。与其他研究结果比较[13-15]，产品得率较高，并且该提取工艺操作简单、乙醇无残留可重复利用，适合于沙棘总黄酮的提取，可进行规模化生产。

参考文献

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紫苏中总黄酮提取方法研究进展 第4篇

紫苏, 又名白苏、红苏、赤苏等, 是一种药食同源性植物, 其根、茎、叶均可入药。紫苏梗中主要含有多种化学成分, 如黄酮化合物、花色素苷、α- 亚麻酸、胡萝卜素、紫苏醛、迷迭香酸等[1]。研究表明, 紫苏中总黄酮化合物不仅具有抗氧化作用, 能够有效地清除氧自由基, 延缓人体细胞的衰老;而且具有较强的抗炎作用和抗过敏作用[2,3]。因此, 加强对紫苏中总黄酮化合物的研究不仅有利于资源的综合利用, 而且有利于人类健康的发展。目前, 紫苏中总黄酮化合物的提取方法多样, 但不同的方法有着不同的提取效率和对环境不同的影响, 因此, 良好的提取方法不仅有助于生产效率的提高, 而且有利于环境保护。本研究着重对紫苏中总黄酮提取方法进行综述。

2 研究综述

2.1 碱性水溶液浸提法

紫苏黄酮显酸性, 易溶于碱性溶液中。目前用的最多的碱性溶液就是氢氧化钠溶液和石灰乳。氢氧化钠溶液作为提取剂, 对黄酮的溶解度高, 但提取出的黄酮所含杂质很多, 不利于进一步的纯化。而石灰乳对于黄酮的浸出能力没有氢氧化钠溶液好, 但是可以去除杂质, 提高黄酮纯度, 同时, 也会使黄酮与钙盐结合生成的不溶物质被当成杂质去除[4]。李秀信等[5]采用碱性水溶液提取法, 利用石灰乳为黄酮浸取剂提取黄酮化合物, 对黄酮的提取率达20.07%。

2.2 乙醇浸提法

乙醇浸提取法以乙醇为提取剂实现紫苏中黄酮提取的方法。该方法对紫苏中黄酮的提取率受乙醇浓度和萃取次数影响较大。如叶芙蓉[6]采用55 %乙醇提取法提取紫苏黄酮, 对黄酮进行单次提取, 提取率为5.12%。而李秀信等[7]采用80%乙醇溶液提取紫苏黄酮, 对黄酮进行3 次萃取, 对黄酮的萃取率达至15.50%。因此, 使用较高纯度的乙醇浸取液, 进行多次萃取浸提是提高该法提取效率的重要方法。

2.3 丙酮法

丙酮提取法以丙酮为提取剂实现紫苏中黄酮提取的方法。该方法对黄酮的萃取效果较好, 同时, 萃取黄酮的品质较高。如李秀信等[7]分别对比了60%丙酮提取法, 80%乙醇提取法和水提取法对紫苏中黄酮的提取效果, 研究发现三者对紫苏黄酮的提取率分别达22.30%、22.30 % 和19.6%, 但是60% 丙酮提取法提取出的黄酮的抗氧化性最强, 品质最好, 而80%乙醇提取的黄酮相对较弱, 水提取法提取的黄酮最弱。

2.4 微波法

微波提取法是利用物质因结构不同而吸收微波能力的不同的特性, 选择性加热提取体系中某些组分, 从而使该组分从体系中分离出来的方法[8]。与传统提取方法相比, 其具有对提取物选择性高、提取率高、溶剂用量少, 环保性高等优点。

张蕾蕾等[9]采用了微波提取法测定提取紫苏中黄酮的含量, 其采用单因素及响应面优化试验, 研究发现, 在紫苏粒径20目、提取时间70min、温度71℃、乙醇体积分数61%、料液比1∶20 (g/mL) 时, 黄酮提取率高达59.28mg/g。

2.5 超声波法

超声波法是利用超声波在液体中的空化作用和搅拌作用破坏植物细胞壁, 提取溶剂分子渗透到细胞中溶解有效成分的方法[10~12]。该法具有设备简单, 操作灵活性强, 有利于原料的充分利用;提取溶剂用量少, 节约溶剂;整个过程中无化学反应发生, 对提取成分的生理活性无影响, 有效成分含量高, 环保性高。超声波法的高效应用依赖于工艺因素条件的优化, 刘毅君等[13]采用超声波提取法测定紫苏叶中总黄酮的含量, 研究发现在浸提液为30%的乙醇、料液比1∶40、超声波 (80Hz、200W) 处理70min、80℃水浴温度下提取2次, 得到的紫苏叶粗提液总黄酮含量最高, 提取率为21.81mg/g。胡晓丹等[14]采用超声波提取法提取紫苏叶中总黄酮, 经条件优化发现, 70%乙醇为提取剂时, 料液比1∶20 (g/mL) , 提取温度60 ℃, 超声功率150 W, 提取次数2次 (每次40 min) 时, 紫苏叶黄酮的提取率最高, 为2.93%, 粗提物中黄酮含量为15.46%。

3 结语

微波法提取芦荟中黄酮类化合物 第5篇

微波法提取芦荟中黄酮类化合物

采用微波法对芦荟中黄酮类化合物进行提取.将单因素分析与正交试验相结合,得到微波法提取芦荟中黄酮类化合物的最佳工艺条件:提取剂乙醇体积分数为80%;微波功率为560 W;提取时间为30 s;料液比(g/mL)为1:5.0.每克鲜芦荟中提取黄酮类化合物为0.52 mg,回收率为93.3%.微波法与乙醇回流法相比,提取时间由4 h减少到30 s,提取黄酮类化合物的量提高了1.6倍.与超声提取法相比,提取时间由30 min减少到30 s,提取黄酮类化合物的量提高了0.15倍.

作 者：闫蕊 尚庆坤 戴欣 YAN Rui SHANG Qing-kun DAI Xin 作者单位：东北师范大学化学学院,吉林长春,130024刊 名：东北师大学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：40(1)分类号：O657关键词：芦荟 微波法 黄酮

食用玫瑰生物类黄酮的提取工艺研究 第6篇

【关键词】 食用玫瑰 黄酮 提取

前言

玫瑰,学名Rosa rugosa,别名红玫瑰、梅槐、刺玫瑰，蔷薇科，蔷薇属，落叶直立灌木。食用玫瑰中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物作为一种功能成分，具有增强心血管功能、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老等作用。在国外， 近年来对黄酮类化合物的研究开发十分活跃， 但在国内保健食品生产中开发较多的只有银杏黄酮、山楂黄酮、茶叶黄酮等[1]。

本论文以食用玫瑰为研究对象，对食用玫瑰中生物类黄酮的提取工艺进行初步的研究和评价，希望我们的研究能为进一开发天然高效食品抗氧化剂、食品添加剂、研制功能性食品及开发医药材料提供理论指导。

1. 实验材料、主要药品、仪器及实验方法

1.1实验材料

玫瑰花:本研究所采用的实验材料为新鲜的食用玫瑰花

1.2实验主要仪器设备

索氏抽提器，电子分析天平，紫外可见分光光度计，旋转蒸发仪，高速离心机，真空泵，恒温循环水箱，电热干燥箱，恒温搅拌循环水浴锅，PHS-2S酸度计，酒精度计等。

1.3实验主要试剂

芦丁、没食子酸、棚皮素标样；乙醚、乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、冰乙酸柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钙、三氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝（以上均为分析纯）；

1.4食用玫瑰黄酮的测定方法

采用比色法[2]， AlCl3与黄酮类物质作用后，生成黄酮得到黄色铝络合物。

1.5食用玫瑰花黄酮提取工艺的研究[3]

