表达和纯化范文（精选10篇）
表达和纯化 第1篇
MuSK是一种与乙酰胆碱受体相关的跨膜蛋白,在骨骼肌的发展中,MuSK是建立突触后膜时组建主要突触骨架的首要要求[1],重症肌无力( myasthenia gravis,MG) 是一种由自身抗体引起的、累及神经肌肉接头( NMJ) 处的自身免疫性疾病[2],肌肉特异性激酶抗体(MuSKAb)在重症肌无力中的起病和病情发展中起着很重要的作用[3],国内关于MuSKAb在MG中的作用研究之前多是通过提取人类患者的血清作进行研究分析,但其作用机制和临床表现特点至今商未完全明确。现在研究人员采用将MuSK蛋白注入健康小鼠体的方法,进而确定MuSKAb在MG中的作用。本实验通过分子克隆技术,采用大肠杆菌原核表达系统获得较纯的MuSK蛋白,为重症肌无力的研究提供可靠的实验材料,此方法国内尚无类似报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
肌肉特异性激酶MuSK基因由上海博尚生物技术有限公司基因部合成;大肠杆菌表达载体pQE30、表达宿主菌M15菌株由广西科学院生物中心实验室提供。
1.1.2 试剂:
限制性内切酶、连接酶、rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、Protein Marker购于Fermentas公司;胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购于TIANGEN公司;MuSK Elisa试剂盒购于上海裕平生物科技有限公司;引物合成、测序由Sangon公司完成;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器:
核酸蛋白分析仪购自Beckman Countlter公司;台式微量离心机购自Microfuge公司;蛋白电泳仪购自Bio-Rad公司;PCR仪购自Biometra;多功能酶标仪购自瑞士Infinite公司;恒温水浴锅购自英国Grant公司;恒温摇床购自上海苏坤公司。
1.1.4 培养基:
LB培养基,氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素工作浓度均为100μg/mL;SOC培养基。
1.2 方法
1.2.1 MuSK 基因的合成和克隆
从基因文库中获取编号为AY360453的分泌型表达小鼠肌肉特异性激酶的mRNA[1],取其46～1440位的核苷酸编码序列进行优化合成。以合成的DNA作为PCR模板,上游引物为5’-GATCGGATCCCGTGAATTAGTAAACATTCC-3’,下游引物为5’-ATGGGTACCTTACTTGTCATCGTCATCAGAACC-3’,分别引入BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点。PCR反应条件:95℃预变性4min,94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸2min,进行30个循环,72℃延伸6min。
1.2.2 重组质粒的构建和转化
PCR扩增得到的1.4kb条带胶回收并用内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切,载体pQE30同样用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切,回收大的片段。然后用T4 DNA连接酶连接载体和目的片段,得到重组质粒pQE30-MuSK,以其转化大肠杆菌M15感受态细胞中(感受态细胞的制作和转化方法参考文献[4])。利用LB氨苄青霉素卡那霉素平板筛选重组转化子,挑取转化子做菌落PCR,对有目的条带的转化子菌落提取重组质粒用内切酶酶切进一步鉴定,并送上海生工生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 MuSK基因的诱导表达
从过夜培养的平板上挑取重组子单菌落接入5mL含氨苄和卡那霉素的 LB培养基中,37℃、220r/min摇床培养8～10h,以 1%的接种量接种到5mL含氨苄和卡那霉素的LB培养基中继续培养4～6 h,再以2%的接种量接种到100mL含氨苄和卡那霉素的LB 培养基中,培养至OD600=0.6 左右,然后分别加入终浓度为0mmol/L、0.3mmol/L的IPTG诱导表达,并补加Amp终浓度为100μg/mL,30℃、180r/min摇床培养过夜。
1.2.4 表达产物的分析和纯化
取诱导表达后的菌悬液适量,12 000r/min离心3min,去上清,加入2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液,沸水浴处理5～10min,12 000r/min离心5min。将培养液上清和细胞裂解物于浓度为12%的SDS-PAGE凝胶进行凝胶电泳分析。
所得培养液在4℃、6 000r/min下离心10min,去上清。用80mL的Napi buffer(50mmol/L,pH 8.0)重悬菌体,超声破碎30min,4℃、12 000r/min离心15min,去上清。用40ml的上样缓冲液(8mol/L Urea、20mmol/L imidazole、500mmol/L NaCl、50mmol/L Napi pH 8.0)溶解沉淀,4℃、12 000r/min离心15min,取蛋白上清液过镍柱。用50mmol/L Napi(pH 8.0)+不同浓度的尿素(依次为6、4、3、2、1、0mol/L )分别洗脱,然后再用500mmol/L咪唑+50mmol/L Napi(pH:8.0)的缓冲液完全洗脱,取含第二个柱体积的蛋白液蛋白液进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳分析。
1.2.5 纯化后目的蛋白的含量测定
按MuSK Elisa试剂盒说明书在酶标包被板上设标准孔和待测样品孔,分别按要求加入所对应的样品(MuSK标准品/纯化后的蛋白液)和试剂,反应完成后,用酶标仪在450nm波长下依序测量各孔的吸光度(OD值)。以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数,既得蛋白液中目的蛋白的含量。
2 结果与分析
2.1 重组质粒pQE30-MuSK的鉴定
以重组质粒为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳的结果显示PCR产物条带与设计的长度(1.4 kb)相一致(图1)。重组质粒经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定,显示2条DNA片段,分别为约3.4 kb的pQE30空载体和1.4 kb的MuSK基因,同预期的结果相符(图2)。测序结果显示,此片段的序列与设计的基因序列完全一致,且阅读框正确。
M:DL2000 Marker;1:PCR product.
M:λDNA/HindⅢ Marker;2:pQE30-MuSKdigested by /BamHⅠ/KpnⅠ.
2.2 MuSK基因在大肠杆菌中诱导表达的鉴定和纯化
SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,加入终浓度为0.3mmol/L IPTG诱导的细胞裂解物在相对分子质量约为48kDa处有一表达蛋白条带,而未加诱导物的的转化菌株的细胞裂解物则没有此条带(图3-A)。培养液的上清中也未检测到对应大小的条带,由此可知表达产物以包涵体的形式存在。过镍柱纯化后的目的蛋白在分子量48kDa处有单一条带(图3-B)。
2.3 纯化后MuSK蛋白的含量
过镍柱纯化后的目的蛋白用MuSK酶联免疫分析试剂盒进行反应后,测得各孔在450nm波长下的OD值(表1),以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,得出的标准曲线公式为:y=0.5326x-0.1168,R2=0.9813(根据试剂盒说明书上标明:样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上即可);带入样品OD值求得对应浓度,再乘以稀释倍数,得到纯化后蛋白液中MuSK蛋白的平均浓度约为8.2 pmol/L。
A.M:protein molecular weight marker;1:uninduced bacteria;2-3:bactteria induced by 0.3mmol/L IPTG.B.M:protein molecular weight marker;4-5:purified MuSK protein.
3 讨论
重症肌无力是一种由自身的乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)引起的疾病,但近年来的研究发现在一些重症肌无力患者的体内并没有发现AchRAb,这种现象被称为血清阴性重症肌无力 (Seronegative MG,SNMG)[5],而在这些SNMG患者中,有一部分人体内含有另外一种抗体——肌肉特异性激酶抗体。MuSKAb阳性SNMG患者和AChRAb 阳性患者的临床特点有着明显的区别[6],专家研究得出MuSKAb在SNMG中致病的原因[7]:一是可能通过影响AchR的功能,二是可能通过Lrp4阻断了自身的信号传递通路。这里用了可能二字也就是说MuSKAb的致病机理至今尚未完全明确,且由于MuSKAb并不是存在于所有的SNMG患者体内,国内外的临床研究结果有着很大的差异,国内SNMG患者中MuSKAb阳性率明显较之国外要低,因此,关于MuSKAb在重症肌无力中作用的还需要专家学者们的进一步研究。
本实验选用真核小鼠MuSK基因,为了在原核表达系统大肠杆菌M15中有效表达,在不改变氨基酸序列的前提下,将其碱基序列改为大肠杆菌M15的偏好密码子,避免了由于稀有密码子造成的表达限制,从而提高表达效率。在大肠杆菌M15菌株中,重组质粒经过IPTG诱导后表达的目的蛋白以包涵体形式出现,通常情况下表达量越高越易形成包涵体,通过降低诱导培养温度和延长诱导时间可以尽量减少包涵体的形成。使用pQE30载体表达的目的蛋白上带有6个组氨酸标签,用高浓度尿素溶解包涵体使蛋白变性,再经过镍柱纯化,用不同浓度的尿素梯度复性洗脱,最终得到纯度较高的目的蛋白。
MuSK是存在于哺乳动物体内的一种抗原蛋白,目前关于MuSKAb在重症肌无力中的作用仍是国际上研究的热点之一,该研究对MuSK蛋白有着一定的需求量,因此本实验通过分子克隆技术利用微生物大量获取较纯MuSK蛋白有着良好的研究前景。
参考文献
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表达和纯化 第2篇
sTNFR Ⅱ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测
可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)和血管活性肠肽(VIP)对类风湿性关节炎(RA)均有治疗作用,但两者的作用机制不同.制备两者融合蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的`作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达.表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其抑制TNF细胞毒及肝细胞膜特异性脂蛋白(Lsp)诱导的细胞毒生物活性.结果显示构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内以包涵体形式表达,疏水层析结合离子交换层析纯化后,融合蛋白具有较好的抑制炎症分子诱导的炎症反应生物活性,为将来应用打下基础.
