复合基质范文（精选6篇）
复合基质 第1篇
目前常见的补充到浮岛中的载体为人工合成载体或无机合成载体。将填料作为生物载体补充到生态浮岛系统中, 对实现生态浮岛的生物量和生物多样性起到了很大的补充作用, 李先宁等人将人工合成的塑料填料补充到生态浮岛系统中, 使生态浮岛的COD、TN等提高了一定幅度[6]。罗固源等人将陶粒作为生物附着载体填充到生态浮岛系统中使水体修复效果得到了一定改善[7]。说明生物载体加入到生态浮岛中将有利于生态浮岛水体修复效果。但以生物可降解的填料作为生态浮岛的载体的少有报道。不同载体类型的浮岛对氮、磷的去除效果可能会有明显的差异, 因为载体材质和类型不同时, 其理化特性是完全不一样的, 可能对大型水生植物的生长、同化吸收、 生物量、水体污染物修复效果等产生不一样的影响。因此对污染水体中的浮岛载体的选择, 及载体表面微生物的生长特性以及对不同氮、磷吸收能力的浮岛载体进行优化配置显得尤为重要[8], 对生态浮岛技术的强化和研究具有十分重要的价值。
徐州地区作为重要的大米生产基地, 稻草秸秆的产生量十分巨大, 目前依旧少量的稻草用于制作沼气、饲料等, 而稻草的处理方法多数仍然以焚烧为主, 造成了极其严重的大气污染问题。本研究中将纯天然的稻草基质引入浮岛中, 实现稻草资源化利用和水体生态修复双重效果。以复合植物浮岛的不同载体为研究对象, 探讨在批式实验和连续流实验中不同基质复合植物浮岛净化污染水体的效果及特性, 为优化生态浮岛系统提供必要的理论依据。
1材料与方法
1.1主要材料
选择适当的植物是构建浮岛的关键。浮岛植物的生长受载体、气候、温度等影响, 其吸收水中的氮、磷的能力随生长与生理活动状态而变化。在同一浮岛中不同植物污水净化效果也不一样。不同的浮岛植物种类, 其生长速度, 对污染物的吸收转化能力等有很大差异[9，10]。考虑到徐州地区的气候条件, 选择耐污能力强、去污效果好、根系发达及一定经济和观赏价值的美人蕉和菖蒲两种挺水植物作为本次实验的供试植物。 实验时将购买来的育苗剪成相同的高度, 约为35cm, 然后现场随机选取3棵菖蒲和1棵美人蕉移栽置生态浮岛上进行实验。
实验采用的基质分别是塑料球形填料基质和稻草基质。 塑料球形填料基质由聚丙烯材料注塑而成, 型号为QTL-80X, 分内外双层球体, 外部为中空渔网状球体, 内部为旋转球体, 尺寸为Φ80mm, 内芯为纤维球, 空隙率高达97%以上, 比表面积为800m2, 堆积密度为0.92g/cm3, 堆积数量2 000个/m3, 为了使塑料球形填料不漂浮在水面上, 并起到固定植物根系的作用, 在塑料球形填料中心补充鹅卵石, 使其密度保持在1.2~ 1.3g/cm3。稻草填料由取自徐州工程学院中心校区周边农田陈年稻草自行加工而成, 外形为长方体, 尺寸为30mm5mm 1mm (LBH) , 空隙率为95%, 比表面积为500m2, 堆积密度为0.43g/cm3, 堆积数量为4 120个/m3。
1.2实验水体
实验水体采用人工模拟污水, 在每35L的自来水中加入0.6g氯化铵 (NH4Cl) , 1.0g硝酸钾 (KNO3) 及0.12g磷酸二氢钾 (KH2PO4) , 模拟水中的氮、磷污染并为植物生长提供所需的氮、磷等营养物质, 另外向自来水中加入1.2g的葡萄糖 (C6H12O6) , 为微生物提供可容易降解的碳源, 提高微生物的驯化效果。
1.3实验方法
实验前, 将稻草放入自来水中浸泡一周, 因为未经处理的稻草在实验过程中会释放出一定量的含氮色素, 通过浸泡可以减少含氮色素对脱氮效果的波动[11]。
(1) 批式实验。批式实验设3种处理方法, 以不同的填料作为浮岛基质, 分别为塑料球形填料基质生态浮岛 (FI-PF) 、稻草基质生态浮岛 (FI-RS) 和纯植物生态浮岛 (FI-PP) 。采用规格相同的大水桶组建3组平行实验来人工模拟净化开放水体。 水桶的外形为圆柱形, 直径为35.5cm, 高为48.5cm, 总容积为48L, 由人工合成的有机塑料注塑而成, 实际供试水体体积为35L。生态浮岛系统由简易材料制作而成, 在普通的塑料圆台形垃圾篮外围用绳子绑上泡沫使其悬浮在水中, 塑料篮的直径为24.3cm, 高为22cm, 容积为10L, 篮中填充不同的浮岛基质, 使基质的填充率和水面覆盖率均为70%和45%, 并在篮子四周将相同数量的水生植物固定, 水生植物相互的间距为10 cm, 4棵植物按正方形形状栽种, 并使植物的根部伸入基质且淹没于水中。水桶的底部均布置1个小型波浪发生器, 用于促进浮岛内、外水体的交换。批式实验共15d, 期间每天采样分析一次, 监测水中氮、磷及高锰酸盐指数的变化, 每次取完水样后向原水中加入相同体积的蒸馏水, 保证供试水体体积不变。 实验周期为5d, 每个周期前后记录下复合植物 (美人蕉和菖蒲) 的株高。批式实验的进水水质指标如下:NH4+-N为3.55 ~3.78 mg/L, NO2--N为5.79~6.03 mg/L, NO3--N为8.86~8.97mg/L, TN为15.64~15.88 mg/L, TP为0.18~ 0.24mg/L, 高锰酸盐指数为8.15~9.36mg/L。
(2) 连续流试验。连续流实验只设塑料球形填料基质生态浮岛 (FI-PF) 、稻草基质生态浮岛 (FI-RS) 两种处理方式 (浮岛规格同上) 。实验污染水体通过抽水泵分别抽至2个生态浮岛的上表面, 浮岛的四周用不透水的膜将其封住, 使水只能依靠重力作用从浮岛底部流出, 净化后的污水在水桶 (水桶规格同上) 中达到一定液位时便会以重力出流的方式流出桶外。水桶的底部放置一个曝气头, 通过增氧泵向水中曝气供氧的同时起到搅拌混合的作用。连续流实验为期10d, 实验期间控制2个抽水泵的流速相等, 保证水力停留时间为12h, 每天对水中的氮、磷和高锰酸盐指数进行监测分析。连续流实验的进水水质指标如下:NH4+- N为3.47~3.75 mg/L, TN为15.37~ 16.28mg/L, TP为0.16~0.29mg/L, 高锰酸盐指数为8.17~8.86mg/L。
1.4水质分析方法
水质测定方法均采用国家标准方法 (《水和废水监测分析方法》) 进行[12], 高锰酸盐指数采用高锰酸钾滴定法;NH4+- N, NO2--N, NO3--N, TN和TP均采用紫外可见分光光度计测定。
2结果与分析
2.1批式实验的净化效果
2.1.1植物生长状况
菖蒲和美人蕉株高变化分别如图1和图2所示。3组实验浮岛中复合植物均呈增长趋势, FI-RS中菖蒲和美人蕉生长最快, 分别增长了30.5和36.3cm, 增长幅度优于FI-PF中的25. 3和30.9cm。纯植物生态浮岛中菖蒲和美人蕉增长趋势相比于2个实验较为缓慢, 只增高了8.6和14.3cm。实验期间发现FI-PF和FI-PP中美人蕉叶缘卷曲且叶子发黄, 甚至出现枯萎迹象, 而FI-RS中美人蕉叶子青翠。通过检测发现稻草中含有丰富的微量元素[13], 如钙、钾、镁、磷等, 植物生长发育过程中需要这些微量元素, FI-PF和FI-PP表现出缺素症, FI-RS因获得的营养元素较多所以上生长效果最好。