1.5.1黄酮提取单因素实验[4]

（1）提取方法筛选试验

①乙醇索氏抽提法

准确称取5.00克玫瑰粉，用滤纸包好放入索氏抽提器中，加入100mL95%乙醇90℃抽提1h，定容，测定黄酮萃取率。

②丙酮浸提法

准确称取5.00克玫瑰粉，用100mL80%丙酮80℃回流浸提1h，抽滤，用80%丙酮洗涤滤渣至洗涤液无色，定容，测定黄酮萃取率。

③热水提取法

准确称取5.00克样品，加入100mL蒸馏水，90℃浸提1h，定容，测定黄酮萃取率。

④碱溶酸沉法

准确称取5.00克样品，加入100mL蒸馏水，煮沸，在搅拌条件下缓慢加入石灰乳调节pH值为9.0，在此条件下，微沸60min，趁热滤布过滤，用90℃蒸馏水洗涤滤渣至洗涤液无色，合并滤液与洗涤液，在60～70℃下用HCl溶液调节pH值至5.0，搅匀，静置24h，抽滤，用蒸馏水洗涤沉淀物至中性，真空浓缩干燥得粗提物，用60%乙醇配制成样品液，定容，测定黄酮萃取率。

（2）乙醇浓度对黄酮浸出率的影响试验

准确称取5.00克食用玫瑰，用l00mLpH8.15的不同浓度乙醇溶液，在80℃温度下回流浸提2h，抽滤，定容，测定不同浓度乙醇的黄酮浸出率。

（3）浸提温度对黄酮浸出率的影响试验

准确称取5.00克食用玫瑰，用l00mLpH8.15的50%乙醇溶液，在不同温度下回流浸提2h，抽滤，定容，测定不同浸提温度的多测定黄酮浸出率。

（4）浸提时间对黄酮浸出率的影响试验

准确称取5.00克食用玫瑰叶，用l00mLpH8.15的50%乙醇溶液，在80℃温度下回流浸提不同时间，抽滤，定容，测定不同浸提时间的测定黄酮浸出率。

（5）料液比(m/V)对黄酮浸出率的影响

准确称取5.00克食用玫瑰，分别用不同体积的pH8.15的50%乙醇溶液，在80℃温度下回流浸提2h，抽滤，定容，测定不同料液比的测定黄酮浸出率。

（6）浸提溶剂pH值对黄酮浸出率的影响实验

准确称取5.00克食用玫瑰，用100mL不同pH值的50%乙醇溶液，在80℃温度下回流浸提2h，抽滤，定容，测定不同溶剂pH值的测定黄酮浸出率。

（7）正交实验

对影响黄酮浸出率的乙醇浓度、浸提温度、浸提时间、料液比(m/V)、浸提溶剂pH值进行正交试验，试验的因素水平如表所示，以黄酮浸出率为指标，优化浸提工艺条件。

表 正交实验因素水平表

2. 结果分析

2.1食用玫瑰花总黄酮检测方法的建立

在碱性溶液中，黄酮类化合物与衬Al3+生成红色络合物，用芦丁试验结果表明在420nm波长处有最大吸收峰。同时分析得到标准曲线的回归方程，为Y=0.0007x+0.0362,r=0.9998，表明在100～800цg/mL浓度范围内，浓度与吸光度有良好的线形关系。

2.2食用玫瑰花黄酮类化合物提取工艺的研究

2.2.1几种常用的提取方法比较

不同提取方法对食用玫瑰黄酮的萃取率如表1所示。回流浸提法还可通过调节乙醇浓度，增加食用玫瑰黄酮的的溶解性，提高提取效率，因此，选择乙醇浸提工艺。

2.2.2乙醇浓度对黄酮浸出率的影响

不同乙醇浓度对食用玫瑰黄酮浸提效果表明，当乙醇浓度小于40%时，浸出物中黄酮的浓度随乙醇浓度的增加而迅速提高。高于此浓度后则增长平缓。当浓度达到80%时，黄酮提取率基本不变。因此，宜采用70%左右的醇溶液进行浸提。

2.2.3温度对黄酮浸出率的影响

不同浸提温度的黄酮浸出率表明，不同浸提温度的黄酮与多酚浸出率差异极显著。40～80℃时，随着温度的升高黄酮与多酚浸出率逐渐增大，这是因为升高温度有利于食用玫瑰黄酮溶解度增大[5]。宜在60～80℃之间进行浸提。

2.2.4浸提时间对黄酮浸出率的影响

不同浸提时间的黄酮浸出率如图。不同浸提时间的黄酮浸出率差异极显著。浸提时间在60～150min之间时，延长时间可以增加玫瑰黄酮浸出量，提高黄酮浸出率。当时间超过150min时，玫瑰中的黄酮向溶液扩散速度与溶液中黄酮向玫瑰扩散的速度达到平衡，高溫长时间的蒸煮使黄酮部分损失，黄酮浸出率降低。

2.2.5 料液比(m/V)对黄酮浸出率的影响

不同料液比的黄酮浸出率如图4所示。方差分析表明，不同料液比之何差异极显著。料液比小于1：20，增大黄酮浸出率。当溶剂用量增大到一定限度时，而减少玫瑰黄酮浸出，因此，料液比1:30的黄酮浸出率比料液比为1：20的黄酮浸出率低。

2.2.6 溶剂的PH值对黄酮浸出率的影响

黄酮提取方法 第7篇

黄酮类化合物又称黄酮体、黄碱素, 在生理学、医学和营养学上具有一定的应用价值, 具有抗氧化、抗炎、抗变态反应和提高机体免疫力等功能。黄酮类化合物在饲料工业中的应用也越来越广泛, 如用作抗氧化剂、促生长剂、甜味剂和天然色素等。

1 材料与方法

1.1 材料

双光束紫外可见分光光度计 (型号TU-1901) , 北京普析通用仪器有限责任公司;数控超声清洗机 (型号KQ-250DB) , 昆山市超声仪器有限公司;索氏提取器 (型号X01) , 杭州旷维实验室设备有限公司;旋转蒸发仪 (型号RE52-4) , 上海沪西分析仪器厂;层析柱 (型号1998A) , 上海同兴化工仪器有限公司。

瑞香狼毒, 采自内蒙古乌兰察布市四子王旗, 将采集到的瑞香狼毒置阴凉处干燥, 取其根用粉碎机粉碎, 过100目筛, 备用;聚酰胺树脂, 上海斯凰生物科技有限公司;芦丁标准品 (批号0076-9605) , 中国药品生物制品检定所;其余试剂均为分析纯。

1.2 提取方法

1.2.1 冷浸配合超声波提取法

称取一定量的瑞香狼毒根干粉, 加入一定量的95%乙醇, 浸泡3 d后超声波提取30 min;抽滤, 在滤渣中再加入一定量的95%乙醇, 浸泡3 d后超声波提取30 min;如此反复3次, 合并3次滤液, 通过旋转蒸发仪减压回收乙醇;放入4 ℃冰箱静置2 d, 除去底部残渣;调节乙醇浓度至75%, 用石油醚萃取2次, 弃去石油醚, 挥干溶剂, 研磨成粉, 备用。

(1) 聚酰胺吸附法。

将冷浸配合超声波提取法所得的提取物与硅藻土拌样, 装入层析柱中用正丁醇流洗;在滤纸上用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物显色, 在紫外灯下观察有无黄绿色荧光, 提取至流洗液无黄酮反应时结束;正丁醇通过旋转蒸发仪浓缩并挥干溶剂, 用少量95%乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱;依次用水、95%乙醇洗脱, 收集95%乙醇洗脱液, 洗脱至无黄酮反应时结束;浓缩95%乙醇洗脱液, 挥干溶剂, 研磨成粉。