作 者：王虹 曾位森 陈金华 王珊珊 刘丹 杨艳妮 陈百宏 李玲 WANG Hong ZENG Wei-sen CHEN Jin-hua WANG Shan-shan LIU Dan YANG Yan-ni CHEN Bai-hong Li Ling 作者单位：广州蓝星生物科技开发有限公司,广州,510663刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：200626(5)分类号：Q78关键词：sTNFRⅡ VIP 融合蛋白 表达 纯化
表达和纯化 第3篇
关键词 水稻 ；白叶枯病 ；xa5 ；原核表达 ；蛋白纯化 ；western-blotting
分类号 S511
Abstract Rice is an economically important crop， the output of rice is closely related to the factors such as plant diseases and insect pests. Bacterial blight （BB） caused by Xanthomonas oryzae pv. Oryzae （Xoo） is one of three most destructive diseases in rice which cased output reduce. The cultivation of varieties with high resistance is considered as the most effective and economical option to control this disease. xa5 recessive resistance gene is an important rice bacterial leaf blight resistance genes. In this study， we construct prokaryotic expression vector（PGEX-4T-1-Xa5 and PGEX-4T-1-xa5）， and translate it into BL21， then 0.2 mmol/L IPTG， 28℃， 4 h induced dominant Xa5 and recessive xa5 protein expression. Then in combination with western-blotting analysis， show that the expression of protein is a GST fusion protein and purification of the protein， These results laid a foundation for elucidating characteristic and function of xa5.
Keywords rice ； bacterial blight ； xa5 ； prokaryotic expression ； protein purification ； western-blotting
水稻是重要的粮食作物，全世界约1/2的人口以它为主要粮食[1]。水稻的产量高低与病虫害等因素密切相关，水稻白叶枯病就是导致水稻产量减少的主要病害之一，白叶枯病发病时一般可造成水稻减产20%～30%，严重时会达到50%，甚至绝收[2]。控制白叶枯病最安全、经济有效的方法就是培育抗病品种，抗性基因的发掘与克隆是培育抗病品种的基础，因此对水稻白叶枯病抗性基因的研究一直是水稻白叶枯病研究的重点。截至2013年3月，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个[3]。已被定位的抗性基因有26个，并且Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa23、Xa26、Xa27 共7个基因已成功克隆[4]。
在已经发现的38个白叶枯病抗性基因中，有12个是隐性抗病基因，可见隐性抗病基因在白叶枯病抗性资源中起着重要作用。据报道，白叶枯病抗性基因xa5是具有重要研究价值和育种价值的一类新型的隐性抗病基因[5]，目前的研究结果表明，xa5基因定位在第5 号染色体上[6]；该基因的cDNA全长为906 bp，包含3个外显子，编码1个由106 个氨基酸组成的蛋白产物，且该蛋白产物是一个转录因子ⅡA的γ亚基（TFⅡAγ）[7-8]。xa5基因与已知抗病基因具有不同的结构，前期的研究结果已经明确了显性Xa5和隐性xa5开放阅读框（Open reading frame，ORF）区有2个碱基的差异是导致抗、感差异的功能突变位点[8-9]，xa5在抗病品种IRBB5和感病品种日本晴中有2个碱基的差异，导致IRBB5中的第39位的缬氨酸在日本晴及IR24中变成谷氨酸，该氨基酸位点位于蛋白质三维结构的表面，可能与蛋白质之间的相互作用有关。后期Gu等[10]的研究结果发现，基因可影响显性抗病基因Xa27的抗病性xa5，但目前对xa5基因的抗病机制知之甚少，在蛋白水平对xa5基因的研究报道也很少。鉴于此，本研究试图表达xa5基因的原核表达蛋白，进而在蛋白水平对xa5基因的抗病机制进行阐释，此研究将为其他隐性抗病基因机制的研究提供参考与模板，同时有助于生产上更好利用xa5基因培育抗病品种。
大肠杆菌表达系统是目前广泛应用的一种基因表达系统，它具有遗传背景清楚、基因操作方便、表达水平高及试验成本低等优点[11]。因此，利用原核表达对基因进行分析已经成为实验室中不可或缺的一种方法[12]。本研究成功构建了显性Xa5基因的原核表达载体PGEX-4T-1-Xa5和隐性xa5基因的原核表达载体PGEX-4T-1-xa5，通过转化大肠杆菌BL21，0.2 mmol/L的IPTG诱导表达特异蛋白，并利用western-blotting分析确定，最后利用GST标签纯化原核表达蛋白，为后期进一步研究xa5基因的功能奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
原核表达载体PGEX-4T-1及大肠杆菌BL21由本实验室保存；大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司；异丙基-β-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）购自中科瑞泰公司；Pyrobest DNA聚合酶和DNA Marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、蛋白markers、GST亲和层析柱及谷胱甘肽还原酶购自Fermentas 公司；抗GST标签鼠单克隆抗体和GST-羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物公司。引物合成和测序委托上海生物工程技术服务有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 显性基因Xa5和隐性基因xa5的PCR扩增及测序
以携有显性Xa5的日本晴植株的cDNA和携有隐性xa5的IRBB5水稻植株的cDNA为模板，以pex-xa5-F-EcoRI（5′GAATTCATGGCCACCTTCGAGCTCTAC′3）和pex-xa5-R-XhoI（5′CTCGAGTTATTGGCTGAGTAGTTTGG′3）为引物，PCR扩增pex-Xa5的基因片段（命名为pex-Xa5）和pex-xa5的基因片段（命名为pex-xa5）。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，扩增产物回收连接到PMD-18T载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送测序公司测序。
1.2.2 PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5原核表达载体的构建
将上述测序正确的阳性克隆的质粒用EcoRI和XhoI双酶切，回收目的基因片段，与同样经过EcoRI和XhoI双酶切的原核表达载体PGEX-4T-1用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，在含100 μg/mL的氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上生长，筛选阳性克隆，提取质粒，双酶切鉴定，最后送公司测序。
1.2.3 PGEX-4T-1-Xa5 和PGEX-4T-1-xa5诱导表达及可溶性分析
将上述测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆菌斑，于含有100 μg/mL的氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基中37℃培养过夜，按照1∶100的比例取菌液至新鲜的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4左右时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，28℃诱导表达4 h，收集菌体。用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）洗涤沉淀2次后重悬菌体，冰上用30%超声强度破碎5 s，间隔5 s处理样品10 min。4℃，12 000 r/min 离心10 min， 分离上清和沉淀。取超声波处理后的上清和沉淀样品各10 μL，对其进行SDS-PAGE电泳分析。
1.2.4 融合蛋白PGEX-4T-1-Xa5 和PGEX-4T-1-xa5的western-blotting分析
将融合蛋白上清及空载体表达上清进行SDS-PAGE电泳，利用电压转膜法，将蛋白转移到醋酸纤维薄膜（PVDF膜）上，转膜结束后，取出PVDF膜在TBS中漂洗5 min。接着将PVDF膜移至5%脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，室温慢摇。弃封闭液，TBST洗膜3次。分别用一抗（GST-tag）、二抗（羊抗鼠IgG）室温轻摇，封闭孵育1 h，按武汉博士德试剂公司要求配制显色剂，均匀滴加到PVDF膜上，曝光拍照[13]。
1.2.5 融合蛋白PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5的纯化
根据GE公司GST Fusion Protein Spin Purification Kit说明书标准进行改进。取融合蛋白上清10 mL，同时加入100 μL谷胱甘肽层析柱，在混合器上4℃混合2 h。500 r/min，4℃，离心2 min，弃上清，加2 mL PBS洗3次，最后加1 mL PBS混匀，转移到1.5 mL离心管中，500 r/min，离心1 min，弃上清。加500 μL谷胱甘肽还原酶（浓度为50 mmol/L），混合器上，4℃混合0.5 h，4℃ 500 r/min离心2 min，取上清到1.5 mL离心管中，上清即为纯化后的蛋白。取10 μL上样缓冲液+10 μL上清，对其进行SDS-PAGE跑胶检测。
2 结果与分析
2.1 显性基因Xa5和隐性基因xa5的扩增
以携有显性基因Xa5的日本晴植株的cDNA和携有隐性基因xa5的IRBB5水稻植株的cDNA为模板，以pex-xa5-F-EcoRI和pex-xa5-R-XhoI为引物，PCR扩增pex-xa5的基因片段（命名为pex-xa5）和pex-Xa5的基因片段（命名为pex-Xa5），结果得到330 bp的目的片段（图1、2）。
2.2 原核表达载体PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5的构建
将上述PCR扩增得到的基因片段进行胶回收，并连接PMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，最后送公司测序，将测序正确的菌株摇菌并提取质粒。用EcoRI和XhoI双酶切的结果见图3-A，回收目的片段；接着与经过同样2种酶酶切回收之后的原核表达载体PGEX-4T-1连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆摇菌并提取质粒；然后双酶切鉴定（图3-B），结果获得330 bp的目的片段，说明目的基因已经插入到了PGEX-4T-1表达载体中；最后将阳性克隆的菌株送公司测序，测序结果表明插入基因未发生突变或移码，说明原核表达载体PGEX-4T-1-Xa5和PGEX-4T-1-xa5构建成功。
2.3 目的蛋白的诱导表达
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将构建成功的重组质粒PGEX-4T-1-pex-xa5、PGEX-4T-1-pex-Xa5及PGEX-4T-1空载体转化大肠杆菌表达菌株BL21中，挑取单克隆菌落用0.2 mmol/L的IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析（图4）。结果发现，相对于对照而言，被诱导的PGEX-4T-1-pex-xa5和PGEX-4T-1-pex-Xa5中表达了30 ku左右的特异的融合目的蛋白，PGEX-4T-1空载体表达了其特有的26 ku左右的GST标签蛋白，且都在上清中大量存在，说明表达的原核蛋白是可溶的。
2.4 western-blotting分析
将上述诱导表达的PGEX-4T-1-pex-xa5、PGEX-4T-1-pex-Xa5及PGEX-4T-1空载体蛋白进行western-blotting分析，结果出现了单一的条带（图5），进一步说明上述诱导表达的蛋白确实是带有GST标签的目的蛋白。
2.5 目的蛋白的纯化
为了进一步研究上述表达的融合目的蛋白，利用谷胱甘肽层析柱过柱纯化融合蛋白（图6），纯化的目的蛋白单一，无杂带，可满足后期的实验要求。
3 讨论与结论
本研究采用了最常用的PGEX-4T-1原核表达载体的原核表达系统，该系统表达的融合蛋白带有GST标签，可通过亲和层析与固定在基质上的谷胱甘肽结合。GST与谷胱甘肽之间的高特异性结合确保了单个步骤就能获得高纯度的目的蛋白[14]，因此，本研究利用已知的xa5的序列，设计引物，扩增得到显性Xa5和隐性xa5基因序列，并成功构建了PGEX-4T-1-pex-xa5和PGEX-4T-1-pex-Xa5原核表达载体，为后期的融合蛋白的纯化奠定基础。
目前能够影响外源基因在大肠杆菌中稳定表达的因素有很多，如大肠杆菌菌株、诱导剂浓度、温度和诱导时间等[12]。前人通过原核表达获得目的融合蛋白的研究已有很多，如邓治等[15]通过构建pET28a-HbADF、转化大肠杆菌BL21、1 mmol/L IPTG诱导表达了橡胶树肌动蛋白解聚因子HbADF融合蛋白。Fan等[16]用0.8 mmol/L的IPTG，18℃诱导20 h后，获得了可溶性表达的CAD蛋白。基于前人的研究基础，本研究采用了适度低温（28℃）及较低含量的IPTG（0.2 mmol/L），诱导4 h，成功诱导表达了30 ku左右的目标蛋白；经SDS-PAGE跑胶分析，该蛋白在上清中大量表达，说明表达的融合蛋白为可溶性蛋白，并未形成包涵体。充分说明试验中所使用的诱导条件可很好的诱导xa5和Xa5基因的表达，并且蛋白表达量较高，可满足后期的实验要求。对表达的特异融合蛋白利用GST标签抗体进行western-blotting分析，结果有特异性反应，说明构建的载体是带有GST标签的融合蛋白。为了后期能够更好地研究和利用表达的融合蛋白，利用GST亲和层析柱纯化了目的蛋白，纯化后的目的蛋白条带特异且无杂带，说明纯化后的蛋白纯度较好，可为后期在蛋白水平研究xa5基因的功能奠定基础。
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[15] 邓 治，杜 磊，李德军. 橡胶树肌动蛋白解聚因子原核表达及纯化[J]. 热带作物学报，2014，35（2）：277-281.