2.1.2氮素污染物去除效果对比
3组实验浮岛对水体中不同存在形式的氮素污染物的去除效果分别如图3~图6所示。分析图3可知, 进水NH4+-N为3.55~3.78 mg/L, FI-RS在净化周期的前3d内对水中的NH4+-N去除效果非常明显, 第3天水中的NH4+-N已很低, 随后水中的NH4+-N的去除效果开始呈下降趋势, 最后剩余的NH4+-N含量与FI-PF中的极为接近, 两者的平均去除率分别为97.2±0.08%和96.4±0.06%, 均优于FI-PP的93.1 ±0.14%。水中亚硝化菌和硝化菌的存在是NH4+-N转化的主要推动力[14]。
观察图4发现, 当进水NO2--N为5.79~6.03mg/L时, FI-RS中NO2--N的含量在前2d是3组浮岛中最高的, 因为NH4+-N的大量转化导致NO2--N的积累[15], 但NO2--N的含量却一直在减少, 第3天突然急剧下降, 可推测大部分的NO2--N在硝化作用下转化为NO3--N。另2个浮岛的NO3--N下降趋势较为平缓。
分析图5可知, 进水NO3--N为8.86~8.97mg/L, FI-RS在第3天时NO3--N也开始急剧减少, 只有可能是NO3--N在反硝化作用下被还原为N2从水中逸出。因稻草堆积起来能有效隔绝空气, 实验阶段发现FI-RS很容易形成缺氧区, 且稻草中可以释放出大量的碳源[13], 有助于实现反硝化反应。长期观察发现FI-RS可在实验周期的前3天内基本上完成整个反硝化反应, 所以第3天后NO3--N含量保持极低且最后趋于平衡。
图6显示的是3个浮岛对水中TN的去除效果, 进水TN为15.64~15.88mg/L, FI-RS对水中TN的去除效果最好, 平均去除率高达95.4±0.10%, 符合上述内容对FI-RS中氮素污染物去除效果的分析。FI-PF和FI-PP对水中TN的去除效率明显低很多, 平均去除率分别为53.1±0.21% 和38.7± 0.12%。FI-PF因提供缺氧区难和释放碳源不足而限制了其反硝化反应的效果, 而FI-PP主要依靠植物根系的吸收作用, 所以只能很有限的去除一部分TN。
2.1.3 TP去除效果对比
从图7可知, 进水TP为0.18~0.24mg/L, 3组浮岛对水中TP的去除效果极为接近, 平均去除率按FI-PP、FI-PF和FI- RS的顺序依次为52.7±0.01%, 53.3±0.01% 和56.1± 0.02%。水中的聚磷菌在厌氧条件下水解细胞原生质中聚合磷酸释放磷, 然后在有氧条件下可以过量摄取磷合成聚磷酸盐而储存于细胞内, 实验阶段没有通过排放富含磷的污泥将磷从水中去除, 但磷元素仍存留在水中, 只是依靠植物根部的吸收作用去除水中的一部分磷, FI-RS中的植物因生长发育良好对TP的吸收效果稍微好一些。
2.1.4高锰酸盐指数去除效果对比
观察图8可知, 进水高锰酸盐指数为8.15~9.36mg/L, FI ?RS中的高锰酸盐指数在实验周期前2d较低且减少, 稻草组织细胞中的水溶性物质释放和水中所含的高锰酸盐指数均作为反硝化反应所需的碳源。随后高锰酸盐指数呈负增长趋势, 因为反硝化反应在前3d内基本完成, 释放的水溶性物质和水中的高锰酸盐指数无法被有效利用于水中累积所致。FI-PF和FI-PP中的高锰酸盐指数均被一定程度的去除, 平均去除率分别为28.2±0.11%和38.9±0.15%。FI-PF中的生物量相比于FI-PP要多, 利用微生物降解水中高锰酸盐指数效果要好。 另外, 实验过程中发现, FI-RS中可以闻到一股植物腐败后形成的气味, 可能是由于植物腐败后形成一些挥发性脂肪酸[16]。
2.2连续流实验的净化效果
2.2.1氮素污染物的去除效果对比
分析图9可知, 进水NH4+-N为3.47~3.75 mg/L, FI- RS和FI-PF中出水NH4+-N随反应时间的增加不断减少, 前期FI-RS的去除效果比FI-PF好一些, 后期两者去除效果越来越接近且NH4+- N含量开始趋于平稳, 最终去除率分别95.7%和94.9%。表明FI-RS硝化菌在连续流实验中未能形成自己的优势种群。 观察图10发现, 进水TN为15.37~ 16.28mg/L, FI-PF中的TN前4d增加, 分析认为水中的NO2--N和NO3--N不断积累残留于水中导致的现象, 第5天的TN突然急剧下降, 因此第五天后FI-PF中的反硝化反应成为TN去除的主导作用, 最终TN去除率为51.2%。FI-RS中的TN前5天略有上升, 但后期开始减少, 最终去除率为62.3%。相比于FI-PF而言, FI-RS适应水质的周期较短且承受水质波动的能力更强。
2.2.2 TP的去除效果对比
由图11可知, 进水TP为0.16~0.29 mg/L, 2个实验浮岛中的TP均不断增加, 由于水中的聚磷菌没有及时有效的排出水体外, 导致TP在水中不断积累。但FI-RS中的TP含量却一直保持低一点, 原因在于FI-RS能有效形成厌氧-好氧的环境, 有利于聚磷菌的生长发育并形成含磷污泥, 在出水过程中被水流携带走的含磷污泥量会更多一些, 所以水中存留的TP相对来说会减少。
2.2.3高锰酸盐指数的去除效果对比
观察图12发现高锰酸盐指数为8.17~8.86mg/L, FI-RS中的高锰酸盐指数较高, 因为稻草组织细胞中有水溶性物质浸出, 可以为反硝化反应提供足够的碳源, 高锰酸盐指数不再是碳源的主要来源, 所以水中高锰酸盐指数一直保持较高的含量, 但第6天FI-RS中高锰酸盐指数开始持续下降, 因稻草中的水溶性物质已基本释放完全, 高锰酸盐指数重新变为反硝化反应所需碳源的主要来源。FI-PF中的高锰酸盐指数的变化是先升高后降低, 上升是由于水中高锰酸盐指数未能的及时通过出水排放出去, 前期反硝化作用效果不明显, 但随着时间的增加反硝化作用越来越突出, 所以水中的高锰酸盐指数才会开始下降。
3结语
(1) 批式实验中, 以稻草为浮岛基质的FI-RS中的复合植物无论从植物株高和植物生长方面来讲, 相比于FI-PF和FI- PP更具优势, 因此稻草基质对植物的生长具有良好的促进作用。从水体的净化修复效果考虑, FI-RS对氮素污染物 (TN) 的平均去除率高达95.4±0.10%, 明显优于FI-PF的53.1± 0.21%和FI-PP的38.7±0.12%, 因此稻草基质相比于塑料球形填料基质在强化水质净化更具优越性。稻草在实验阶段能释放出水溶性物质弥补反硝化反应的碳源不足, 因此稻草又是一种潜在的固相碳源。