(2) 碱提酸析法。

此沉淀反应是可逆的, 可使有效成分与其他杂质分离。在冷浸配合超声波提取法所得的提取物中加入pH值为10的稀氢氧化钠溶液使之形成盐, 溶解盐并除去滤渣;再加入pH值为2~3的稀盐酸溶液使之酸化, 游离析出沉淀, 自然干燥。

(3) 溶剂萃取法。

将冷浸配合超声波提取法所得的提取物溶于水, 充分混合, 微热20 min, 过滤, 滤渣挥干。

1.2.2 连续加热回流提取法

称取一定量的瑞香狼毒根干粉, 装入滤纸袋并放到提取器中;加入95%乙醇, 连接装置, 水浴加热回流提取2 h;滤渣再用95%乙醇提取, 反复3次, 合并3次乙醇提取液;通过旋转蒸发仪减压回收乙醇, 调节乙醇浓度至75%;用石油醚萃取2次, 弃去石油醚, 挥干溶剂, 研磨成粉, 备用。

(1) 聚酰胺吸附法。

对经连续加热回流提取法所得的提取物进一步分离, 方法同1.2.1中的 (1) 。

(2) 碱提酸析法。

对经连续加热回流提取法所得的提取物进一步分离, 方法同1.2.1中的 (2) 。

(3) 溶剂萃取法。

对经连续加热回流提取法所得的提取物进一步分离, 方法同1.2.1中的 (3) 。

1.3 黄酮类化合物的定性检测

1.3.1 三氯化铝反应

取8支试管, 分别加入少许经上述各提取方法所得的样品, 用95%乙醇完全溶解, 每只试管中再加1%三氯化铝乙醇溶液1~2 mL, 观察颜色变化情况。

1.3.2 盐酸-镁粉还原反应

将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有95%乙醇的试管中, 待完全溶解后加少许镁粉, 再加数滴浓盐酸, 观察颜色变化情况。

1.3.3 四氢硼钠反应

取8支试管, 分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品, 用95%乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠, 观察颜色变化情况。

1.4 总黄酮含量的测定

1.4.1 标准曲线的绘制

准确称取于120 ℃干燥至恒重的无水芦丁 (作黄酮标准对照) 9.5 mg, 用60%乙醇定容于50 mL容量瓶中, 摇匀, 得到浓度为0.19 mg/mL的标准品溶液, 作为贮备液;准确量取贮备液0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 mL于25 mL容量瓶中, 分别加5%亚硝酸钠和10%硝酸铝溶液0.3 mL, 放置6 min;加1 mol/mL氢氧化钠溶液4.0 mL, 分别用30%乙醇稀释至刻度, 混匀, 放置16 min;用紫外可见分光光度计在510 nm处测定吸光度;以吸光度为纵坐标、溶液浓度为横坐标绘制标准曲线, 根据标准曲线求出总黄酮浓度-吸光度回归方程, 得出总黄酮浓度的计算公式。

1.4.2 样品中总黄酮含量的测定

将经上述方法所得的提取物分别用适量的30%乙醇溶解, 过滤, 移至250 mL容量瓶中;再用30%乙醇稀释至刻度, 摇匀, 即为样品提取液;精密吸取此溶液5 mL, 置25 mL容量瓶中;加30%乙醇稀释至刻度, 得待测样品液;准确吸取各待测样品液5 mL, 其余操作同1.4.1。测定吸光度并用公式计算总黄酮的含量, 重复测3次取平均值。

1.4.3 回收率的测定

准确称取经冷浸配合超声波提取法所得的样品5份, 每份0.05 g;分别加入一定量的芦丁标准品, 按1.4.1和1.4.2中的方法操作。用紫外分光光度法测定吸光度, 得出总黄酮含量, 根据回收率公式计算出回收率。回收率= (混合后测得的总黄酮含量-样品中总黄酮含量) / 芦丁标准品加入量100%。

1.4.4 精密度试验

精密称取经冷浸配合超声波提取法所得的样品5份, 按1.4.1和1.4.2中的方法测定总黄酮含量。

1.4.5 稳定性试验

将经冷浸配合超声波提取法所得的提取物按1.4.1和1.4.2中的方法每隔10 min测定1次, 连续测定1 h。

2 结果与分析

2.1 黄酮类化合物定性检测的结果

在三氯化铝反应中, 原来的黄色加深, 并有黄色或黄绿色荧光, 原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色;在盐酸-镁粉还原反应中, 溶液呈现出橙黄色或紫红色, 这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物;在四氢硼钠反应中, 溶液由浅黄色变为红色或紫红色, 此反应是二氢黄酮类化合物的专属反应。

2.2 标准曲线 (见图

1) 及回归方程

以总黄酮浓度 (C) 为横坐标、吸光度 (A) 为纵坐标进行回归, 得标准曲线回归方程:A=0.012 66C+0.000 9, R2= 0.999 8。根据方程得出总黄酮浓度的计算公式:C= (A-0.000 9) /0.012 66, 由标准曲线可知芦丁标准品吸光度与浓度之间具有较好的线性关系。

2.3 样品中总黄酮含量的测定结果 (见表1)

2.4 样品回收率的测定结果 (见表2)

2.5 精密度试验和稳定性试验结果

用紫外分光光度法测定5份样品中总黄酮含量分别为12.78%、12.54%、12.64%、12.47%、12.66%, 结果相对标准偏差较小。这说明结果重现性好, 精密度较高, 所得数据精确。稳定性试验测定结果为 (12.64±0.05) % , 相对标准偏差为0.56%, 表明样品溶液在1 h内较稳定。

3 讨论

试验首先采用冷浸配合超声波提取法和连续加热回流提取法对瑞香狼毒有效成分进行粗提。通过反复试验比较可以看出用冷浸配合超声波提取法所得提取物中总黄酮含量略高于用连续加热回流提取法所得提取物中总黄酮含量。用超声波提取植物中有效成分, 尤其是黄酮类物质, 是目前比较新的方法, 它的原理是超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出, 超声波使提取液不断震荡, 有助于溶质的扩散, 同时超声波的热效应使水温基本维持在57 ℃, 对原料有水浴作用。因此, 超声波法大大缩短了提取时间, 提高了有效成分的提取率及原料的利用率。试验把冷浸法同超声波提取法结合在一起对瑞香狼毒有效成分进行了粗提, 取得了很好效果。之后又运用了3种方法分别对上述2种粗提物进一步提取, 结果溶剂萃取法优于其他两种方法, 它不仅提高了提取率, 而且又经济、省时。另外, 采用水溶液萃取后无新杂质掺入。

试验对经冷浸配合超声波提取法所得的样品进行了回收率试验、精密度试验和稳定性试验, 结果分光光度法准确度较高, 偏差较小, 试验条件容易控制, 简单方便, 是测定中草药提取物中总黄酮含量的一种容易操作、切实可行的方法。

摘要：为了比较不同提取方法对瑞香狼毒有效成分总黄酮含量的影响, 试验先采用冷浸配合超声波提取法和连续加热回流提取法进行粗提, 再将所得粗提物分别运用聚酰胺吸附法、碱提酸析法、溶剂萃取法进一步分离, 并通过芦丁标准曲线计算所得提取物中总黄酮的含量。结果表明:总黄酮含量粗提物分别为12.64%和11.62%, 聚酰胺吸附法分别为22.28%和20.36%、碱提酸析法分别为23.39%和21.25%、溶剂萃取法分别为24.78%和22.20%;利用冷浸配合超声波提取后再用溶剂萃取法处理, 不仅有效成分的提取率高, 原料的利用率也明显高于其他方法, 而且成本较低, 适合大量提取。