[16] Fan L， Shi W J， Hu W R. Molecular and biochemical evidence for phenylpropanoid synthesis and presence of wall-link phenolics in cotton fibers[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2009， 51（7）： 626-637.
表达和纯化 第4篇
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸道系统感染为主的慢性传染病,在我国结核感染人群或感染高危人群的流动性增加,以及人们对于结核杆菌感染认识的不足,致使结核杆菌感染有日益上升的趋势[1]。目前,皮下注射结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)时临床和科研中广泛采用的一种检测人体对分枝杆菌抗原是否具有免疫反应的方法,但是,由于PPD含有所中多种抗原成分,这些抗原成分被许多亚型的结核杆菌所拥有,包括非致病型结核杆菌和卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)的接种者[2]。培养滤液蛋白10(culture filter protein 10)是致病性结核分枝杆菌表达的特异性蛋白,其仅存在致病性分枝杆菌中,而不存在与BCG及其他非致病分枝杆菌中[3]。所以在诊断结核杆菌感染的过程中既不会受到减毒BCG或其他非致病分枝杆菌的影响,也不受机体免疫状态的影响。同时,CFP10可致结核杆菌在感染小鼠的记忆效应T细胞增殖及早期大量产生IFN-γ[4,5]。因此,本研究主要通过克隆、表达并纯化CFP10蛋白。以便于利用CFP10在结核病特异性抗体的诊断方面积开展更深入的研究。
1材料与方法
1.1菌株与质粒
E.coli BL21由本实验室保存,MTB H37Rv株由本室保存。克隆载体pMD18-T载体购自大连TAKARA公司,表达载体pGEX-4T-1为本实验室保存。
1.2试剂
Taq DNA聚合酶,T4 DNA连接酶,限制性内切酶BamH I、EcoR I及DL2000、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)均购自大连TAKARA公司。质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自BBI公司。GST纯化试剂盒购自Novagen公司。抗CFP10 m AB购自abcam公司。
1.3含CFP10基因重组质粒的构建、表达、纯化及鉴定
1.3.1 CFP10基因的克隆及测序
按参考文献[2]的方法获得结核分枝杆菌毒株H37Rv的全基因组DNA,以此为模板,根据已发表的MTB全基因组设计引物,含BamH I酶切位点(下横线),含Eco R I酶切位点(下横线)。PCR反应条件:94℃预变性5 min,94℃50 s,55℃50 s,72℃1 min,共30个循环,72℃延伸3 min。将PCR产物与p MD18-T载体连接,标记为p MD18-cfp10。BamH I、EcoR I双酶切鉴定,将筛选出的阳性克隆双向测序(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)。
1.3.2重组质粒的构建、表达
BamH I、EcoR I双酶切pMD18-CFP10及pGEX-4T-1空载体,凝胶回收CFP10目的片段及pGEX-4T-1酶切载体,利用T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli BL21,阳性克隆接种于5 m L含100 mg·L-1氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养液,37℃振荡培养过夜,将过夜培养物以1:100的比例转接与100 m L新鲜的LB培养基,37℃振荡培养2 h,待细菌密度达到A600=0.6～0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol·L-1,37℃诱导4 h,12 000 r·min-1离心5 min收获菌体,重悬于100μL 1×SDS加样缓冲液中,煮沸使菌体蛋白变性,离心后取上清12μL进行12%的SDS-PAGE,观察CFP10蛋白的表达量。
1.3.3表达产物CFP10的纯化
将p GEX-4T-1-CFP10重组质粒IPTG诱导,收集诱导的菌体并用PBS洗涤2次,而后Native Binding buffer,12 000 r/min,5 min弃上清。沉淀用1×wash buffer(Novagen试剂盒)连续洗3次,根据菌体重量按Novagen试剂盒溶解包涵体液体,并与菌体充分反应后12 000 rmin离心5 min,上清透析12 h。后取GST介质2 m L 500 g/min离心5 min弃上清,Binding buffer洗涤3次加入样品,结合孵育(1—2)h。离心弃上清,用0.5 m L的Elution buffer洗洗3次,收集洗脱液。
1.3.4表达产物CFP10的鉴定
将纯化的表达产物CFP10,利用Western blot鉴定其生物学活性,CFP10表达产物12%SDS-凝胶电泳后,100 V恒压电转1 h,转至硝酸纤维素膜上后用丽春红染色,观察电转是否成功,而后蒸馏水洗涤至无色,10%脱脂奶粉封闭过夜,按1∶1 000稀释CFP10 m Ab,二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,显色并观察结果。同时,观察纯化蛋白与结核感染病人血清的反应性,将病人血清按1∶200稀释作为一抗,二抗用RHP标记的羊抗人IgG。采用相同的显色方法,观察纯化蛋白的生物学活性。
2结果
2.1 CFP10基因的克隆及序列分析
应用所设计的引物进行PCR扩增,从H37Rv基因组DNA中获得特异性的DNA片段,其大小与文献报道相符,约为303 bp(见图1),将扩增的片段连接入pMD18—T载体,送由北京奥科生物技术有限公司进行DNA测序,测序结果与GenBank数据库所收录的CFP10基因一致。
2.2重组质粒的构建及鉴定
经过BamH I、EcoR I双酶切含有目的片段的pMD18-CFP10,证实有303 bp的片段插入载体,重组的p GEX-4T-1-CFP10表达载体也证实插入了303bp的目的DNA片段(见图1)。
2.3重组菌的诱导表达及产物鉴定
将重组子p GEX-4T-1-CFP10转化E.coli BL21,37℃培养过夜,IPTG诱导表达,对重组子产物进行12%的SDS-PAGE分析,与重组子未诱导菌比较,诱导菌在36 KDa附近有表达条带(见图2)。Western blot结果证明表达蛋白可与CFP10 m Ab特异结合,表明其有一定的生物学活性,同时与病人血清反应也具有相应的生物学活性(见图3)。
2.4表达蛋白的纯化
成功纯化了谷胱甘肽和CFP10的融合蛋白,大小为36 k Da(见图2)。
1—核酸Maker DL2000,2—CFP10基因PCR产物,3—BamH I、EcoR I双酶切pMD18-CFP10重组质粒,4—BamH I、EcoR I双酶切pGEX-4T-1-CFP10重组质粒。
3 讨论
培养滤液蛋白CFP10是结核分枝杆菌基因组RD1区操纵子编码的低分子量蛋白,只存在于结核分枝杆菌菌群及其他几种致病性分枝杆菌中,BCG及其他分枝杆菌中不表达。因此CFP10作为抗原可以将结核病与BCG免疫以及非结核分枝杆菌感染区别开来,具有潜在的诊断应用价值。
目前血清学诊断所有的抗原主要有以下几种:(1) 旧结核菌素(OT)抗原;(2) 纯化蛋白衍生物( PPD )抗原;(3) 菌胞壁脂多糖;(4) 纯化的膜蛋白抗原等[6]。其中PPD被广泛用于结核病的辅助诊断和流行病学调查,但特异性不强,因为PPD 所包含的抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗( BCG ) 所共有,所以阳性结果也不能区分是致病性分枝杆菌还是非致病性分枝杆菌感染或是接种BCG免疫的所致。因而在结核分枝杆菌的诊断过程中有重要的意义。此外,CFP10具有多个T 细胞抗原表位[5], 是一种非常有效的T细胞抗原,能够引发结核分枝杆菌感染者外周血中单核细胞的增殖反应和IFN-γ的产生。Davin和Renshaw等研究表明,CFP10表现与ESAT-6相当的T细胞免疫反应,诱导的IFN-γ的释放水平与ESAT-6相当,因此CFP10是非常重要的疫苗候选基因[7]。
本研究通过扩增CFP10基因,成功构建pGEX-4T-1-CFP10表达体系。原核表达载体pGEX-4T-1由于同时含有tac启动子和lacI基因,tac是一个由trp启动子和lac UV5启动子融合而成的杂合启动子,受lac 阻抑物调控,因此它可以产生更高浓度的阻遏蛋白, 降低载体上tac启动子下游基因的本底表达,从而避免因酶过量表达产生的毒性影响细胞生长, 而在用IPTG 诱导后可以使目的基因在强启动子tac的作用下高表达[8]。通过该表达系统,获得高浓度的CFP10蛋白,该蛋白不仅能够与CFP10 mAb特异结合,而且同时能够与TB病人血清发生反应,表明其具有一定的生物学活性,为进一步开展结核分枝杆菌感染的诊断研究奠定了实验基础。
参考文献
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[2] Van Pinxteren L A,Ravn P,Agger E M,et al.Diagnosis of tubercu-losis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10.Clin Di-agn Lab Immunol,2000;7(2):155—160
[3] Okkels L M,Muller E C,Schmid M,et al.CFP10 discriminates be-tween nonacetylated and acetylated ESAT-6 of Mycobacterium tuber-culosis by differential interaction.Proteomics,2004;4(10):2954—2960
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表达和纯化 第5篇
蛋白折叠液相色谱法复性和纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落刺激因子
用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化.用Cu2+-亚氨基二乙酸(IDA)Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相.在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF.该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的.聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108 IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%.