复合基质 第2篇
[关键词]脱钙骨基质颗粒；磷酸钙骨水泥；骨缺损
[中图分类号]R683[文献标识码]A[文章编号)1009－6019－(2010)05－32－01
1目的
观察比较脱钙骨基质颗粒、磷酸钙骨水泥复合物填充修复桡骨骨缺损的能力，从而确定该复合材料的最佳比例配方，为临床修复节段性骨缺损探索一有效途径。
2材料和仪器
实验动物：清洁级新西兰兔35只，雌雄不限，重量1.5-2.5kg(哈尔滨医科大学动物实验室提供；-饲养环境：温度17～25度。按随机原则取2只制备脱钙骨基质；实验兔35只，2只取骨制备脱钙骨基质；其余33只分成2组，A组30只做为实验组，B组3只做为对照组。磷酸钙骨水泥(calcium phos.phate cement，CPC)上海瑞邦生物材料有限公司惠赠；扫描电镜，哈医大病理教研室提供；生物力学试验机，哈工大生物力学实验室提供。
3方法
实验兔35只，2只取骨制备脱钙骨基质；其余33只分成2组，A组30只，B组3只。制造两侧兔桡骨中段1cm的骨缺损模型，A组用脱钙骨基质颗粒、磷酸钙骨水泥按不同比例(2：8，3：7，4：6，5：5，6：4)制各成复合材料，植入实验兔双侧桡骨骨缺损处作为实验组。B组以单纯磷酸钙骨水泥材料植入骨缺损处作为对照组。对复合材料和单纯材料进行扫描电镜观察及生物力学测试。在术后4，8，12周时进行大体标本观察、组织病理学、x线片观察，比较其修复填充骨缺损的能力。
4结果
脱钙骨基质颗粒与磷酸钙骨水泥质量比在3：7—6：4的范围内，复合材料中存在较多100 um以上的裂隙，当质量比小于3：7时，材料内部的大部分间隙<100um，质量比大于6：4时两种材料不能有效地凝固在一起。随质量比的增加，材料抗压极限强度递减，各组数据经方差分析，差异具有显著性意义(P<0.05)。在各时间点大体标本观察、组织病理学、x线片观察显示骨缺损填充部位均有不同程度新骨形成。12周时脱钙骨基质颗粒与磷酸钙骨水泥质量比在4：6时骨结合率最高。
5小结
复合基质 第3篇
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验作物品种为宝大906番茄。基质材料包括:蛭石、珍珠岩、蚓粪。蚓粪来自蚯蚓消解牛粪后的蚯蚓粪。试验材料的分析测定参照土壤农业化学分析方法[15,16]。材料的主要理化性质见表1。
1.2 试验设计
试验于2010年12月20日至2011年1月30日在宿迁市绿蔬园蔬菜专业合作社塑料大棚中进行。试验设5个用量比例的蚯蚓粪替代复合基质中的泥炭。各处理复合基质中泥炭∶蚯蚓粪∶蛭石∶珍珠岩的比例分别为:8∶0∶1∶1 (CK) 、6∶2∶1∶1 (A) 、4∶4∶1∶1 (B) 、2∶6∶1∶1 (C) 、0∶8∶1∶1 (D) 。为防止育苗后期脱肥, 在复合基质中添加尿素0.5 kg/m3和磷酸二氢钾0.5kg/m3, 肥料和基质各组分充分混匀后备用。育苗容器采用72孔塑料标准穴盘, 各处理均设3次重复。
1.3 调查统计
播后齐苗时统计种子发芽率, 育苗试验结束时, 对各重复均随机采样10株, 分别测量株高、基茎粗、开展度、根长, 称取地上部质量、地下部质量等番茄生长指标。番茄苗的株高、根长用直尺进行测量。株高起点为茎底部, 终点为生长点;根长仅测量最大根长;茎粗采用游标卡尺进行测量, 量取子叶下端茎的直径;地上部鲜质量、地下部鲜质量用电子天平称量;幼苗干质量是将根部基质洗净后将幼苗的地上部和地下部分别放入烘箱, 105℃杀青15 min, 然后在80℃下烘至恒重, 用电子天平称量。所得数据采用Excel办公软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 复合基质配比对番茄发芽的影响
播种后第8天统计种子的发芽情况, 从表2可以看出, 蚯蚓粪团粒对泥炭的不同取代比例对番茄种子的发芽率和发芽势均有显著影响。配入60%蚯蚓粪团粒的处理C番茄种子发芽率最高, 达到95.4%, 比CK高出2.5个百分点。随着基质中蚓粪比例的进一步提高, 番茄种子发芽率有所下降, 蚓粪比例达到80%时 (处理D) , 番茄种子发芽率下降到94.3%。可能是基质中过多配入蚯蚓粪提高了基质的盐分含量, 对番茄种子的发芽造成不利影响。同样, 番茄种子发芽势所受到的影响与发芽率受到的影响完全一致。
2.2 复合基质配比对番茄幼苗形态指标的影响
从表3可以看出, 随着复合基质中蚯蚓粪替代泥炭比例的增加, 番茄幼苗在株高和茎粗指标上呈先上升后下降的趋势。其中, 配入60%蚯蚓粪团粒的处理C株高和茎粗最大, 分别达到了13.85 cm和0.37 mm, 分别比CK高16.6%和42.3%。番茄幼苗开展度也受到类似的影响, 处理C的开展度为14.12 cm, 比CK高9.2%。番茄的最大根长同样以处理C最大, 达16.27 cm, 高于CK 38.6%。从番茄根系的生长情况看, 蚯蚓粪完全替代泥炭的处理D表现出不利于番茄侧根的生长, 根系颜色呈灰黄色, 氧化力明显下降的现象。
2.3 复合基质配比对番茄幼苗生长量的影响
从表4可以看出, 随着复合基质中蚯蚓粪比例的增加, 番茄幼苗的生长量包括地上部鲜重和干重都呈现出先上升后下降的趋势。地上部鲜重和干重的最大值均出现在处理C, 其次为处理B;地下部鲜重和干重最大值均出现在处理B, 其次为处理C。无论是根据鲜重还是干重计算得到的根冠比大小来看, 也都表现出随蚯蚓粪配入比例的提高而呈现出先上升后下降的趋势, 过高的蚯蚓粪比例也会导致番茄幼苗根冠比的下降。
3 讨论与结论
3.1 讨论
在该试验研究中, 作为番茄穴盘育苗基质的推荐配方, 蚯蚓粪的配比应是40%~60%, 这与部分前人在番茄、茄子、辣椒等作物上的研究结果相似[12,13,14,17,18]。当然, 蚯蚓粪配入基质的比例不仅与其来源有关, 而且也要考虑不同番茄品种的生长与营养特性。蚯蚓粪的性质与其来源有很大联系。番茄品种的生长与营养特性, 特别是对生长环境条件的敏感程度差异很大。育苗过程中各种管理措施, 包括水分管理与养分调节等, 会在不同程度上影响番茄自身生长及其生长环境的调节, 从而影响基质效果的表现。蚯蚓粪作为新型复合基质材料在替代泥炭方面的理论与技术研究尚待深入。
3.2 结论
(1) 用于番茄育苗的复合基质中蚯蚓粪可以在很大程度上替代泥炭。蚯蚓粪替代泥炭的比例对番茄穴盘育苗发芽与生长有一定的影响。但基质中蚓粪含量过高时, 会因为其较高的含盐量, 而导致番茄种子发芽率降低, 并在整个幼苗生长过程中对地上部和地下部生长量产生抑制作用。
复合基质 第4篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