关键词：瑞香狼毒,总黄酮,提取方法

参考文献

龙眼壳总黄酮提取工艺研究 第8篇

他中药成分,但是,目前对龙眼壳中总黄酮的提取研究鲜见报道[3,4]。本研究用正交设计方法从龙眼壳中提取出总黄酮,并测定了含量, 以图为龙眼壳的开发利用提供基础数据。

1 实验部分

1.1 原料

新鲜干龙眼(广东高州)。

1.2 主要仪器与试剂

UV1800PC型紫外分光光度计、数显恒温水箱、电子天平、加热电炉等。

95%乙醇、芦丁、亚硝酸钠(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、硝酸铝(分析纯)。

1.3 定量原理

A1(NO3 )3 比色法: 以A1(NO3 )3 为显色剂,在

碱性条件下,利用其与黄酮形成红色螯合物的特征,以芦丁为对照品,在510 nm处测定其吸收度,从而得到待测物质的黄酮含量。

1.4 标准曲线的制定

1.4.1 对照品试液的配制

称量105℃下烘干至恒重的芦丁对照品100.4 mg,用适量30% 乙醇加热溶解,放冷,转移至100 mL容量瓶中,用30% 乙醇定容至刻度。再从中取10 mL溶液,置100 mL容量瓶,用30% 乙醇定容至刻度摇匀,做为对照品储备试液。此试液中芦丁浓度为0.1004 mg/mL。

1.4.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品试液0.0,0.5,1.0,2.0,3.0 ,4.0,5.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加5%亚硝酸钠溶液0.5 mL,使混匀,放置6 min。加10%硝酸铝溶液0.5 mL,摇匀,放置6 min。加5%氢氧化钠溶液4 mL,用30%乙醇定容至刻度,摇匀,静置。15 min后测试510 nm下的吸光度值,以不含芦丁的空白溶液为参比。

1.5 龙眼壳中总黄酮提取工艺流程

龙眼壳除杂水洗烘干粉碎称重乙醇回流提取过滤。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

相应的吸光度值为0.000、0.054、0.105、0.217、0.322、0.428、0.531。应用最小二乘法将芦丁标准液浓度与吸光度值做一元线性回归分析,由Microsoft Excel获得回归曲线:

Y=1.0599X + 0.0013,R2=0.9999

2.2 影响黄酮得率的单因素考虑

2.2.1 提取剂浓度的确定

每次称取0.5 g龙眼壳粉末,在50℃ ,料液比m(壳) ∶V(乙醇)=1 ∶40,浸提1 h,浸提1次的条件下,依次以体积分数为30%～95%乙醇进行浸提,过滤。用30%乙醇稀释一定倍数后,取1 mL按1.4.2.显色,在510 nm下测得的吸光度与乙醇浓度的关系见图1。从图1可以看出,在乙醇浓度为50%～70% 内对应吸光度值有个小平台。这种现象反映出龙眼壳中所含的生物黄酮类化合物具有黄酮苷元和糖苷两种形式,随着乙醇浓度的降低,前者的溶出量相对减少,后者则相对增加,中等浓度的乙醇溶液对两者的溶出率较适当。因此选择乙醇浓度范围50%～70%。

2.2.2 提取温度的确定

分别称取0.5 g龙眼壳粉末加入20 mL60% 乙醇溶液,在40～80℃范围内每隔10℃为一个测试点,提取1 h。冷却后过滤,用30%乙醇稀释相同倍数后量取1 mL测吸光度。从图中可以看到,在低于70℃的范围内随着温度的逐渐升高黄酮得率随之升高,说明较高的温度对黄酮类化合物的溶出是有利的。当超过70℃后,黄酮得率降低,这可能是黄酮在高温下不稳定所致[5]。实验表明,适宜的提取温度为大于40℃小于80℃之间

2.2.3 提取时间的确定

分别称取0.5 g龙眼壳粉末加入20 mL60% 乙醇溶液,在70℃ 下反应1～4 h,以每0.5 h为1个测试点。冷却后过滤,用30%乙醇稀释相同倍数后测得吸光度(图3)。从图中可以看出,提取2.5 h的黄酮得率最大。由于黄酮类化合物在高温不稳定,提取时间太长,会造成有效成分的损失[5],致使2.5 h 后得率有所降低。

2.2.4 提取时料液比的确定

称取1 g龙眼壳粉末,分别加入10,15,20,25,30,35, 40 mL60% 乙醇溶液,在70℃下反应2 h,过滤,滤液用30%乙醇溶液定容至50 mL。用30%乙醇稀释一定倍数后测定吸光度值,料液比与吸光度值的关系见图4。从图4可以看出,随着料液比的不断加大,生物类黄酮化合物的溶出率也显著加大。当固液比在35倍后,黄酮化合物的溶出率增长缓慢。

2.3 正交设计

根据溶剂浓度、料液比、温度、提取时问4个单因素试验所确定的水平范围,选定乙醇浓度,料液比,提取温度,提取时间作为考察的4个因素,各取3个水平(见表1),以龙眼壳总黄酮得率为指标,选用L9(34)正交表进行实验(见表2)。

准确称取1.000 g左右龙眼壳粉末若干份,按表2在不同条件下处理后,过滤,用30%乙醇定容至30 mL。再从中取1 mL用30%乙醇定容至10 mL,得样品液。取2 mL样品液按1.4.2显色检测,得表2的实验结果。

注:得率(%)=(吸光度-0.0013)/1.059910/21030/1000100

由表2的直观分析可以看出: 4种因素对龙眼壳黄色素提取效果的影响程度依次为B>A>D>C,即乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间,其中料液比对龙眼壳黄色素提取的效果影响最显著,提取时间对龙眼壳黄色素提取效果影响最小; 最佳提取工艺为A3B2C2D3,即提取剂为60%的乙醇、提取温度为80℃、提取时间为2.5 h、料液比为1 ∶35。

按最佳提取工艺平行实验3次,结果如表3所示,实验结果比表2中的其他组合都高。说明这种组合在工艺上是简单可行的。

3 讨论

1)以60%的乙醇溶剂作为提取剂,料液比为1 ∶35,提取时间为2.5 h,温度为80°C是龙眼壳总黄酮提取的最佳工艺,其得率为3.66%,且得到的最佳工艺条件通过验证实验证明是稳定可行的。

2)黄酮类化合物是一大类天然产物,广泛存在于植物界,是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇,其它包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等[6]。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,能进入脂肪组织,进而体现出如下功能:消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞的功能[7,8]。

3)本实验结果表明,龙眼壳中含有较为丰富的黄酮类化合物,有广泛的开发前景和利用价值。

参考文献

[1]蔡长河.龙眼肉的食疗价值及其开发利用前景[J].食品科学,2002,23(8):328-330.

[2]叶自行,许建楷,等.龙眼高产技术问答[M].广州:广东科技出版社,2001.

[3]黄锁义,刘海花,等.超声波提取龙眼壳总黄酮及鉴别[J].时珍国医国药,2007,18(2):461-462.

[4]黄锁义,唐玉莲,黎海妮,等.龙眼壳总黄酮提取及鉴别.中药材,2006,29(8).

[5]唐传核.植物生物活性物质[M].北京:化学工业出版社.2005.