作 者：王超展 王骊丽 耿信笃 WANG Chaozhan WANG Lili GENG Xindu 作者单位：西北大学化学系现代分离科学研究所,现代分离科学陕西省重点实验室,陕西,西安,710069 刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY 年，卷(期)： 25(4) 分类号：O658 关键词：固定化金属离子亲和色谱 蛋白折叠 纯化 重组人粒细胞集落刺激因子 大肠杆菌表达和纯化 第6篇
当Notch受体与相应配体结合后,其构型发生改变,暴露出相应的酶切位点,经过3次酶切后释放出胞内段NICD,NICD进入细胞核后与转录抑制因子结合后激活Hes等特定基因的转录而影响细胞的凋亡、增值和分化。Notch2作为Notch受体之一,其胞内段N2ICD进入细胞核后作用机制可能与该过程相似,但这方面的研究仍然不够充分。因此,在本研究中,我们利用原核表达载体p GEX-4T-1构建N2ICD的重组表达质粒,并转化E.coli BL21进行表达,为后续通过GST pull-down实验研究与N2ICD相互作用的蛋白及其作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
重组真核表达质粒p CMV-Tag4/N2ICD、p GEX-4T-1载体(由作者研究室保存),感受态E.coli DH5α和感受态E.coli BL21(北京Tiangen公司)。
1.1.2 试剂
限制性内切酶Quick CutTMEcoRⅠ、Quick CutTMXhoⅠ、T4 DNA连接酶、割胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Prime STAR GXL DNA Polymerase、DNA Marker(大连Ta KaRa);异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(北京贝尔兰科生物科技发展有限公司);谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B(GE公司);溶菌酶(广州华剑生物科技有限公司);兔抗N2ICD抗体(CST),HRP标记的羊抗兔Ig G、PVDF膜、EZ-ECL化学发光检测试剂盒、预染蛋白Marker(广州弗德生物科技有限公司);引物合成、基因测序(广州艾基生物技术有限公司)。
1.1.3 仪器
Mini P-4型电泳仪(北京凯元信瑞仪器有限公司);Eppendorf 5418型离心机(德国Eppendorf公司);TC-412型PCR仪(德国Eppendorf公司);TY10HD2200超声波破碎仪(广州聚能纳米生物科技股份有限有限公司);Western Blot自动分析仪(北京佰乐良成科技有限公司)。
1.1.4 培养基
LB液体培养基(trypytone 10 g,yeast extract 5 g,Na Cl 10 g,加去离子水至1 L,滴加5 mol/L Na OH调节p H至7.0),LB固体培养基(LB液体培养基中再加15 g琼脂)。
1.2 方法
1.2.1 Notch2胞内区基因N2ICD的扩增
根据NCBI中Notch2的基因序列(AF308601.1),设计钓取N2ICD的引物(表1),上下游引物中分别加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点(下划线处),以p CMV-Tag4/N2ICD质粒为模板,通过PCR扩增目的基因N2ICD,反应体积为50μl,反应条件:94℃预变性1 min,98℃变性10 s,60℃退火15 s,68℃延伸70 s,共进行30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。
1.2.2 重组表达质粒的构建、鉴定与测序
将表达载体p GEX-4T-1和PCR扩增的目的基因都用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收,再将获取的目的基因N2ICD与开环载体通过T4 DNA连接酶在16℃下连接过夜,产物转化E.coli DH5α,在含有氨苄抗生素的LB固体培养板上涂板培养后挑单菌落于37℃下220 r/min摇过夜,提质粒,用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。将构建成功的重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD送广州艾基生物科技有限公司测序。
1.2.3 N2ICD的诱导表达
将重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD转化E.coli BL21,在含氨苄抗生素的LB液体培养基中于30℃、220 r/min下摇菌4h,加IPTG诱导表达,再继续摇菌4h,收集菌液,12 000 r/min离心5min,取IPTG诱导前和诱导后的菌体,加PBS悬浮,再加loading buffer混匀,煮沸5 min,12 000 r/min离心5 min,分别取10μl进行SDS-PAGE电泳鉴定。同时,以空载体p GEX-4T-1的诱导表达作为对照。
1.2.4 N2ICD/GST融合蛋白表达形式的分析
经鉴定成功表达后,4℃、6 000 r/min离心15min收集菌体并称重,按照1 g菌体10 ml PBS(p H7.3)重悬菌体,先采取反复冻融3次,再按照1 g菌加10 mg溶菌酶,37℃搅拌1 h。结束后进行超声破碎,冰上操作,0.6 s/0.4 s,400 W,全程20 min。破碎液于4℃、12 000 r/min离心15 min,分别收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE电泳鉴定。
1.2.5 N2ICD/GST融合蛋白的纯化
经SDS-PAGE电泳分析发现N2ICD/GST融合蛋白以部分可溶性的形式存在于上清中,因此选择上清通过谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose4B进行纯化。取bind buffer(140 mmol/L Na Cl,2.7mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4,p H 7.3)5 ml平衡柱子,然后取超声破菌后上清5 ml上样,流速为0.2 ml/min,再用10 ml bind buffer冲洗柱子直到没有原料流出,流速为1 ml/min。最后取5 m L elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L还原型谷胱甘肽,p H 8.0)进行洗脱,流速为1 ml/min,收集各时期蛋白进行SDS-PAGE分析。
1.2.6 N2ICD/GST融合蛋白的Western Blot鉴定
将纯化的融合蛋白N2ICD/GST进行10%SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜上,通过含5%脱脂奶粉的TBST(150 mmol/L Na Cl,10 mmol/L TrisHCl,p H 7.5,0.08%Tween-20)室温封闭1.5 h,再加入兔抗Notch2一抗室温孵育20 min后在4℃下孵育过夜,洗涤后加入羊抗兔Ig G二抗室温孵育1 h,洗涤后在Western Blot自动分析仪上用EZ-ECL化学发光试剂检测结果。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增目的基因N2ICD
以p CMV-Tag4/N2ICD为模板,通过PCR扩增目的基因,经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示,扩增的DNA片段约为2 000~3 000 bp,与预期大小2 307 bp相符(图1)。
1:DL5000 DNA marker;2:目的基因N2ICD。1:DL5000 DNA marker;2:N2ICD.
2.2 重组表达质粒p GEX-4T-1/N2ICD的构建、鉴定及测序
将目的基因N2ICD和载体p GEX-4T-1同时用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,T4 DNA连接酶16℃连接过夜后转化E.coli,提取重组质粒后用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳可见p GEX-4T-1载体条带(4.9 kb)和目的基因N2ICD条带(2.3 kb),与预期结果相符,说明重组表达质粒构建成功(图2)。测序后通过在NC-BI上进行Blast,与Gen Bank公布的预测序列同源性达99%,只在第2 238位由A突变成了T,但是由于密码子GGA、GGT均编码甘氨酸,因此属于同义突变,氨基酸序列未发生变化。
1:DL5000 DNA marker;2:重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD;3:重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD+XhoⅠ单酶切;4:重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD双酶切。1:DL5000 DNA marker;2:recombinant plasmid p GEX-4T-1/N2ICD;3:recombinant plasmid p GEX-4T-1/N2ICD+XhoⅠdigestion;4:EcoRⅠ+XhoⅠdigestion.
2.3 N2ICD在E.coli中的诱导表达
将构建成功的重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD转化E.coli BL21后经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析发现在110 k Da左右有目的蛋白表达,与预期结果相符,而空载体p GEX-4T-1在26 k Da左右有GST蛋白表达,说明重组质粒p GEX-4T-1/N2ICD在E.coli BL21中得到了表达(图3)。
2.4 N2ICD/GST融合蛋白表达形式
收集的菌体经反复冻融、溶菌酶裂解、超声波破碎后,离心分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定,结果显示N2ICD/GST融合蛋白在上清和沉淀中均有分布,表明有部分融合蛋白以可溶性的形式表达(图4)。
2.5 N2ICD/GST融合蛋白的纯化
通过谷胱甘肽琼脂糖树脂glutathione sepharose4B对N2ICD/GST融合蛋白进行纯化,结合在树脂上的N2ICD/GST融合蛋白用含有还原性谷胱甘肽的缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析洗脱液成分,在110 k Da可见N2ICD/GST融合蛋白(图5)。
1:蛋白marker;2:空载体诱导前;3:空载体诱导后;4:重组质粒诱导前;5:重组质粒诱导后。1:protein marker;2:p GEX-4T-1 before induction;3:p GEX-4T-1 after induction;4:p GEX-4T-1/N2ICD before induction;5:p GEX-4T-1/N2ICD after induction.