2003年12月至2007年12月我课题组共收治节段性骨缺损病例36 例 (骨缺损长度选定为6～12 cm) , 男24 例, 女12 例;平均年龄39 岁 (20～65 岁) 。其中, 骨盆骨缺损3 例, 肱骨骨缺损9 例, 尺桡骨骨缺损5 例, 股骨骨缺损12 例, 胫腓骨骨缺损7 例。骨肿瘤25 例, 骨折后骨不连11 例。
依据同种病情、患者自愿的原则, 采用纳入法将36 例患者随机分为两组 (即A组和B组) 。
1.2 APBSC的采集[1]及手术方法
患者入院后在常规术前检查和治疗原发病的基础上, 手术前6 d给予分泌型重组人粒细胞刺激因子, 600μg/d皮下注射, 连用5 d。手术当日经美国Baxter公司生产的CS3000PLUS血细胞分离机, 分离出外周血干细胞悬液50 mL, 采集后干细胞不做任何处理留置备用 (外周血干细胞采集工作在孝感市中心血站实验室完成) 。
根据患者骨缺损病变部位, 采用相应的手术麻醉和手术切口, 充分显露骨缺损部位, 彻底清理骨缺损部位的软组织和病变骨组织。疏通上下髓腔, 将骨断端修理成梯形以便充分嵌合, 清洗术野。
根据骨缺损长度制备相应的BMG (课题组所用BMG均由医院指定的山西组织骨库制备、提供) , 将外周血干细胞悬液种入制备好的BMG中。A组患者将APBSC/BMG复合体充分嵌合于骨断端, B组患者仅使用BMG嵌合于骨断端, 根据骨缺损部位选择相应的钢板、螺钉或交锁髓内钉进行牢固内固定。
术野放置引流管, 依次缝合各层组织, 术毕。术后24 h拔引流管, 抗生素术后使用1周, 术后2周切口拆线。
1.3 统计学处理
所得数据以undefined表示, 组间比较应用SPSS10.0统计软件进行t检验。
2 结 果
2.1 影像学观察
术后1个月复查X线片显示:A组患者骨折端有骨痂形成;B组患者骨折端骨痂形成不明显, 两组患者骨折处皆有压痛。2个月复查X线片显示:A组患者可见骨折端有大量骨痂形成, 骨折处压痛不明显, 此时开始功能锻炼;B组患者骨折端有骨痂形成, 骨折处压痛较前减轻。3个月复查X线片显示:A组患者可见骨折端有连续骨痂形成, 骨折处无压痛;B组患者骨折端有大量骨痂形成, 骨折处有轻微压痛。
2.2 愈合时间比较
平均愈合时间A组为5个月, B组为8个月, 两组间差异具有统计学意义 (P<0.05) 。在治疗期间, 患者未见感染及其他并发症, 随访12个月均未发生再骨折。
2.3 功能评估
术后结果评定根据国际保肢学会功能评分标准[2]评定, 术后依疼痛程度、功能活动、心理接受程度、是否用外部支持、行走能力和步态6个指标评价效果。每个指标分0、1、2、3、4、5分, 共6级。总分30分, 大于24分为优, 18～24分为良, 小于15分为差。A组优16 例, 良2 例;B组优14 例, 良4 例, 两组间差异没有统计学意义。
3 讨 论
3.1 APBSC/BMG移植理论基础
骨组织的再生要求有3个基本的生物学因素参与, 即细胞, 生长调节因子, 细胞外支架材料。种子细胞 (成骨细胞) :理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点, 即取材容易, 对机体损伤小;在体外培养中易定向分化为成骨细胞和具有较强的传代繁殖能力;植入机体后能适应受区的环境并保持成骨的活性。目前发现种子细胞有以下几种来源, 即胚胎骨、骨外膜、骨髓、骨外组织 (包括外周血干细胞) 。其中, 外周血干细胞具有很强的传代繁殖和定向分化为成骨细胞的能力, 植入机体后能适应受区的环境, 保持成骨活性。生长调节因子:主要是生长因子和细胞因子, 在组织工程中, 某些种子细胞在体外传代培养后, 经过一段时间细胞极易衰老, 而生长因子能调节种子细胞的增殖和分化。对成骨细胞起着重要调节作用的生长因子有转化生长因子β、胰岛素样生长因子、骨形成蛋白、碱性成纤维细胞生长因子及血小板衍生生长因子等。细胞外支架材料:理想的组织细胞外基质材料必须具有如下特征, 即良好的生物相容性, 良好的生物降解性, 具有三维立体多孔结构, 良好的可塑性和一定的机械强度, 良好的材料-细胞界面, 材料须易于消毒。用于组织工程的支架材料有天然和人工合成两类, 目前用于细胞支架材料的主要有聚乳酸、聚羟基乙酸及表面脱钙骨基质明胶。它们突出的优点是:生物相容性良好, 降解速度可调, 降解产物易于代谢和排除, 以及材料易于消毒等。
干细胞又称为多潜能干细胞, 主要来源于胚胎时期的卵黄囊, 为骨髓的原始细胞。既往用于移植的干细胞主要采自骨髓, 因此称为骨髓移植。然而随着血液学研究的进一步深入, 有研究发现[3]干细胞不仅存在骨髓中, 同时也存在于脐带血、胚胎肝脏及外周血中, 骨髓移植这一较为片面的概念逐渐被干细胞移植所替代。APBSC来源于骨髓, 与骨髓干细胞具有共同的生物学特征, 既不断地自我更新, 在造血组织中维持一定数量的能力, 又有分化为骨髓红细胞系、粒细胞系、淋巴细胞系以及巨核细胞系的潜力[4]。有研究表明[5]外周血细胞的不同阶段, 包括干细胞、前祖细胞及晚祖细胞, 均有CD34+细胞膜分化抗原, 然而定向祖细胞却没有这种抗原, 由此外周血干细胞可以由CD34+细胞代表。正常情况下, 外周血细胞中只有 (0.2±0.1) %的CD34+细胞[6], 表明外周血中干细胞数量极低, 远不能满足临床应用的需要。增加移植所需要外周血干细胞数的主要方法包括[1]:a) 骨髓抑制性化疗药;b) 造血因子:其中粒细胞集落刺激因子最常用;c) 前两种联合应用, 以上方法可使外周血干细胞增加数十倍, 甚至数百倍。本课题组根据课题研究条件选择粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员。目前从外周循环血中直接分离外周血干细胞的难度较高, 本实验利用干细胞的大小与淋巴细胞接近的形态学特点, 用淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞或单个核细胞, 从而提取移植所需要的外周血干细胞[5,7]。
Chalmers等[8]提出骨形态蛋白、间充质细胞、骨生长环境是诱导成骨的三个关键要素, 骨形态蛋白作为诱导刺激物作用于间充质细胞, 在有利于骨生长的血液环境中, 诱导刺激骨形成。BMG含有骨形态蛋白, 其由同种异体骨经过脱脂、表面脱钙、脱蛋白、脱细胞处理等处理后, 去掉了除骨形态蛋白以外95%的非胶原蛋白和具有阻滞作用的脂质成分[9]。有实验研究表明[10], BMG移植在短期 (6～9周) 可以产生较大的骨诱导作用。BMG[11]的特点:既有强度又有孔隙;其免疫原性低, 生物相容性好;与外周血干细胞及软骨细胞复合后具有较好的兼容性;能在体内逐渐吸收, 被新骨所替代;来源广泛。因此, 逐渐成为临床上常用的骨移植材料[12,13]。BMG不用与任何移植材料的空白对照组比较, 其疗效已被大量文献报告[14,15,16]所肯定。