[6]姚新生.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社2001:168-171.

[7]曹纬国,刘志勤,邵云,等.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].西北植物学报,2003,23(12):2241.

荷叶黄酮提取工艺的研究 第9篇

目前荷叶黄酮的提取方法主要有浸提法、微波提取法和超声波法等, 本文以乙醇为提取剂, 采用正交试验的方法从荷叶中提取荷叶黄酮, 系统研究了在不同的提取温度、时间和料液比等条件下的提取效果, 并确定了最佳的提取工艺。

1 试验材料与方法

1.1 材料

(1) 试验材料:荷叶采于孝感市星河镇。

(2) 主要仪器:SHZ-Ⅲ型循环水真空泵、HH-524双列四孔水浴锅、RE-52AA旋转蒸发器, 上海亚荣仪器厂;UV-240分光光度计, 日本岛津。

(3) 主要试剂:乙醇、无水氯化铝和卢丁均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 荷叶的预处理

将新鲜荷叶洗净、沥干, 于50℃烘箱中烘干后, 粉粹并过40目筛, 放置于冰箱中备用。

1.2.2 提取溶剂的确定

黄酮类物质的提取通常采用极性溶剂提取和水提取2种方法, 由于乙醇溶液容易渗入至原料的内部, 提取效果要优于水提取法;另外, 乙醇价格低廉, 食用安全性高, 可回收再次利用。所以, 本研究选用乙醇作为荷叶黄酮的提取溶剂。

1.2.3 标准曲线的制作

准确称取烘干至恒重的芦丁标准品0.01875g, 置于100mL容量瓶中, 用70%的乙醇溶解并定容至100mL, 得质量浓度为0.1875mg/mL的芦丁标准液。分别吸取上述芦丁标准液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0mL于25mL比色管中, 加入70%乙醇稀释至10mL, 滴加1mol/L AlCl3溶液3.0mL, 摇匀, 用70%乙醇稀释至刻度, 室温放置20min后, 于415nm处测其吸光度, 以试剂空白为参比液。以吸光度A为纵坐标, 芦丁标准液浓度C为横坐标, 绘制准曲线如图1所示。

1.2.4 荷叶黄酮的提取及测定

准确称取一定量干荷叶粉, 转移至500mL的平底烧瓶中, 按一定的料液比加入一定浓度的乙醇, 在设定温度下浸提一段时间, 减压抽滤, 合并提取液后离心, 取一定量的上清液, 用试剂空白做参比液, 用制作标准曲线同样的方法, 测定其黄酮类物质的含量, 计算提取率。

式中:Y为根据标准曲线方程计算出的荷叶中黄酮类物质的质量浓度, mg/mL;V为原浸提液体积, mL;W为提取用荷叶粉的质量, g;N为稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对提取效果的影响

准确称取6份荷叶粉, 每份5g, 分别放入6只500mL的平底烧瓶中;再分别向其中加入不同浓度的乙醇150mL, 在50℃下保温提取2h, 冷却后减压抽滤、离心, 分别取1mL提取液, 置于100mL容量瓶中, 用对应浓度的乙醇定容至100mL, 然后按照1.2.3方法进行黄酮类物质的测定。

由表1可知:当乙醇浓度大于40%以后, 提取液的吸光度处于上升趋势。乙醇浓度达到70%时, 提取液的吸光度最高, 提取效果最好。乙醇浓度大于70%后, 提取液的吸光度开始下降, 说明提取效果变差。这可能是因为荷叶黄酮为多种物质的混合物, 包括各种苷元和黄酮苷, 由于其性质和化学结构不同, 在不同浓度的乙醇中有着不同的溶解度。本试验选取60%、70%和80%作为正交试验的3个水平。

2.2 温度对提取效果的影响

准确称取5份荷叶粉, 每份5g, 分别放入5只500mL的平底烧瓶中;再分别向其中加入70%的乙醇150mL, 在不同温度下保温提取2h, 冷却后减压抽滤、离心, 分别取1mL提取液, 置于100mL容量瓶中, 用70%的乙醇定容至100mL, 然后按照1.2.3方法进行黄酮类物质的测定。

由表2可知:当温度达到50℃时, 提取液的吸光度最高, 提取效果最好;温度超50℃时, 提取液的吸光度呈下降趋势, 说明高温不利于荷叶黄酮的提取, 同时, 温度太高, 黄酮类物质会氧化, 杂质溶出也较多, 影响其稳定性和提取效果, 综合考虑, 本试验选取50、60和70℃作为正交试验的3个水平。

2.3 料液比对黄酮提取效果的影响

准确称取5份荷叶粉, 每份5g, 分别放入5只500mL的平底烧瓶中;再分别以不同的料液比向其中加入70%的乙醇, 在50℃浸提温度下, 分别对样品提取2h, 冷却后减压抽滤、离心, 分别取1mL上清液, 置于50mL容量瓶中, 用70%的乙醇定容至50mL, 然后按照1.2.3方法进行黄酮类物质的测定。

由图2可知:当料液比为1∶40时, 提取率达到最大;考虑到溶剂量太少, 不利于操作, 增大溶剂量也给工业生产造成浪费。因此, 本试验选取1∶20、1∶30和140作为正交试验的平个水平。

2.4 浸提时间对荷叶黄酮提取效果的影响

准确称取5份荷叶粉, 每份5g, 分别放入5只500mL的平底烧瓶中;再分别向其中加入70%的乙醇150mL, 在浸提温度50℃的条件下, 保温提取不同时间, 冷却后减压抽滤、离心, 分别取1mL提取液, 置于100mL容量瓶中, 用70%的乙醇定容至100mL, 然后按照1.2.3方法进行黄酮类物质的测定。

由表3可知:当提取时间小于2h时, 随着浸提时间的延长, 吸光度不断增大, 提取2h后, 吸光度开始下降;说明在一定的时间范围内, 黄酮类物质的提取率不断上升, 超过2h后, 有效物质的溶出量减少, 提取率逐渐下降。因此本试验选取1.5、2.0和2.5h作为正交试验的3个水平。

2.5 正交试验确定最佳工艺参数

上述试验对不同提取工艺参数进行了初步筛选, 为进一步得到荷叶黄酮的最佳工艺条件, 参照上述试验结果, 以影响黄酮类物质提取率的乙醇浓度、料液比、温度和提取时间为4个影响因素, 设计[L9 (34) ]的正交试验。正交试验结果见表4, 方差分析见表5。

由表4可知:RA>RC>RB>RD, 即温度对提取率的影响最大, 其次是时间和料液比, 最后是乙醇浓度, 与表5结果相一致。比较优的提取条件是A1B3C1D1, 即浸提温度50℃、料也比1∶40、时间1.5h和乙醇浓度为60%, 依此条件做追加试验, 得到荷叶黄酮的提取率为3.17%。此结果高于正交试验中所有的提取率, 因此这个结果是合理的, 考虑到成本及生产效率, 此组合为最佳生产工艺条件。因此, 本试验确定提取荷叶黄酮提取的最佳提取条件为温度为50℃、时间为1.5h、料也比1∶40和乙醇浓度为60%。

3 结论

在荷叶黄酮的提取中, 提取温度和时间是影响提取效率的2个主要因素, 而料也比及乙醇浓度对提取效果影响相对较小。通过正交试验, 获得了荷叶黄酮的最佳提取条件:温度为50℃、时间为1.5h、料也比1∶40和乙醇浓度为60%;在此条件下的提取率为3.17%。