1:蛋白marker;2:重组质粒诱导前;3:重组质粒诱导后;4:破菌后上清;5:破菌后沉淀。1:protein marker;2:p GEX-4T-1/N2ICD before induction;3:p GEX-4T-1/N2ICD after induction;4:supernatant after ultrasonic;5:precipitate after ultrasonic.
1:蛋白marker;2:破菌后上清;3:流穿液;4:洗杂液;5:洗脱液。1:protein marker;2:supernatant after ultrasonic;3:flow-through;4:PBS washing;5:purified fusion N2ICD/GST.
2.6 Western Blot鉴定N2ICD/GST融合蛋白
将经纯化的N2ICD/GST融合蛋白用兔抗Notch2单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔Ig G进行Western Blot检测,结果在110 k Da左右有目的条带(图6),与预期结果相符,说明成功表达了N2ICD/GST融合蛋白。
3 讨论
Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物,在进化上高度保守,通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化、增殖与凋亡等过程,并且其调节机制也得到了越来越多的认识[9,10]。当Notch受体与配体结合后,其构象发生改变,胞外域的TACE金属蛋白酶切割位点暴露,然后在γ-分泌酶的作用下发生水解,释放出Notch蛋白的胞内域NICD,NICD进入细胞核后与RBP-Jk(也称为CSL/CBF1)结合形成转录激活复合物并通过活化Hes(hairy enhancer of split)等特定基因的转录而影响细胞的凋亡、增殖和分化[11]。大量研究表明,Notch信号通路在各种癌症的发生发展中有着重要的调节作用,比如抑制Notch信号通路能够激活抑癌基因PTEN,从而介导胃癌细胞G2/M细胞周期停滞[12],用小干扰RNA下调Notch2可以减缓肝癌细胞Hep G2的增殖[13]等。这表明Notch信号通路将有可能为癌症的治疗提供新的选择。为此,我们课题组曾构建和真核表达了Notch信号通路中的DLL4、Jagged1和Notch2蛋白[14,15,16],用来研究他们在肿瘤发生发展中的作用。
1:蛋白marker;2:融合蛋白N2ICD/GST。1:protein marker;2:purified fusion N2ICD/GST.
Notch2作为Notch信号通路的一个重要受体,在癌症的调控中具有重要作用[17,18]。在此之前,已有研究者构建了携带增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体N2ICD/p EGFP,并在He La细胞中成功表达了N2ICD蛋白[19]。同时,我们课题组也曾构建了p CMV-Tag4/N2ICD真核重组质粒[16],但由于真核表达体系操作复杂、产量低,给研究造成很大困难,而以大肠杆菌为主的原核表达系统具有成本低、产量高、易于操作[20]、遗传背景清楚等优势。因此,我们选取了原核表达载体p GEX-4T-1进行N2ICD的原核表达,它是一种高效的表达载体,可用IPTG诱导,所表达的产物在N端带有GST序列,然后可以通过GST亲和层析柱简便、快速地纯化产物,而GST后有凝血酶切割位点,可通过凝血酶切割后获得目的蛋白,也可以用带有GST标签的目的蛋白进行Pull-down实验,获取与目的蛋白相互作用的蛋白。
此外,由于外源蛋白常以非活性方式在细菌胞质中聚集成不溶性的包涵体,必需经过变性、复性等处理后才能部分恢复其天然活性。在本研究中,为了避免N2ICD以包涵体的形式表达,我们将诱导温度从平时的37℃降至30℃,以利于N2ICD在低温下以可溶性的形式表达。菌体经过反复冻融、酶溶和超声破菌后,离心获取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析,结果显示上清和沉淀中均有N2ICD/GST的表达,选用上清进行后续亲和层析的纯化。
表达和纯化 第7篇
关键词：人骨钙素,真核载体,蛋白表达,纯化
0引言
骨钙素是由非增殖期成骨细胞特异合成分泌的一种非胶原骨蛋白,不同种生物的骨钙素蛋白具有较高保守性,多由49 ~ 51个氨基酸残基组成,且其第21位、24位和27位氨基酸为羧化的谷氨酸残基, 故又称为骨 γ - 羧基谷氨酸蛋白( bone gamma - car- boxylutamic acid protein,BGP)［1 － 3］。BGP在体内含量受性别、年龄及绝经状态影响,主要功能是维持骨的正常矿化,主要用于诊断和监测骨骼疾病、恶性肿瘤、内分泌疾病及妇科疾病等［4 － 6］。而新近研究表明BGP可通过增加胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性等机制控制血糖和脂肪代谢［7 － 9］,这使得BGP在2型糖尿病治疗中的作用广受关注。
人BGP基因由49个氨基酸残基组成,分子量小,生物提取难度大［10］,故价格高昂,加大了BGP的研究及抗体制备的难度。1996年,Sanna - Maria Ka Konen首次通过原核表达获得人BGP蛋白［11］,但原核表达通常表达量低、蛋白活性差,且小分子蛋白纯化困难,不利于BGP蛋白的获得。如采用真核表达系统则可有效解决这些弊端,获得高产量、高活性的BGP蛋白; 且毕赤酵母真核表达系统与p PIC9K质粒结合还可实现小分子BGP蛋白的直接分泌表达,有利于蛋白纯化。目前有关BGP蛋白真核表达的研究尚未见报道,本研究拟采用毕赤酵母真核表达系统,构建p PIC9K - BGP重组质粒,无需蛋白酶体外切割即可直接获得BGP小分子蛋白,为h BGP蛋白的研究、应用与开发奠定基础。
1材料与方法
1. 1材料
1. 1. 1实验材料
毕赤酵母GS115、E. coli DH5α、p PIC9K质粒由作者实验室保存。
1. 1. 2试剂
限制性内切酶Xho Ⅰ、EcoRⅠ,高保真酶Py- robest DNA Polymerase、Premix Taq、T4 DNA连接酶购自Ta KaRa公司; 质粒提取试剂盒、酵母基因组提取试剂盒购自QIAGEN公司; 兔抗人BGP抗体购自美国BD公司; 辣根过氧化物酶标记马抗山羊Ig G购自北京鼎国生物公司; DNA测序和相关引物合成由南京金斯瑞公司完成。
1. 1. 3仪器设备
My CyclerTMPCR仪、Gene Pulser XcellTM电转化仪、Gel DocTMEZ凝胶成像系统及Trans - Blot半干式转膜仪均为美国Bio - Rad公司产品。
1. 2方法
1. 2. 1真核表达载体p PIC9K - BGP的构建
根据Gen Bank数据库中人BGP编码序列,按毕赤酵母密码子偏好性,人工合成人BGP基因并分别在上下游引物两端添加XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点,在基因5’端设计KEX2蛋白酶位点。上游引物P1: 5’CTCGAGAAAAGATACCTT 3’,下划线表示XhoⅠ 酶切位点,黑体字表示KEX2蛋白酶位点; 下游引物P2: 5 ’GAATTCACTAAACTGGTC 3 ’,下划线表示EcoR Ⅰ 酶切位点。 合成BGP序列为: 5 ’CTC- GAGAAAAGA TAC CTT TAC CAG TGG CTT GGA GCA CCT GTC CCT TAC CCT GAC CCA TTG GAA CCT AGA AGA GAA GTC TGT GAG TTG AAC CCA GAT TGT GAC GAG TTG GCA GAC CAC ATC GGT TTC CAG GAG GCA TAC AGA AGA TTT TAC GGA CCA GTT TAGTGAATTC3’,总长度169 bp。
将p PIC9K质粒及BGP基因用XhoⅠ、EcoRⅠ 双酶切并用T4 DNA连接酶连接获得重组p PIC9K - BGP质粒。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,种板过夜培养,随机挑取克隆,用质粒提取试剂盒提取质粒,经双酶切及DNA测序鉴定获得阳性克隆。
1. 2. 2重组毕赤酵母表达菌p PIC9K - BGP( GS115) 的获得
将空载体p PIC9K和1. 2. 1中的重组质粒p PIC9K - BGP用Sac Ⅰ 酶切做线性化处理,并以无水乙醇沉淀浓缩至10μL后与80μL GS115酵母感受态细胞混合,冰浴15 min,快速加入0. 2 cm预冷电转化杯中并将之置于电转化仪两极间电击,条件: 电压1 500 V; 电阻200 Ω; 电容25 μF; 时间5 ms。 电击后向电转化杯中迅速加入1 mol/L冰预冷山梨醇1 m L混匀,混合液转入1. 5 m L灭菌离心管,28℃ 水浴保温2 h,5 000 r/min离心1 min( 4℃) ,留上清50 μL重悬菌体,涂MD平板,28℃ 倒置培养2 ~ 3 d至出现单菌落。分别在p PIC9K( GS115) 和p PIC9K - BGP( GS115 ) 菌体平板上随机挑取若干克隆,于5m L YPD培养基中培养,用酵母基因组提取试剂盒提取菌体基因组,以此基因组DNA为模板进行PCR鉴定,以确定p PIC9K或p PIC9K - BGP质粒转入并整合到GS115基因组序列中,PCR鉴定方法参照文献[12],使用通用引物,引物序列为: 3’AOX: 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3 ’;5 ’ AOX: 5' GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3 ’。 p PIC9K - BGP ( GS115) 应扩增出一条715 bp( 546 + 169) 的特异性条带; p PIC9K( GS115) 应扩增出一条546 bp的特异性条带。
1. 2. 3重组酵母工程菌的诱导表达
以含1 mg /m L G418的MD平板培养阳性重组菌,筛选高拷贝克隆,挑取数个单菌落接种于5 m L BMGY培养基中,放置于28℃ 、200 r / min振荡摇床培养至OD600= 3 ~ 6; 5 000 r / min离心5 min收菌, 菌体沉淀重悬于50 m L BMMY培养基( 调节OD600= 1. 0) ,28℃ 、200 r / min震荡培养; 每24 h向培养基中添加100% 甲醇至终浓度0. 5% 进行诱导表达。诱导时间: 24 h、48 h、72 h、96 h。每个时间点取1 m L菌液,离心收集表达上清,硫酸铵沉淀浓缩100倍, Tricine - SDS - PAGE蛋白电泳检测不同诱导时间的蛋白表达情况。
1. 2. 4 Western blotting法检测BGP蛋白
将Tricine - SDS - PAGE电泳胶转至PVDF转移膜,经BSA封闭后,依次加入h BGP的多克隆抗体( 1: 1 000稀释) 、辣根过氧化物酶标记的Ig G抗体, 最后在联苯胺溶液中显色并观察是否有目的条带。
1. 2. 5 BGP蛋白的分离纯化