骨折愈合是建立骨的连续性和恢复骨的生物学特性。APBSC/BMG复合移植治疗骨缺损, 既利用了外周循环血中的多潜能干细胞, 保留骨的生物学特性;又利用了BMG中的骨形态蛋白, 从而诱导成骨细胞形成[17,18]。APBSC在BMG的骨形态蛋白诱导下具有明显的成骨作用。与单纯BMG移植相比较, APBSC/BMG复合移植具有新骨形成时间更短、新骨形成质量更好的优点。
我们认为APBSC/BMG复合移植具有广泛的临床应用前景, 理由是:a) APBSC/BMG复合移植避免了传统手术中自体采骨给患者带来的痛苦以及供区新的骨缺损等一系列并发症, 对机体创伤减小到最低限度, 移植物处理达到几乎无创伤[14]。b) 使骨缺损修复的手术难度降低。c) 与同种异体骨或异种骨移植相比较, 免疫排斥反应极小;与人工骨比较, BMG同时具有良好的生物相容性、生物降解性能, 在体内吸收被新骨所替代[16,19]。d) BMG可塑形, APBSC/BMG复合移植不仅在骨科, 还可广泛应用于颌面外科及整形外科。
3.2 异体骨的应用及内固定的选择
自体骨移植是临床常用的修复骨缺损的方法。自体骨移植无免疫排斥反应, 骨诱导作用好。若受床血供良好, 有健康的软组织覆盖, 则骨愈合快, 效果令人满意。但骨源有限, 并且会对供体造成新的缺损, 而且人工替代物尚不适用于大段骨移植[20]。同种异体骨移植已有百年历史, 近年骨库的发展使供体的选择、制备、灭菌和保存方法更加规范、严格。异体骨植骨量充足, 形态可按需选择。另外, 本组病例中我们采用了钢板、螺钉和牢固的绞锁髓内钉内固定, 这些固定对于早期的异体骨愈合能起到较好作用。
3.3 骨缺损长度的选择
课题组选择的病例骨缺损长度为6～12 cm, 因为骨缺损在6 cm以下可以通过截取自体髂骨填充缺损段达到较好骨愈合;对于12 cm以上的缺损, 血管化植骨优于游离植骨。所以两组病例我们都选择骨缺损长度为6～12 cm具有可比性[21]。
3.4 APBSC/BMG临床应用前景
APBSC/BMG具有诸多优点, 如APBSC/BMG复合移植对机体的创伤大大减少, 避免了传统手术中取自体骨给患者带来的巨大痛苦, 也可减少供区产生新的骨缺损等一系列并发症;此方法使治疗骨缺损的难度降低;APBSC/BMG免疫排斥反应小, 具有较好的生物相容性, 可在体内吸收被新骨所取代;与商品化的人工骨相比, APBSC/BMG所需费用不高;另外, BMG具有可塑性, APBSC/BMG也可广泛应用于整形外科等领域。因此APBSC/BMG复合移植具有广泛的临床应用前景。
3.5 并发症
复合基质 第5篇
1 材料与方法
1.1 主要材料与设备
新西兰兔由武汉大学实验动物中心提供;主要试剂有:PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物(购于BASF公司),小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)(购于Santa Cruz公司),FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体(购于Abcam公司),磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS),甲醇、丙酮、戊二醛,DMEM F12培养基,Dispase酶,Ⅱ型胶原酶,胎牛血清(fatal bovine serum,FBS),二甲基亚砜(DMSO)、MTT均购于Sigma公司。相差倒置显微镜(日本OLYM-PUS),恒温培养箱(日本Napco公司),超净操作工作台(北京半导体设备一厂),扫描电子显微镜(日本SANYO)。
1.2 方法
1.2.1 兔膀胱移行上皮细胞的原代培养及鉴定
选用4周龄新西兰兔,雌雄不限,体重2.0～2.5 kg,空气栓塞处死后,无菌条件下取膀胱前壁组织(2 cm×2 cm),小心分离膀胱黏膜与肌层,将黏膜层组织迅速置入含庆大霉素(20μg/mL)的PBS中浸泡并漂洗3次。将黏膜组织剪碎成1 mm2大小的组织块,转入新鲜配制的Dispase酶消化液中,于4℃下消化18 h后再用PBS洗涤1次,用不锈钢网滤去组织残块,收集细胞悬液于混合消化液(0.02%EDTA+0.25%胰酶)中。37℃振荡消化10 min,每2分钟吹打1次,直至成为单细胞悬液,加入FBS终止消化,PBS洗涤3遍,离心8 min(1000 r/min),弃上清,用培养液吹打混匀,再将细胞接种到含10%FBS的DMEM-F12培养基中,置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内常规培养。
将上述培养的细胞传2～4代后接种于盖玻片上再培养2 d,待细胞完全贴壁后,以PBS液冲洗,甲醇、丙酮固定10 min,以小鼠抗兔细胞角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)为一抗,以FITC标记羊抗小鼠单抗隆抗体为二抗,孵育、中性树胶封片,于490 nm的蓝色荧光倒置显微镜下观察。以PBS代替一抗作为空白对照。
1.2.2 ECM/TSH复合支架的构建
参考本小组前期研究[3]的方法制备TSH,使用前紫外线照射30 min备用。参照Yang等[4]报道的方法制备ECM,将成品分成32块(1 cm×1 cm),经冷冻干燥后,环氧乙烷消毒,干燥保存于4℃。在低温(4℃)真空环境下,将16块制备的ECM浸入TSH溶液中1 h,取出后经低温冷冻干燥机冻干,分装密封,经环氧乙烷消毒,常温干燥保存备用。
1.2.3 细胞相容性
实验分为四组,每组16孔,A组:ECM/TSH复合支架种植膀胱上皮细胞组;B组:单纯ECM种植膀胱上皮细胞组;C组:单纯培养膀胱上皮细胞组;D组:无细胞培养液组。种植细胞前先用培养液将支架材料预湿,取第3代膀胱上皮细胞悬液(浓度1×105/mL)50 L缓慢接种于材料上,4 h后再加入DMEM F12培养基(含FBS),置37℃恒温、5%CO2饱和湿度孵箱内培养,2 d后换液,倒置相差显微镜下观察细胞黏附、生长情况。
1.2.4 膀胱上皮细胞生长情况扫描电镜观察
膀胱上皮细胞与支架材料复合培养48 h后,A、B组各取一块材料/细胞复合物,经过PBS漂洗3次,3%戊二醛、2%的四氧化锇双重固定、脱水、醋酸异戊酯置换、干燥、喷金,扫描电镜观察。
1.2.5 细胞活力检测
膀胱上皮细胞接种后,分别于1、3、5和7 d每个时间点各取4孔,分别加入MTT(5 mg/mL),酶反应4 h,弃上清,加入150μL DMSO,震荡10 min,在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长读取吸光度(OD)值(A),计算细胞相对增值率(relative growth rate,RGR):RGR=[实验组(A组)A值-空白组(D组)A值]/[阴性对照组(C组)A值-空白组(D组)A值]×100%。