参考文献

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金盏银盘总黄酮提取工艺研究 第10篇

关键词：金盏银盘,总黄酮,含量测定,提取工艺

金盏银盘(Bidens biternate(Lour.)Merr.et Sherff)为菊科鬼针属植物金盏银盘全草,药性:甘,微苦,凉。功用主治:清热,解毒,凉血。主治感冒暑热,黄疸,泻痢,吐血,血崩,跌打损伤,痈肿,鹤夕风,疥疮等[1]。据报道鬼针草能针草提取降低血压、降低血浆胆固醇,提高血浆高密度脂蛋白,并能降低胰岛素,可抑制ADP、胶原诱导的血小板聚集[2]。近年来,临床研究表明从鬼针草中提取的黄酮类化合物具有活血化瘀、通脉降压等功效,用于治疗原发性高血压,心脑血管疾病,具有抗血栓形成作用,对动脉硬化、血管栓赛有预防和治疗作用[3,4]。此外,还有研究发现鬼针草总黄酮对CCl4所致的小鼠急性化学性肝损伤和大鼠肝纤维化均有很好的防治作用[5]。金盏银盘是鬼针属类药材,该药材含有较多的黄酮类化合物,因此金盏银盘总黄酮在医药领域的应用具有广阔的前景,为了进一步开发和充分利用金盏银盘中总黄酮,我们采用正交实验的方法对其提取工艺进行研究。

1 仪器和试剂

电子天平AB104-N;UNICO-UV-2102-PC型紫外可见分光光度计;KQ-500B型超声波清洗器。

芦丁标准品(100080-200707),中国药品生物制品检定所;金盏银盘药材,江西樟树药材市场购买,由我校药用植物教研室葛菲教授鉴定;无水乙醇、三氯化铝均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备

取芦丁对照品10 mg,精密称定,加70%乙醇充分溶解,转移至25 mL容量瓶,加70%乙醇定容到刻度,摇匀,得对照品溶液。

2.2 测定波长选择

取芦丁对照品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加10%AlC3溶液1 mL(70%乙醇配制),用70%乙醇定容到刻度,摇匀。以70%乙醇溶液为空白,在200～800 nm范围内扫描。结果表明芦丁对照品溶液在428 nm处有最大吸收,因此选择428 nm为测定波长。

2.3 标准曲线的绘制

分别移取芦丁对照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于10 mL容量瓶,加10%AlC3溶液1 mL,用70%乙醇定容到刻度,摇匀。以70%乙醇溶液为空白,在428 nm范围内测定吸光度,以吸光度(A)对溶液浓度(C)作图,绘制标准曲线。得回归方程:

A=36.5148C+0.0028, R=0.9997

表明芦丁在浓度0.00415～0.0815 mg/mL范围内,A对C具有良好的线性关系。

2.4 供试品溶液的制备

取金盏银盘药材粗粉4.0 g,精密称定,置于250 mL的单口烧瓶中,加入20倍量的70%乙醇(80 mL),超声提取两次,提取温度为60 ℃,每次提取1.5 h,抽滤,合并滤液,药渣用70%乙醇洗涤2～3 次,一并纳入滤液,置于250 mL的容量瓶中,用70%乙醇定容,摇匀,的供试品溶液,待用。

2.5 金盏银盘总黄酮提取方法的建立

2.5.1 用乙醇超声提取

精密称取金盏银盘全草4.0 g,置于250 mL的单口烧瓶中,加入20倍量的70%乙醇(80 mL),超声提取两次,提取温度为60 ℃,每次提取1 h,抽滤,合并滤液,药渣用乙醇洗涤2～3次,一并纳入滤液,置于250 mL的容量瓶中,用70%乙醇定容,摇匀,待用。

2.5.2 用乙醇回流提取

精密称取金盏银盘全草4.0 g,置于250 mL的单口烧瓶中,加入20倍量的70%乙醇(80 mL),水浴回流提取两次,提取温度为80 ℃,每次提取1 h,趁热抽滤,合并滤液,药渣用乙醇洗涤2～3 次,一并纳入滤液,置于250 mL的容量瓶中,用70%乙醇定容,摇匀,待用[6]。

2.5.3 样品溶液总黄酮含量测定

精密量取样品溶液3 mL,置于10 mL的容量瓶中,按标准曲线制定方法进行操作,测定吸光度,由回归方程计算样品中总黄酮的含量,结果见表1。

由表1结果可以看出,超声提取法优于回流提取法。超声提取的总黄酮的量比回流提取的总黄酮的量约多1.1%。故本实验选择用乙醇超声提取的方法提取金盏银盘总黄酮。

2.6 乙醇超声提取法的工艺试验考察

2.6.1 正交试验因素水平的确定

取9份金盏银盘药材,每份约4 g,用托盘天平称定,置于250 mL的单口烧瓶中,按正交试验设计的要求进行实验。实验采用L9(34)正交设计,考察的影响因素有:A乙醇的浓度(%)、B乙醇的用量(倍)、C提取时间(h)、D提取的温度(℃)四个因素,提取的次数均为两次,确定的因素水平见表2。

2.6.2 正交实验结果

根据表3的分析结果可知,金盏银盘乙醇超声提取时,各个因素对金盏银盘总黄酮提取效果的影响程度不同,各因素的影响程度依次为A>C>B>D,可知对提取效果影响有统计学意义的因素是乙醇浓度A。综合直观的分析和方差分析的结果,金盏银盘总黄酮提取的最优工艺为A1B3C3D1,即用20倍量的70%乙醇,在60 ℃超声提取两次,每次提取1.5 h。

2.6.3 精密度和重复性实验

取同一供试品溶液,同法测定5次,分别计算供试品溶液中总黄酮的含量,其RSD为1.26%,表明该方法具有较好的精密度。

取同一样品5份,各4.0 g,精密称定后依法提取测定总黄酮的含量,每份样品测定3次,并取平均值,计算RSD为2.47%。说明在金盏银盘中总黄酮的提取和含量测定中,该提取工艺具有良好的稳定性和重现性。

3 结 论

对金盏银盘总黄酮提取结果影响较大的是乙醇浓度和提取时间,其次是乙醇的用量,影响最小的是提取温度。通过实验最后确定最优工艺的提取条件是,乙醇浓度为70%,提取时间为1.5 h,乙醇用量为药材量的20倍,提取温度为60 ℃。经验证该方法具有可靠地稳定性,为提高金盏银盘的使用价值和效率提供了指导。

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藜麦种子总黄酮提取及其抗氧化性 第11篇

关键词：藜麦；种子；总黄酮；提取工艺；正交试验；抗氧化活性

中图分类号： R284.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0355-04

藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）别称南美藜、奎藜、藜谷、奎奴亚藜等，是一年生的藜科（Chenopodiaceae）草本作物，原产于南美洲安第斯山区，至今已有5 000～7 000多年的利用和种植历史，被印加人称为“谷物之母”和“安第山的真金”[1-2]。藜麦蛋白质含量高达13%～23%，富含人体无法生产和必需的9种氨基酸且比例平衡[3-4]；钙、铁、锌、铜、锰、镁、钾、硒等矿物质营养成分的含量均较高[2，5]；藜麦种子中的油脂富含不饱和脂肪酸、类黄酮、B族维生素和维生素E等多种有益化合物。联合国粮农组织认为，藜麦是唯一的单一植株即可满足人体基本营养需求的食物，是最适合人类的全营养食品[6]。美国国家航空航天局（NASA）更是将藜麦列为人类未来移民外太空空间的理想的“太空粮食”[7]。