诱导表达阳性菌株,96h后收集上清1. 5 L, PEG20000浓缩至250 m L,0. 45 μm滤膜过滤除杂质。p H 9. 0、20 mmol/L的Tris - HCl缓冲液透析3次,每次6 h。用p H 9. 0,20 mmol/L的Tris - HCl平衡液平衡Q - Sepharose FF 6B阴离子树脂。加样品h BGP于平衡好的阴离子树脂柱,280 nm监测。用分别含70 mmol/L、200 mmol/L、1. 5 mol/L Na Cl的缓冲液( 阴离子交换层析洗脱液) 进行分段洗脱,流速为4 m L/min,收集各段洗脱峰。用p H 9. 0、20 mmol / L的Tris - HCl平衡Sephadex - G25凝胶分离柱,将Q - Sepharose FF 6B洗脱峰液上样,上样结束后,继续用p H 9. 0,20 mmol/L的Tris - HCl洗脱,根据紫外检测仪在280 nm测定、记录的蛋白峰,收集各蛋白峰流出液,Tricine - SDS - PAGE确定目的蛋白峰所在。
2结果与分析
2. 1真核表达载体p PIC9K - BGP的构建
转化子经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后,1% 琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。结果表明,酶切后电泳结果有两条带,分别为p PIC9K( 9 276 bp) 和BGP基因( 153 bp) ,与载体大小和目的基因大小一致( 图1) 。
图 1 XhoⅠ和 EcoＲⅠ双酶切重组质粒 p PIC9K － BGP 电泳图1． DNA 分子量标准; 2． p PIC9K － BGP 重组质粒双酶切结果。Figure 1 Agarose gel electrophoregram of plasmiddigested by XhoⅠand EcoＲⅠ1． DNA marker; 2． The restriction analysis results of recombinantplasmid p PIC9K － BGP．
DNA测序结果: 重组质粒中的BGP基因序列与设计的序列一致,全长169 bp( 图2) 。
2. 2重组毕赤酵母表达菌p PIC9K - BGP( GS115 ) 的获得
对7个重组转化子和1个空载体转化子进行PCR鉴定,重组子PCR产物扩增出了含目的基因的715 bp( 546 + 169 ) 左右的特异性带,而空载体扩增出546 bp条带,说明p PIC9K - BGP成功转入并整合到GS115基因组中( 图3) 。
2. 3重组酵母工程菌的诱导表达
浓缩表达上清Tricine - SDS - PAGE结果显示: 表达获得了分子量大小为5. 8 k Da的目的蛋白,诱导24 h无明显条带、48 h有条带出现,72 h表达条带明显,96 h表达条带达高峰( 图4) 。实验中诱导96 h后酵母已明显进入老化状态,大量沉淀死亡。
2. 4 Western blotting法检测BGP蛋白
表达上清Western Blot鉴定证实获得分子量大小为5. 8 k Da的BGP蛋白( 图5) 。
2. 5 BGP蛋白的分离纯化
诱导表达阳性菌株,96h时收集上清经浓缩、离子交换层析、Sephadex - G25凝胶分离柱纯化后, Tricine - SDS - PAGE分析显示蛋白纯度在95% 以上( 图6) 。
1.DNA分子量标准;2.p PIC9K(GS115)菌株基因组DNA的PCR鉴定产物;3~9.p PIC9K-BGP(GS115)菌株基因组DNA的PCR鉴定产物。1.DNA marker;2.The PCR product of the genome of the yeast p PIC9K(GS115);3-9.The PCR product of the genome of the yeast p PIC9K-BGP(GS115).
3讨论
BGP由骨骼分泌,通常用于特异性反映骨的转换过程。新近研究表明,除骨骼外,小鼠骨髓及血小板也可表达BGP,说明BGP的作用除了传统的骨的形成与转化,可能还具有其他的生理调节功能,例如促进血管生成［13］、调节动脉粥样硬化［14］、影响雄性生殖［15］等。此外,BGP可以增加胰岛素分泌及提高胰岛素敏感性,还具有降血糖、降血脂及降低体重的三重功效［16 － 17］。故BGP有望成为一种新型的2型糖尿病治疗的靶向药物。但BGP分子量小,生物提取困难,价格昂贵。虽已有研究者成功利用基因工程法原核表达BGP蛋白,但均为融合表达,易形成包涵体,小分子BGP蛋白难以分离,BGP活性低［18 － 19］,难以获得高效稳定的可溶性表达产物。而真核表达系统则可获得高纯度高活性的BGP蛋白, 这对于BGP的获得和后期药物研究具有重要意义。 毕赤酵母是第二代真核表达系统,其操作技术规范成熟,培养过程简易快速,且蛋白表达量高、纯化简便,并具有蛋白转译后修饰功能［20］,有利于获得高纯度、高活性的目的蛋白,是目前最为成功的真核表达系统之一。而p PIC9K质粒是酵母整合分泌表达的常用载体,可利用组氨酸缺陷型标记进行互补筛选,其自身带有信号肽,信号肽上的KEX2蛋白酶位点可实现BGP蛋白的自动切割和分泌表达,利于BGP蛋白的分离纯化。目前人BGP基因在毕赤酵母中的表达尚未见研究报道。
本研究根据人源BGP序列,采用毕赤酵母偏好密码子合成BGP基因。由于p PIC9K信号肽上自带的KEX2蛋白酶位点在分泌切除时在目的产物N端会残留3 ~ 5个信号肽氨基酸序列,为获得天然蛋白,没有采用载体的KEX2位点,而在目的基因5’ 端引入KEX2位点,合成169bp的目的基因并克隆到p PIC9K中,电转化GS115菌株后得到数十个转化子,其中高拷贝转化子近10个,摸索不同的诱导表达时间,获得表达量较高的BGP蛋白。通过对表达蛋白的分离纯化获得与预期蛋白分子量大小相同的目的蛋白产物。通过本研究高效获得了真核表达的BGP蛋白,为BGP蛋白的研究、开发和作为糖尿病新型药物的应用奠定了基础。
4结论
人Kin17蛋白的原核表达及纯化 第8篇
乳腺癌是女性中发病率最高,致死率居次席的肿瘤,严重威胁着女性的身体健康[1]。很多乳腺癌患者在手术后易复发;临床上对转移性乳腺癌尚无有效的对策[2]。近50% 的乳腺癌患者对化疗药物产生耐药性[3]。这迫切需要寻找更理想的治疗策略。最近本课题组研究发现,Kin17在乳腺癌的组织与细胞系中明显高表达,并维持了乳腺癌细胞的DNA复制、DNA修复功能及肿瘤细胞的快速增殖,在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的作用[4]。但Kin17在肿瘤细胞中的分子调控机制尚未被阐明,而且国内外尚未见商品化的人Kin17蛋白可供研究使用。因此,本研究将人KIN17基因克隆入原核表达载体中,诱导Kin17蛋白表达并对其进行纯化、鉴定,为进一步探索Kin17蛋白的分子结构、功能及其在乳腺癌中的分子调控机制创造条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
原核表达载体pET32a-c(+)和大肠杆菌JM109、BL21(DE3)由作者研究室保存;携带KIN17基因全长的PK3质粒由法国Laurent Miccoli教授惠赠。
1.1.2 试剂
限制性内切酶、PrimeSTAR 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒购于大连宝生物公司;蛋白胨、酵母提取物和氨苄青霉素购于Sigma公司;Ni-NTA His-Bind 树脂购于Qiangen公司;IPTG购于Amersham Pharmacia公司;鼠抗人Kin17单抗和羊抗鼠 IgG-HRP购于Santa cruz公司;其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 KIN17基因的PCR扩增:
根据人KIN17 基因cDNA序列(GenBank NM_ 012311,1 182 bp)以及pET32a-c(+)载体上的多克隆位点设计引物,上游引物P1:5’CGGGATCCATGGGGAAGTCGGATTTTCT 3’,下游引物P2:5’ CGTAAGCTTTCAGGCAAGTTTAGAAATGTCTTC 3’,下划线碱基分别为BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点。引物由上海生工生物技术公司合成。以PK3质粒为模板进行PCR扩增,反应条件为:首先94℃变性5 min,然后按94℃变性45 s,59℃ 退火1 min 30 s,72℃延伸1 min,共30个循环后,再于72℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下观察扩增结果。
1.2.2 pET32a-KIN17重组质粒的构建:
取经DNA片段纯化试剂盒纯化的PCR产物和pET32a-c(+)载体DNA用内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别进行双酶切反应。目的基因与载体的酶切产物分别经琼脂糖凝胶电泳分离,切胶回收,再用T4 DNA连接酶在16℃ 反应过夜。连接产物用化学法转化感受态细菌JM109,在100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 平板上筛选阳性克隆。次日,挑取生长起来的单菌落用菌落PCR与双酶切方法进行鉴定。鉴定正确的阳性重组克隆菌株送上海生工生物技术公司测序。
1.2.3 His-Kin17融合蛋白的诱导表达:
将经测序正确的重组质粒pET32a-KIN17转化入大肠杆菌表达菌BL21中。单菌落经抗性筛选与鉴定后,接种于2 mL含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃震摇培养至A600值达到0.6～1.0,次日以1∶100接种新鲜的LB,培养至A600值达到0.6,加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,然后离心收集菌体,超声裂解,离心取上清,经SDS-PAGE电泳分离及考马斯亮蓝染色后,观察目的蛋白的表达情况。
1.2.4 His-Kin17蛋白的纯化:
根据Qiagen的Ni-NTAHis-Bind树脂的产品说明书进行。IPTG诱导的菌体经超声破碎后,离心收集上清液,利用Ni-NTA His-Bind层析柱进行亲和纯化,然后用含咪唑的洗脱液来洗脱,最后进行SDS-PAGE电泳观察结果。
1.2.5 Western免疫印迹鉴定纯化的Kin17蛋白:
把纯化的Kin17重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后,然后电转至PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入鼠抗人Kin17单抗,4℃孵育过夜。次日加羊抗鼠IgG二抗孵育45 min,PBST漂洗后,用ECL底物曝光及GE公司ImageQuant RT ECL成像系统拍照。
2 结果与分析
2.1 人KIN17 cDNA全长的PCR扩增
M:DL2000 marker;1:PCR products of KIN17 cDNA.