1.2.6 细胞计数
每5、10天从A、B两组中各取一块支架材料,用PBS清洗,去除未附着的细胞,再用0.25%胰酶消化,血球计数板进行细胞计数,观察细胞黏附数量及增殖情况。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养细胞形态
细胞接种时呈圆形,大小均一,轮廓清晰,胞浆透亮。接种24 h后,可见细胞贴壁生长,细胞密集生长区域可见细胞伸展后相互连接呈簇状,呈散在的簇片状分布,细胞间连接紧密,形态呈典型的“铺路石样”表现,符合上皮细胞特征。3 d后细胞进入对数生长期,7 d可连接成片,长满整个培养瓶底部。
免疫荧光检测,各代培养细胞角蛋白免疫荧光均为阳性,在蓝色荧光的照射下激发出绿色荧光,阳性率约99%。而空白对照组未激发出绿色荧光(图1),培养(12 h)的膀胱黏膜上皮细胞发出绿色荧光,细胞排列呈典型的“铺路石样”表现。
2.2 组织学检查
2.2.1 种植细胞前后的复合支架材料
倒置相差显微镜下观察:ECM为网状结构,HE染色后可见红染的胶原纤维规则排布,纤维较细,网孔较大,未见到细胞碎片;复合TSH后胶原直径变粗,网孔孔径变小。种植膀胱上皮细胞后4 h,光镜下可见细胞紧密黏附于材料表面,少数散落到培养瓶底贴壁生长。加入培养基10 h,可见细胞已伸展,有多个突起。培养3 d时,黏附于材料的细胞数量增加,细胞增殖明显。
2.2.2 扫描电镜观察
种植细胞前复合支架材料于扫描电镜下观察可见基质材料由许多连接成网状的纤维组成,纤维间呈现1～8μm的微孔,凝胶分子覆盖其上,没有发现细胞碎片。种植后可见发育良好的细胞和细胞群黏附于材料上,伪足沿纤维伸展,附着较牢固,细胞间连接紧密,有的可见到ECM的分泌(图2),可见ECM复合TSH后,胶原直径变粗,交织成网。发育良好的细胞黏附于材料上,开始沿纤维伸展伪足,表面可见到ECM的分泌。
2.2.3 细胞活力测定
膀胱上皮细胞在单纯ECM上黏附性良好,黏附率为83.5%(24 h ODB组/ODC组),复合了TSH后的ECM表面黏附能力较之增强,黏附率为92.3%(24 h ODA组/ODC组)。从表1中数据可以得出A、C两组的细胞数量高于B组(P=0.004),而且,A、C两组间细胞黏附数量的差异亦有统计学意义(P=0.027),三组的细胞倍增时间均为3 d。7 d时,A组细胞数量明显高于B、C组,组间差异有高度统计学意义(P=0.006),B、C组间P=0.041。
3 讨论
组织工程学是综合应用工程学和细胞生物学的原理,将体外培养扩增后的种子细胞与可降解的生物支架材料相复合,再将其回植体内缺损部位,从而再生成具有正常结构和功能的组织,达到真正意义上的生物学修复[5,6]。材料的生物相容性检测是该领域不可缺少的重要组成部分,理想的组织工程支架材料应当具有良好的细胞相容性、能够促进细胞增殖和组织形态的形成,为此本小组做了系列研究[7,8]。
与笔者前期研究结果相似,本实验中ECM/TSH复合材料比单纯ECM,纤维直径变粗,网孔孔径变小,与接种细胞的接触面积增大。经TSH修饰以后的ECM对细胞表现出更强的黏附性,为细胞的附着、生长、增殖提供了良好的微环境。超微结构观察显示,植入的膀胱上皮细胞能够紧密地附着于ECM胶原纤维之上,细胞之间形成紧密联结,周围可观察到ECM的分泌。MTT检测结果表明膀胱上皮细胞易于在ECM/TSH复合支架材料上生长,增殖情况较好,符合膀胱黏膜上皮细胞的生长规律,细胞未见凋亡和分化,实验结果提示ECM/TSH复合支架材料与膀胱黏膜上皮细胞具有良好的生物相容性,为下一步应用于体内研究提供了实验依据。
参考文献
[1]Feng C,Xu YM,Fu Q,et al.Evaluation of the biocompatibility andmechanical properties of naturally derived and synthetic scaffolds forurethral reconstruction[J].J Biomed Mater Res A,2010,94(1):317-325.
[2]Chiappetta DA,Sosnik A.Poly(ethylene oxide)-poly(propyleneoxide)block copolymer micelles as drug delivery agents:improvedhydrosolubility,stability and bioavailability ofdrugs[J].Eur J PharmBiopharm,2007,66(3):303-317.
[3]Yao Y,Yang SX,Zhang C,et al.Biocompatibility of compounds ofextracellular matrix and thermally reversible hydrogel[J].Journal ofWuhan University of Technology Material Science Edition,2007,22(3):439-442.
[4]Yang SX,Yao Y,Hu YF,et al.Reconstruction of rabbit urethra us-ing urethral extracellular matrix[J].Chin Med J(Engl),2004,117(12):1786-1790.
[5]Engelhardt EM,Micol LA,Houis S,et al.A collagen-poly(lacticacid-co-varepsilon-caprolactone)hybrid scaffold for bladder tissueregeneration[J].Biomaterials,2011,32(16):3969-3976.
[6]Falke G,Caffaratti J,Atala A.Tissue engineering of the bladder[J].World J Urol,2000,18(1):36-43.
[7]Yang SX,Shen FJ,Hu YF,et al.Experimental bladder defect inrabbit repaired with homologous bladderextracellular matrix graft[J].Chin Med J(Engl),2005,118(11):957-960.