总黄酮是植物中重要的次生代谢产物之一，是一种生理活性活泼的物质，具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止动脉粥样硬化、降血压、降血脂及胆固醇、抗氧化、防衰老等药理作用[8]。研究者已用不同方法在甘薯（Ipomoea batatas）[9]、荞麦（Fagopyrum esculentum）[10]、银杏（Ginkgo biloba）[11]、枸杞（Lycium chinense Miller）[12]、菊花（Dendranthema morifolium）[13]、柑橘（Citrus reticulata Banco）皮[14]、花生（Arachis hypogaea）壳[15]以及豆科（Leguminosae）植物[16]等中进行总黄酮的提取及其含量测定。然而，有关藜麦总黄酮含量的研究国内外报道甚少[17]。本研究挑选已本土化栽培3年、农艺性状较好的藜麦品种Vanilla为材料，采用正交试验法对藜麦种子总黄酮的乙醇浸提法进行优化，同时测定其抗氧化活性，为优质高总黄酮得率藜麦品种的选育和利用等相关领域的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为农艺性状较好的藜麦品种Vanilla，由浙江农林大学农学院提供，大田种植于该校官塘农场，于2014年4月移载种植，8月下旬收获种子。种子干燥后充分碾碎，过60目筛筛选，装入干燥器皿中备用。

1.2 主要试剂和仪器

试验试剂：DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）购自东京化成工业株式会社；芸香苷对照購自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、硫酸亚铁、硝酸铝、过氧化氢、氢氧化钠、水杨酸、亚硝酸钠等试剂（均为国产分析纯）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要仪器：DHG9123A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）、TP-214电子天平（丹佛仪器有限公司）、XMTD-6000恒温水浴锅（上海申胜生物技术有限公司）、SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵（河南省巩义市予华仪器有限责任公司）、752PC紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麦种子总黄酮的提取 参考许钢等提取黄酮的方法[18-20]，设计藜麦黄酮提取的工艺流程：称取0.5 g干燥粉末→浸提剂浸泡→热回流提取→冷却→过滤→浓缩→定容棕色容量瓶→避光保存备用。

1.3.2 标准曲线的制备[13] 准确称取芸香苷标准试剂5.000 mg，用体积分数为60%的乙醇完全溶解后定容至50 mL，摇匀，得质量浓度为0.1 mg/mL的芸香苷标准溶液；分别吸取芸香苷标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于6支 10.0 mL的试管中，用体积分数为60%的乙醇补至 0.5 mL，加入质量分数为5%的亚硝酸溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min；再加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min；再加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，混匀，再加入体积分数为60%的乙醇0.4 mL，室温下放置15 min后于波长510 nm处测定其吸光度。取上述中加入溶剂配制的溶液作为空白，于510 nm处比色测定提取液的吸光度。用最小二乘法进行线性回归，得芸香苷标准溶液浓度（C）与吸光度（D）关系曲线的回归方程：D=0.356 3C-0.009 6；r2=0.999 1。

1.3.3 提取液中总黄酮得率的测定 分别取“1.2.1”节所得的待测总黄酮提取液代替芸香苷标准溶液，其他步骤与制作芸香苷标准方程相同。计算公式如下：

总黄酮得率=（C×V1×V2×10-3）/（m/V0）×100%。

其中：C为测定样液的质量浓度，g/L；V0为测定吸光度所用样液的体积，mL；V1为测定时的稀释体积，mL；V2为样液定容后的体积，mL；m为样品质量，g。

1.3.4 提取条件的选择

1.3.4.1 提取溶剂浓度对总黄酮得率的影响 取浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，料液比为1 g ∶ 30 mL，于60 ℃下热水浴提取60 min，进行总黄酮得率的测定。

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1.3.4.2 料液比对总黄酮得率的影响 在提取溶剂浓度为80%时，料液比分别取1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50 mL，于60 ℃下热水浴提取60 min，测定总黄酮得率。

1.3.4.3 提取温度对总黄酮得率的影响 当提取溶剂浓度为80%、料液比为1 g ∶ 30 mL时，分别在50、60、70、80、90 ℃热水浴中提取60 min，进行总黄酮得率的测定。

1.3.4.4 提取时间对总黄酮得率的影响 在提取溶剂浓度为80%、料液比为1 g ∶ 30 mL的条件下分别提取30、45、60、75、90 min，再于60 ℃热水浴中提取60 min，测定总黄酮得率。

1.3.5 正交试验[21] 根据已有数据资料及实际情况，选择提取溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间为考察因素，以测得提取液中的总黄酮得率为考察指标，按照正交表L9（34）设计4因素3水平正交试验。

1.3.6 抗氧化性测定方法

1.3.6.1 DPPH·的清除率[22] 准确称取DPPH·标准品10 mg，溶于无水乙醇中，超声5 min，充分振荡，并定容于 100 mL 容量瓶中，配成0.1 mg/mL DPPH·储备液，置于冰箱中备用。取不同质量浓度的藜麦总黄酮提取液2 mL，分别加入0.1 mg/mL DPPH·溶液2 mL，摇匀，在黑暗中放置30 min，以无水乙醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度D样品，用无水乙醇代替DPPH·溶液按上述方法测定吸光度D对照，用无水乙醇代替藜麦种子总黄酮提取液按上述方法测定吸光度为D空白。以维生素C作为阳性对照，按下式计算DPPH·的清除率：DPPH·清除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。

1.3.6.2 ·OH的清除率[23-24] 在试管中依次加入浓度为6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，不同质量浓度的藜麦种子总黄酮提取液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，摇匀，静置10 min，再加入6 mmol/L水杨酸溶液2 mL，摇匀，静置30 min，以蒸馏水为空白于波长510 nm处测定其吸光度D样品，用蒸馏水代替水杨酸按上述方法测定吸光度D对照，用蒸馏水代替总黄酮提取液按上述方法测定吸光度D空白。以维生素C作为阳性对照，按下式计算·OH清除率：·OH清除率=[1-（D样品-D对照）/D空白]×100%。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

2.1.1 提取溶剂浓度对总黄酮得率的影响 从图1可以看出，总黄酮得率随乙醇浓度的增加呈先增加后降低的趋势，于乙醇浓度为80%时达到最大。因此，乙醇浓度以70%～90%为宜。

2.1.2 料液比对总黄酮得率的影响 从图2可以看出，总黄酮得率随提取剂的增加呈先增加后降低的趋势，于料液比为1 g ∶ 30 mL 时达到最大。因此，料液比以1 g ∶ 30～50 mL为宜。

2.1.3 提取温度对总黄酮得率的影响 从图3可以看出，总黄酮得率随提取温度的增加呈“增加—降低—增长”的趋势，

于提取温度为60 ℃时达到最大。因此，提取温度以50～70 ℃ 为宜。

2.1.4 提取时间对总黄酮得率的影响 从图4可以看出，总黄酮得率随提取时间的延长呈先增加后降低的趋势，于提取60 min时达到最大。因此，提取时间以30～60 min为宜。

2.2 正交試验结果

将“2.1”节得到的提取条件结果按照L9（34）正交试验设计因素水平表，L9（34）正交试验设计及其结果见表1和表2。

由表2可以看出，热回流法提取藜麦种子总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B1C2D3，即乙醇浓度为80%，料液比为1 g ∶ 30 mL，在60 ℃下提取60 min时的总黄酮含量最高，可达2.64 mg/g。试验结果与Yuko等的研究结果[25]基本保持一致，具有可靠性。极差值反映的因子影响顺序为B>D>A>C，即料液比对提取率的影响最大。