M:DL2000 marker; 1:PCR products of KIN17; 2:Recombinant plasmid digested with restriction endonucleases BamHⅠ and HindⅢ.
扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,结果显示扩增出一条清晰的DNA带,分子大小介于1 000bp与2 000bp之间,与预期片段大小1 200 bp相符(图1)。
2.2 pET32a-KIN17重组克隆的酶切鉴定
挑选候选菌落,用菌落PCR方法进行初筛,再对阳性克隆进行质粒抽提,用BamHⅠ/HindⅢ进行双酶切分析。琼脂糖凝胶电泳(图2)可见两条清晰的条带,分别与预期的KIN17基因(约1 200bp)和pET32a载体(约5 900bp)的片段大小一致。
2.3 pET32a-KIN17重组质粒的DNA测序结果
挑选经PCR与双酶切鉴定正确的阳性克隆进行DNA测序分析。测序结果表明,重组质粒中插入片段的DNA序列与人KIN17 cDNA序列完全一致(图3),表明重组质粒构建成功。
2.4 重组转化菌中Kin17融合蛋白的表达
pET32a-KIN17质粒转化入表达菌BL21后,用IPTG诱导,裂解上清经SDS-PAGE电泳,发现在分子量为66.4kDa附近出现明显的蛋白条带(箭头所指),与His-Kin17融合蛋白分子量65.7kDa相符。而且,该蛋白条带在0～5h之内随诱导时间增加而表达增强,4h后达到平台最高值。而未经IPTG诱导的转化菌在相应的位置没有出现明显的带白条带(图4)。0～0.7 mmol/L浓度范围的IPTG都能取得很好的诱导效果,而0.1～0.3 mmol/L IPTG诱导效果最好(图5)。
2.5 Kin17蛋白的纯化与鉴定
使用Ni-NTA树脂亲和层析方法,对经IPTG诱导后的细菌裂解上清中的His-Kin17融合蛋白进行纯化。纯化后得到的蛋白浓度较高,纯度达到95%以上(图6A)。应用Kin17单抗进行的Western blot鉴定结果显示,所收获的纯化蛋白为Kin17蛋白(图6B)。
M1:Protein molecular weight standard 1; 1-6:Crude extract of transformed bacteria induced with IPTG for 0h,1h,2h,3h,4h,5h, respectively.
M2:Protein molecular weight standard 2; 1-5:Crude extract of the transformed bacteria induced with 0 mmol/L, 0.1mmol/L, 0.3 mmol/L , 0.5 mmol/L IPTG, 0.7 mmol/L IPTG, respectively.
3 讨论
Kin17是一个在物种进化中十分保守的蛋白,在机体的各种组织与器官中普遍低表达[5]。而本课题组发现,Kin17在乳腺癌中明显高表达,维持了肿瘤细胞的DNA复制、DNA修复功能及肿瘤细胞快速增殖活性,在乳腺癌的发生发展中发挥着重要的角色;沉默Kin17的表达,不仅能抑制肿瘤细胞的增殖活性与克隆形成能力,而且能增强其对化疗药物的敏感性;因此Kin17很可能是一个潜在的乳腺癌治疗靶点[4]。但目前国内外对于Kin17在肿瘤中的分子调控机制及信号传导途径所知甚少。ERK1/2是EGFR下游信号传导通路MAPK家族中的一个成员,被报道与乳腺癌细胞的生存及增殖有关[6]。我们研究显示,Kin17能促进乳腺癌细胞中的ERK1/2的磷酸化活性。Cyclin D1是调控G1/S转换的关键因子,它的过表达与乳腺癌的预后密切相关[7]。我们发现Kin17能促进乳腺癌细胞中的Cyclin D1表达水平。抑癌基因p53在DNA损伤修复与细胞周期中起着中枢作用,p53突变或失活在乳腺癌中很普遍[8]。本课题组的回顾分析显示,Kin17的高表达与乳腺癌组织标本中的p53突变呈正相关。
Kin17在肿瘤细胞中分子调控机制的发挥,依赖于Kin17蛋白的结构与功能。人Kin17蛋白呈模块结构,由四个重要的结构功能区组成[9]。第 27～50个氨基酸是个锌指结构,具有DNA结合活性;第239～256个氨基酸是个二聚体,也是核定位信号区。第161～201个氨基酸是与RecA蛋白同源的中心结构域。第335～373个氨基酸是个KOW模体,具有RNA结合活性[10]。而且Kin17在细胞中与其他蛋白存在着密切的功能联系。Kin17被发现是多蛋白DNA复制复合物中的一个组分[11]。
Kin17蛋白的获取对Kin17蛋白的结构与功能的深入探讨非常重要。但目前,国内外尚未见Kin17蛋白基因工程重组及纯化程序的详实报道,也未见该蛋白的商品化产品可供研究选用。本研究将人KIN17基因插入原核表达载体pET32a中,构建重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达了带His标签的Kin17融合蛋白,并成功得对Kin17重组蛋白进行了纯化及鉴定。本研究获得的高纯度Kin17蛋白为下一步研究其蛋白结构、功能区和活性位点提供了重要的实验材料,也为应用Pull down方法分析Kin17与细胞中其他的候选蛋白间相互作用准备了条件,从而为探索Kin17在肿瘤中的分子调控机制及信号传导途径奠定了基础。
参考文献
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表达和纯化 第9篇
大肠杆菌yfi F基因是一个功能未知的基因,它所编码的Yfi F蛋白功能也未知,yfi F基因大小为1 038 bp,编码345 aa,蛋白质的分子量37.784 k Da,相关研究预测Yfif蛋白有tRNA甲基转移酶活性,负责tRNA中某种核苷酸的甲基化,并认为它是核糖体相关蛋白[1,2,3]。为了研究大肠杆菌yfi F基因功能,探讨其作用机制,本研究采用p ET16b表达质粒构建p ET16b-yfi F表达载体,转化大肠杆菌BL21,使用IPTG诱导表达Yfi F融合蛋白,并对诱导条件进行了IPTG加入时机、终浓度及诱导时间方面的优化。使用镍柱纯化裂菌上清液中的可溶性Yfi F融合蛋白,为解析yfi F基因功能及Yfi F蛋白的结晶研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
p ET16b原核表达质粒、大肠杆菌BL21(DE3)和BW25113由作者实验室保存。
1.1.2 试剂
酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂购自Oxide公司;NotⅠ、EcoRⅠ内切酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司;异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、高保真DNA聚合酶、质粒提取试剂盒购自大连宝生物公司;预染蛋白质marker和非预染蛋白质marker购自Thermo公司;Ni-NTA蛋白纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司。
1.1.3 仪器设备
离心机,Centrifuge5424,Eppendorf;水浴摇床,Innova3100,Eppendorf;恒温培养箱:Heratherm IGS750,Thermo;电泳仪,Power Pac,Bio-Rad;凝胶成像仪,Gel Doc EZ,Bio-Rad;超净工作台,SW-CJ-ZFD,苏州净化设备有限公司。
1.1.4 培养基
LB液体培养基;LB固体培养基。
1.2 方法
1.2.1 yfi F基因的扩增
引物由上海生工生物工程公司合成。上游引物:5’-GCGCCATATGAACGATGTTTAGAAAGG-3’(划线部分为NdeⅠ酶切位点),下游引物:5’-GTGGATCCTCAGGCTTTATTCTGACGCC-3’(划线部分为Bam HⅠ酶切位点)。PCR模板为大肠杆菌BW25113基因组,扩增条件为:94℃预变性2 min,循环设定为94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s,30个循环,最后72℃延伸10 min。
1.2.2 构建p ET16b-yfi F重组质粒
切胶回收PCR扩增的yfi F基因片段,将回收的yfi F片段和p ET16b质粒用NdeⅠ和Bam HⅠ限制性内切酶进行双酶切,然后用T4 DNA连接酶连接30min,42℃热击45 s转化感受态BL21菌,涂布于含氨苄青霉素(Amp,100μg/m L)的琼脂平板上,37℃过夜培养至出现单菌落。因为宿主菌BL21基因组内也含有yfi F基因,所以不能进行菌落PCR鉴定,可抽提重组质粒进行双酶切鉴定。挑取单菌落培养,抽提重组质粒进行NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定,将双酶切鉴定结果为阳性的重组质粒送华大科技公司进行测序,验证重组质粒yfi F基因的ORF是否正确。
1.2.3 yfi F基因的诱导表达
将测序正确的阳性重组质粒的菌株接种于3 ml含Amp的LB液体培养基中活化过夜,然后按1∶100比例接种于50 ml含Amp的LB培养基中,180 r/min震荡培养至OD600值等于0.6;加入诱导剂IPTG,终浓度为0.5 mmol/L,诱导yfi F基因的表达,分别在诱导1、2、3、4 h时,取1 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析Yfi F蛋白的表达情况。
1.2.4 表达产物SDS-PAGE分析
将离心1 ml菌液收集的菌体用100μL 1×SDS蛋白电泳上样缓冲液悬浮并混匀,煮沸5 min,电泳上样量为20μL/孔。使用12%的SDS-PAGE,电泳结束后使用考马斯亮蓝对凝胶染色,根据蛋白条带颜色深浅判断Yfi F融合蛋白的表达水平,并根据目的蛋白在SDS-PAGE胶中迁移距离的对数与标准分子量作图,计算表达的Yfi F融合蛋白的分子量。
1.2.5 Yfi F融合蛋白表达条件的优化