复合基质 第6篇
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM培养基(GibCo), 胎牛血清(HyClone),淋巴细胞分离液(国产),胰蛋白酶(Sigma),β-甘油磷酸钠,L-抗坏血酸,维生素C及地塞米松(Sigma),台式离心机,超净工作台,二氧化碳恒温培养箱(Compa,美国),相差倒置显微镜(Olympus)。纯钛种植体(第四军医大学口腔医学院刘宝林教授提供)。
lipofectamine 2000(Invitrogen公司),人真核表达载体pVAX1- bFGF为本室构建。多孔矿化Bio- Oss胶原骨块材料(欧斯海斯公司提供)。
杂种犬8只,雌雄不限,10~12 月龄,体重20~25 kg(哈尔滨医科大学动物实验中心)。
1.2 方法
1.2.1 取材
以30 g/L戊巴比妥钠盐溶液(1 ml/kg)注射犬的臀肌内,麻醉起效后,常规处置后,以穿刺针于大转子下股骨粗隆部穿入骨髓腔,骨穿针穿入后,套上20 ml注射器抽取骨髓(注射器内预先吸入250 U肝素进行抗凝)。于室温下30 min内进行提取细胞,将骨髓液与淋巴细胞分离液以1∶1混合,高速2 000 r/min离心20 min后,低速1 000 r/min离心10 min,吸取骨髓细胞悬液。
1.2.2 细胞培养及人bFGF基因转染
将细胞悬液等量接种于无菌培养瓶中,立即加入含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液,37 ℃,95%湿度,50 ml/L二氧化碳的培养箱中培养,密切观察,每3 d换液1 次。待培养箱中细胞生长至80%~90%时,在超净工作台内以2.5 g/L胰蛋白酶消化液消化细胞,2~3 min后,按1传3的比例传代接种于新培养瓶进行培养。传代后的BMSC增殖迅速,取第3代骨髓基质细胞,采用脂质体转染技术[1]将重组质粒pVAX1- bFGF转入BMSC。
1.2.3 细胞定向诱导分化
转染重组质粒pVAX1- bFGF的犬骨髓基质细胞的实验组及未转染的犬骨髓基质细胞对照组,均用含有1 nmol/L β- 甘油磷酸钠,50 μg/L L- 抗坏血酸,10 nmol/L地塞米松,100 ml/L胎牛血清的DMEM矿化培养液进行培养,使犬骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化。于2 周后用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集细胞,计数,离心,调整细胞密度使其达到5107/ml。
1.2.4 多孔矿化Bio-
Oss胶原骨块的预处理及组织工程骨移植复合体的制备 将5107/ml细胞悬液与凝胶混匀,并用注射器滴入多孔Bio- Oss胶原骨块,确保多孔支架材料被细胞悬液浸匀,且不渗透。静置于37 ℃,50 ml/L的CO2培养箱中温育4~6 h,加入DMEM成骨条件培养液培养。
1.2.5 组织工程骨预构复合体+种植体修复犬颌骨极限骨缺损
杂种犬8 只,按植入物不同分为2 组,每组4 只:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组;(2)种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组。肌注30 g/L戊巴比妥钠盐溶液(1 ml/kg),麻醉起效后,碘伏3 遍口周消毒,铺孔巾。在口腔前庭一侧下颌前牙区,沿牙龈缘切口达骨面,分离下颌骨唇颊侧黏骨膜,拔除2 颗下颌前牙,用锋利的骨钻制成3 cm2 cm1 cm的全层骨缺损。将种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料复合骨块或种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原复合骨块修整后分别植入充填骨缺损处,然后将黏骨膜严密缝合。同法完成对侧下颌骨前牙拔除及3 cm2 cm1 cm的全层极限骨缺损模型制备,植入材料与对侧相反。犬放回笼内,术后流食1 周,以后常规饲养。隔日起每日肌注青霉素80 万U(2 次/d5 d)。于术后24 周后处死动物。
1.3 观察及检测方法
1.3.1 大体观察
实验动物术后24 周时处死,去除下颌骨周围软组织后缺损修复区行大体观察:骨缺损修复程度、骨痂生长情况。
1.3.2 放射线观察
实验动物术后24 周处死,将每个下颌骨从正中联合处断开,分为左右两侧下颌骨(每个下颌骨有2 个骨缺损修复区)。去除周围软组织,拍下颌骨侧位X线片。投射条件为50 kV,50 mA,0.3 s,投射距离为90 cm,了解复合材料成骨及种植体与组织工程骨骨结合程度。
1.3.3 组织学观察
实验动物术后24 周处死,去除周围软组织,下颌骨缺损修复区分别行HE法染色、Mayer苏木精改良染色、Masson三色法染色及甲苯胺蓝法染色,光镜下观察新骨形成。
2 结 果
2.1 实验动物一般情况
所有实验动物中除1 只因术后1 个月被其他犬咬伤致死并及时补充外,其余犬均存活。术后2~6 h苏醒,并能站立进食。术后1 只犬的2 个术区切口出现感染,支架材料及种植体外露而排除实验。其余犬术区切口均未出现感染及支架材料、种植体外露。
2.2 实验动物大体观察
2.2.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 犬下颌骨缺损区有大量稍白的骨痂形成,缺损区基本由新生骨所修复,修复区与正常骨组织之间无明显界限。缺损区骨皮质与正常骨端连续,骨面稍不平,稍厚于周围正常组织,硬度均匀,塑形基本完全,钳夹硬度与周边骨质相似,钳夹无动度,未见种植体暴露。
2.2.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 犬下颌骨缺损区由成熟的骨痂形成,缺损区骨面较光滑,与周围正常骨组织厚度相近,钳夹无动度。缺损区骨皮质与正常骨端连续,无明显界限,修复区骨组织较硬与正常骨组织相近,未见种植体暴露。
2.3 X线观察
2.3.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 新生骨呈片状阻射影像,基本占据缺损区,密度不均匀,与周围正常骨组织界限模糊,种植体与周围骨组织基本形成骨结合。
2.3.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 骨缺损区基本由新生骨所修复,骨密度和周围正常骨组织相近。骨小梁形成,并塑形良好,与周围正常骨组织界限不清,与种植体骨结合良好(图 1)。
A: 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组; B: 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组
2.4 组织学观察
2.4.1 颌骨缺损种植修复区24 周时HE染色观察
2.4.1.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区基本上由新生的骨组织所修复,形成了较成熟的板层骨。骨小梁形成及改建良好,形成了骨髓腔。较大的骨髓腔内有较疏松结缔组织和毛细血管形成,支架材料很少(图 2A)。
2.4.1.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区全部由新生的骨组织所修复,形成了很成熟的板层骨。骨小梁形成及改建良好,形成了骨髓腔,可见丰富的新生的毛细血管(图 2B)。
A: 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组;B: 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组
2.4.2 颌骨缺损种植修复区24 周时Mayer苏木精改良染色法观察
2.4.2.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区基本上由新生的骨组织所修复,形成了较成熟的板层骨。骨小梁形成,形成了骨髓腔(图 3 A1);有的区域骨细胞形态处于成熟与未成熟之间,表明新骨形成还在进行(图 3A2)。