2.3 抗氧化性试验结果

2.3.1 清除DPPH·效果的测定 DPPH·（二苯代苦味酰自由基） 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，深紫色，在 517 nm 处有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对，而使其颜色变浅，最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的。因此，用该波长处的吸光度可检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。抗氧化剂对DPPH·的清除率越高，其抗氧化性越强。藜麦种子总黄酮对DPPH·的清除作用见图5。

由图5可知，藜麦种子总黄酮对DPPH·表现出很强的清除作用，且与浓度呈正相关，IC50值为9.996 μg/mL。试验结果表明其清除能力高于小麦麸皮[26]、生姜[27]等。

2.3.2 清除·OH效果的测定 ·OH是最活泼的自由基，细胞内的H2O2能与Fe2+或Cu2+反应生成·OH。另外，紫外线也能使H2O2均裂生成·OH。同时，·OH也是毒性最大的自由基，它可与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，且反应速度快[28]。藜麦种子总黄酮对·OH的清除作用见图6。

由图6可知，藜麦种子总黄酮对·OH表现出较强的清除作用，且与浓度呈正相关，其IC50值为56.639 μg/mL，可见其清除能力高于小麦麸皮[26]、小驳骨[29]等。

3 结论

本研究通过正交试验设计优化藜麦种子总黄酮的提取工艺条件，本着溶剂无毒性、易回收、对黄酮溶解力强和工艺简单的原则，确定乙醇为最佳提取剂。试验结果表明最佳工艺条件为：提取溶剂（乙醇）浓度为80%，料液比为1 g ∶ 30 mL，在温度60 ℃下提取60 min。在此条件下，藜麦种子总黄酮得率高达2.64 mg/g。藜麦种子总黄酮对DPPH·和·OH有较好的清除能力，且随着浓度的增加，清除能力增加，清除率分别可达 90.89%、44.90%。其 IC50值分别为9.996、56.639 μg/mL。同时，本工艺在一定程度上节省原料，从而为其用于工业生产方面提供了一定的理论依据。

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垂柳叶总黄酮提取工艺的研究 第12篇

1 材料

1.1 主要试剂

垂柳叶, 采自吉林长白山;芦丁对照品, 购自中国药品生物制品检定所;其他药品均为分析纯。

1.2 主要仪器

循环水真空泵 (型号为SHZ-95) , 购自郑州科创仪器有限公司;电子恒温水浴锅 (型号为DK-98-I) , 购自天津市泰斯特仪器有限公司;旋转蒸发仪 (型号为RV-S) , 购自无锡星海王生化设备有限公司;电子天平 (型号为AR3130) , 购自OHAUS COPR Florham NJ USA;紫外-可见分光光度计 (型号为756PC) , 购自上海光谱仪器有限公司。

2 方法

2.1 垂柳叶总黄酮含量测定方法的建立

2.1.1 检测波长的选择

配制一定浓度的芦丁对照品溶液, 以甲醇为空白溶液, 采用紫外-可见分光光度法在200~400 nm波长范围内进行紫外全波长扫描, 根据扫描结果可知芦丁在256 nm波长处有最大吸收峰, 因此选择256 nm作为总黄酮的检测波长。

2.1.2 方法学考察

1) 标准曲线的绘制。精密称取芦丁对照品2.5 mg, 置25 m L容量瓶中, 加入甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 配制成浓度为0.1 mg/m L的溶液, 将上述溶液依次稀释成浓度为0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06 mg/m L的溶液, 在256 nm波长处测定吸光度值, 以浓度为横坐标、吸收度值为纵坐标绘制标准曲线。

2) 日内及日间精密度试验。取标准曲线项下浓度为低、中、高3个浓度 (0.02, 0.04, 0.06 mg/m L) 的溶液, 每天测定5次, 计算日内精密度;每天测定1次, 连续测定5 d, 计算日间精密度。

3) 回收率试验。取垂柳叶总黄酮适量, 加到已知浓度的芦丁对照品溶液中, 配制低、中、高3个浓度 (0.01, 0.02, 0.03 mg/m L) 的样品, 在256 nm波长处进行测定, 每个样品测定5次。

2.2 垂柳叶总黄酮的提取

2.2.1 单因素试验

1) 乙醇浓度的考察。称取10 g垂柳叶干燥粗粉, 分别加入100 m L 40%、60%、80%、95%乙醇, 固定其他条件, 回流提取2次, 每次2 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇, 浓缩至稠膏后测定总黄酮含量。

2) 提取次数的考察。称取10 g垂柳叶干燥粗粉, 加入100 m L 60%乙醇, 固定其他条件, 分别提取1, 2, 3, 4次, 每次2 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇, 浓缩至稠膏后测定总黄酮含量。

3) 乙醇用量的考察。称取10 g垂柳叶干燥粗粉, 加入60%乙醇, 乙醇用量分别为6倍、8倍、10倍、15倍, 固定其他条件, 回流提取2次, 每次2 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇, 浓缩至稠膏后测定总黄酮含量。

4) 提取时间的考察。称取10 g垂柳叶干燥粗粉, 加入60%乙醇100 m L, 固定其他条件, 回流提取2次, 提取时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇, 浓缩至稠膏后测定总黄酮含量。

2.2.2 正交试验

在单因素试验基础上, 选择L9 (34) 的正交设计方案, 以乙醇浓度 (A) 、提取次数 (B) 、乙醇用量 (C) 和提取时间 (D) 作为因素, 每个因素取3个水平, 经过9个处方的试验, 以总黄酮含量为评价指标, 进一步优化最佳提取工艺。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

3.1.1 标准曲线的绘制

标准曲线的回归方程为:y=14.686x-0.007 3, R2=0.999 2。标准曲线见图1。

由图1可知, 芦丁浓度在0.01~0.06 mg/m L范围内线性关系良好。

3.1.2 日内及日间精密度试

结果见表1。

%

由表1可知, 日内精密度在1.19%~1.46%之间, 日间精密度在0.24%~1.87%之间, 仪器精密度良好。

3.1.3 回收率试验

结果见表2。

%

由表2可知, 该方法回收率符合测定要求。

3.2 垂柳叶总黄酮的提取结果

3.2.1 单因素试验

1) 乙醇浓度的考察, 结果见图2。

由图2可知, 增加乙醇浓度可以提高总黄酮含量, 但乙醇浓度过高时, 总黄酮含量反而降低, 用80%乙醇提取时垂柳叶总黄酮含量最高。

2) 提取次数的考察, 结果见图3。

由图3可知, 增加提取次数可以提高总黄酮含量, 但提取次数过多时, 总黄酮含量没有太大变化, 最佳提取次数为3次。

3) 乙醇用量的考察, 结果见图4。

由图4可知, 增大乙醇体积可以提高总黄酮含量, 但乙醇体积过高时, 总黄酮含量反而降低, 用10倍量乙醇提取得到的垂柳叶总黄酮含量最高。

4) 提取时间的考察, 结果见图5。

由图5可知, 增加提取时间可以提高总黄酮含量, 但杂质含量增加时, 总黄酮含量反而降低, 最佳提取时间为3 h。

3.2.2 正交试验

结果见表3、表4。

由表3、表4可知, 最优水平为A1B3C3D1, 即垂柳叶用75%乙醇回流提取3次, 提取时间为2.5 h, 乙醇用量为11倍。各因素对回流提取工艺的影响程度为RA>RB>RC>RD。

4 结论

本研究采用单因素试验及正交试验确定了垂柳叶总黄酮乙醇回流提取的最佳工艺为75%乙醇回流提取3次, 提取时间为2.5 h, 乙醇用量为11倍, 本研究选择的乙醇回流法提取工艺简单可行, 可获得令人满意的结果。

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