2.4.2.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区全部由新生的骨组织所修复,形成了很成熟的板层骨。骨小梁粗大致密,形成了骨髓腔,结缔组织少,可见丰富的新生的毛细血管(图 3B1);骨细胞形态很成熟(图3 B2)。
2.4.3 颌骨缺损种植修复区24 周时Masson三色法染色观察
2.4.3.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区基本上由新生的骨组织所修复,形成了较成熟的板层骨及骨髓腔。
2.4.3.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区全部由新生的骨组织所修复,形成了很成熟的板层骨。骨小梁比上组粗大致密,支架材料甚少,毛细血管丰富(图 4)。
A: 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组(A140, A220);B: 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组(B140, B220)
A: 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组;B: 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组(20)
2.4.4 颌骨缺损种植修复区24 周时甲苯胺蓝染色结果
2.4.4.1 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区基本上由新生的骨组织所修复,形成了较成熟的板层骨。骨小梁形成及改建良好,有散在的毛细血管。
2.4.4.2 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-
Oss胶原材料组 缺损修复区全部由新生的骨组织所修复,形成了很成熟的板层骨。骨小梁粗大致密,形成了骨髓腔,结缔组织少,可见丰富的新生的毛细血管。支架材料基本吸收,剩余甚少,呈细小片状,有的由于切片时脱落形成空隙(图 5)。
A: 种植体+犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组;B: 种植体+bFGF基因转染犬BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料组(20)
3 讨 论
组织工程技术近年来取得了巨大的发展,被认为是未来修复组织和器官最有效的方法之一[2],也为颌骨缺损的修复带来了希望。在天然骨衍生支架材料中,天然珊瑚和煅烧骨具有高孔隙率,分布良好的孔道结构。陈富林等[3]将体外培养的成骨细胞接种于珊瑚中,成功地在异位再造出板层骨。但天然珊瑚质地较脆,机械性能难以达到起支撑作用骨修复材料的要求,在其中复合如胶原、聚乳酸等具活性诱导性能的材料,则可改进这两种材料的力学性能和表面性能。脱钙骨中的无机钙盐主要为羟基磷灰石[Ca5(OH)(PO4)3],另有少量碳酸钙和柠檬酸钙。Wang等[4]用大鼠脱钙骨基质对颅骨损伤进行修复,植入21 d后脱钙骨基质被新生骨取代,骨微粒体酪蛋白激酶Ⅱ、骨连接素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶均表达正常。完全脱钙骨的成骨诱导活性虽好,但天然骨中的无机羟基磷灰石晶体容易遭破坏,难以满足骨组织工程对支架材料的力学要求。脱蛋白骨与所有支架材料相比,天然骨的来源最为广泛[5]。骨质结构有得天独厚的优势,其机械性能与人骨最为接近,因此在生物相容性、骨生成引导、诱导性能方面比较突出。作为修复骨缺损的填充材料,如能选择性的脱除天然骨中引起植入体强烈免疫反应的非胶原蛋白,保留其中的胶原纤维,便可使骨衍生材料具有良好的机械性能和弱的免疫原性[6]。这种材料的提取物中有生长因子存在而具骨诱导潜力。
BMSC+Bio- Oss胶原材料组成的复合生物支架材料的生物相容性:生物材料植入机体后,都将与机体组织发生相互作用,从而引起一系列生物学反应,没有绝对惰性的材料存在。所以目前对于生物相容性公认的说法包括材料与机体间适应的反应。本实验所用材料Bio- Oss骨块主要成分是小牛的脱蛋白骨,其特有的空隙非常类似于人松质骨结构,Bio- Oss骨粉已经被大量的临床和基础实验证实具用良好的生物相容性,能与宿主骨形成理想的骨性结合。所以该复合人工骨不仅在成分上,而且在结构上都与机体骨一致,合乎生理要求[7]。在本实验中,实验组与对照组在植入材料的周围均未发现明显的炎性细胞浸润,材料与新骨组织结合紧密,成骨迅速,未见形成纤维组织包裹。并且种植体能够与组织工程骨基本形成骨结合,也进一步证明了Bio- Oss胶原骨块复合bFGF修饰的BMSC(或未修饰的BMSC)具有良好的生物相容性。
bFGF基因转染 BMSC+Bio- Oss胶原复合材料的骨诱导活性:bFGF被认为是FGF家族中骨诱导活性很高的生长因子,单纯应用时可诱导软骨和骨的形成,但单纯植入体内极易分解,无法持续发挥诱导活性。本实验首次采用了Bio- Oss胶原骨块作为bFGF- BMSC复合载体用于骨缺损修复的研究,通过X线分析及组织学观察结果发现:实验组材料区的成骨活性明显较对照组活跃,其新骨的形成在数量及质量上均高于对照组。可以证明:实验组由于bFGF有效存在而具有更好的骨诱导活性[8]。
种植体+bFGF基因转染BMSC+凝胶+Bio- Oss胶原材料修复颌骨缺损可能性:颌面骨缺损的修复和再造是目前骨组织工程研究的重点,但是颌面骨缺损的修复不仅是形态方面的修复,而且还要提高患者的咀嚼功能。但是国内外对于种植体与组织工程骨骨结合方面的研究甚少。本实验首次将种植体与转基因的组织工程骨相结合修复颌骨缺损,通过实验研究发现:种植体+Bio- Oss胶原复合bFGF基因转染的犬BMSC(或未转染BMSC)都能够良好地修复颌骨缺损,并能够使种植体与组织工程骨形成良好的骨结合。所以用组织工程方法进行颌面部骨缺损修复时,可同期植入种植体,以尽早恢复患者的咀嚼功能。
临床上一般采用延期种植方法,疗程较长。即刻种植可以缩短疗程,减少患者缺牙的痛苦。即刻种植由于种植体会与牙槽窝之间产生一定间隙,容易使软组织长入,影响种植体的骨结合。现临床通常采用自体骨+Bio- Oss骨粉,配合诱导骨再生膜的方法,获得了良好的临床效果。通过本实验研究发现:由于在整个缺损区有大量骨髓基质细胞转化为富有活性的成骨细胞,新骨形成密集、相互连接;局部可见板层骨及骨髓腔形成,及排列成行的成骨细胞,抑制了纤维组织增生,为即刻种植骨缺损的修复提供了新的方法,也是口腔种植医生进一步研究的课题。
参考文献
[1]李春明,杨春艳,刘宝林,等.人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达[J].第四军医大学学报,2005,26(10):871-873.
[2]Ferber D.Lab-grown organs begin to take shape[J].Sci-ence,1999,284(5413):422-425.
[3]陈富林,毛天球.培养成骨细胞接种天然珊瑚中再造骨组织的研究[J].实用口腔医学杂志,1999,15(5):386-390.
[4]Wang J,Glimcher MJ,Mah J,et al.Expression of bonemicrosomal casein kinase II,bone sialoprotein,and os-teopontin during the repair of calvarial defects[J].Bone,1998,22(6):621-628.
[5]马威,刘宝林,李德华,等.表面陶瓷化钛种植体与骨组织结合的界面表征及机制探讨[J].实用口腔医学杂志,2008,1(16):17-20.
[6]杨立华,王远亮,何创龙,等.天然骨衍生支架材料的应用[M].北京生物医学工程,2004,23(2):155-157.
[7]Stephan EB,Jiang D,Lynch S,et al.Anorganic bovine bonesupports osteoblastic cell attachment and proliferation[J].JPeriodontol,1999,70(4):364-369.