(1)优化IPTG的加入时机:将过夜活化的菌株扩培至50 m L LB培养基中,180 r/min震荡培养,分别在细菌生长至OD600为0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1时加入IPTG,终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为5 h,各取1 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析Yfi F融合蛋白的表达量,确定IPTG加入的最佳时机。
(2)优化诱导剂IPTG的终浓度:由优化IPTG的加入时机可知,IPTG的最佳加入时机是细菌OD600值为1。诱导表达时,在OD600值为1时加入IPTG,终浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L,诱导5 h,各取1 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析Yfi F蛋白的表达量,确定诱导剂IPTG的最佳终浓度。
(3)优化IPTG的诱导表达时间:由前两次优化条件已知,IPTG的加入时间是细菌OD600值为1,最佳终浓度为0.1 mmol/L。在诱导表达时,诱导表达时间分别为3、5、7、9、11 h,各取1 ml菌液离心收集菌体进行SDS-PAGE,分析Yfi F蛋白的表达量,确定诱导表达的最佳时间。
1.2.6 表达目的蛋白的纯化
将过夜活化的细菌扩培至50 ml含Amp的LB培养液中,当细菌OD600值为1时,加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L,诱导9 h后,离心收集诱导表达后的细菌,加5 ml破菌液,混匀,使用超声破菌,功率300 W,超声2 s,间歇3 s,60个循环,然后10 000 r/min,4℃离心15 min,收集上清液用于蛋白纯化。按照Ni-NTA蛋白纯化试剂盒的操作方法纯化上清液液中的Yfi F蛋白,采用透析去除蛋白溶液中的咪唑。
1.2.7 蛋白定量
用BCA法测定,以牛血清白蛋白为标准绘制标准曲线,根据标准曲线计算纯化后的Yfi F蛋白浓度。
2 结果与分析
2.1 重组质粒的构建和鉴定
电泳结果显示在约1 058 bp处出现特异性条带,PCR扩增出的条带与预计的yfi F基因片段长度(1 058 bp)相仿(图1),双酶切后插入p ET-16b载体,转化宿主菌BL21,涂布于含Amp抗性的琼脂平板上,37℃过夜培养。挑取单菌落使用LB液体培养基培养,抽提重组质粒进行NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切鉴定,在酶切质粒条带的下方可见约1 058 bp的目的片段,表明yfi F基因已经插入p ET-16b质粒(图2)。将双酶切鉴定结果阳性的重组质粒送华大科技公司测序,结果显示重组质粒yfi F基因的ORF序列完全正确。
M:DNA marker;1:阴性对照(PCR反应未加模板);2:yfi F的PCR产物。M:DNA marker;1:negative control(PCR reaction without templates);2:PCR product of yfi F.
2.2 p ET16b-yfi F重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达
将含有阳性重组质粒的BL21菌扩培至50 ml LB液体培养基,当细菌OD600值为0.6时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导yfi F基因的表达。SDS-PAGE分析发现Yfi F融合蛋白在诱导1 h时即开始表达,随着诱导时间的延长,菌体内Yfi F融合蛋白的量逐渐增加。SDS-PAGE分析Yfi F融合蛋白的分子质量为35 k Da左右,小于预期的理论值(40 k Da左右)(图3)。
M:DNA marker;1~2:p ET16b-yfi F重组质粒;3~5:NdeⅠ和Bam HⅠ双酶切p ET16b-yfi F重组质粒。M:DNA marker;1-2:recombinant plasmid p ET16byfi F;3-5:p ET16b-yfi F was digested by NdeⅠand Bam HⅠ.
M:预染蛋白质marker;1:诱导前;2~5:诱导1、2、3、4 h菌体。M:pre-stained protein marker;1:before induction;2-5:bacteria that was inducted for 1,2,3 and 4 h.
2.3 Yfi F融合蛋白诱导表达条件的优化
为了提高Yfi F融合蛋白的表达量,对诱导条件进行优化。主要包括IPTG的加入时机、IPTG的终浓度和诱导表达时间。由于在初次诱导表达时间为4 h,且观察到融合蛋白的量随着诱导时间的延长而增加,所以在优化诱导剂IPTG的加入时机时,将诱导时间延长至5 h。结果发现细菌OD600值增加,即细菌量增多时,加入诱导剂IPTG,融合蛋白的量增多。因为OD600值为1时,细菌的生长已经进入平台期,生长速度减慢,所以诱导剂IPTG的加入时机选定为细菌OD600值为1(图4)。优化诱导剂IPTG的终浓度的结果发现在提高诱导剂IPTG的终浓度后,Yfi F融合蛋白的表达量没有增加,又由于IPTG对细菌有毒性,所以诱导剂IPTG的终浓度选定为0.1mmol/L(图5)。优化IPTG的诱导表达时间的结果发现Yfi F融合蛋白的表达量随着诱导时间的延长而增加,11 h时的表达量与9 h时相仿,所以选定最佳的诱导时间为9 h(图6)。
M:预染蛋白质marker;1~6:细菌OD600值为0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1时加入IPTG诱导5h后菌体;7:诱导前。M:pre-stained protein marker;1-6:bacteria when OD600was 0.2,0.4,0.5,0.6,0.8 and 1 adding IPTG and was inducted for 5 h;7:before induction.
M:预染蛋白质marker;1~5:IPTG终浓度为0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L诱导5h后菌体。M:pre-stained protein marker;1-5:bacteria that final concentration of IPTG was 0.1,0.25,0.5,0.75 and 1 mmol/L and was induced for 5 h.
2.4 可溶性Yfi F蛋白的纯化
50 ml诱导表达9 h的细菌经超声破菌和离心,收集上清液按照Ni-NTA蛋白纯化试剂盒的操作方法纯化Yfi F融合蛋白。SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白溶液只有一条清晰条带,位置与Yfi F融合蛋白条带相同,说明目的蛋白得到了较高程度的纯化(图7)。
M:预染蛋白质marker;1~5:诱导表达时间分别为3、5、7、9 h、11h的菌体。M:pre-stained protein marker;1-5:bacteria that inducing time respectively was 3,5,7,9 and 11 h.
M:预染蛋白质marker;1:纯化前裂菌上清;2:纯化后蛋白;3:洗涤液。M:pre-stained protein marker;1:supernatant of disintegrating bacteria before purification;2:proteins after purification;3:wash buffer.
2.5 Yfi F蛋白纯化后的浓度测定
用BCA法测定,以牛血清白蛋白为标准绘制标准蛋白曲线,根据标准蛋白曲线计算纯化后Yfi F融合蛋白浓度为209μg/ml。
3 讨论
由于大肠杆菌具有易于培养、生长繁殖速度快、表达量高、容易纯化、成本低等优点,成为原核表达系统高效表达的首选宿主菌,其中BL21(DE3)是应用最广的表达宿主菌[4,5]。
p ET表达质粒由于含有强启动子,可高效表达外源蛋白,而且质粒还含有一段组氨酸标签的基因序列,便于表达蛋白的鉴定和纯化,使得p ET表达质粒成为大肠杆菌表达重组蛋白常用的载体之一[6]。p ET16b表达质粒在载体的5’端有编码6个组氨酸的基因序列(6×His),下游含有由异亮氨酸、谷氨酸、甘氨酸和精氨酸构成的Factor Xa(凝血因子Xa)的酶切位点序列,在其后连接着插入的目的基因序列,所以表达的融合蛋白主要由N端的6×His、Factor Xa酶切位点和目的蛋白组成。表达的融合蛋白经Factor Xa酶切后,目的蛋白的N端只多一个组氨酸,有利于目的蛋白功能和结晶的研究。
本研究将大肠杆菌未知基因yfi F插入p ET16b质粒构建重组表达载体,导入大肠杆菌进行重组融合蛋白的诱导表达。最初选用的诱导条件是原核诱导表达使用较为广泛的条件,即细菌OD600值为0.6,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导4 h。由于大肠杆菌BL21的基因组内也含有yfi F基因,并进行基因表达,所以在未使用IPTG诱导时,细菌内可检测到Yfi F蛋白。诱导表达后,Yfi F融合蛋白表达量高,且以可溶性和包涵体两种形式存在。SDS-PAGE分析Yfi F融合蛋白的分子质量为35 k Da左右,而理论值为40 k Da左右,即表达的Yfi F融合蛋白的分子质量小于预期,原因还有待进一步分析。
使用原核表达系统表达重组融合蛋白时,不同的诱导条件对于蛋白的表达影响很大,所以优化目的蛋白的诱导表达条件是十分必要的。本实验通过优化诱导剂IPTG加入的时机、终浓度、诱导时间,提高Yfi F融合蛋白的表达水平[7,8,9,10]。在优化诱导剂IPTG加入时机的实验中,选定最佳加入时机为细菌OD600值为1,因为此时细菌的密度已经很大,且已经进入生长的平台期,培养液的营养开始下降,还需要接下来几个小时的诱导表达。在优化诱导剂IPTG终浓度的实验中,在细菌生长至OD600值为1时,加入不同浓度的IPTG。结果发现其他终浓度IPTG诱导目的蛋白Yfi F的表达量与0.1 mmol/L时相仿,又由于IPTG对细菌有毒性,高浓度的IPTG会影响细菌的生长和蛋白的表达,所以选定诱导剂IPTG的最佳终浓度为0.1 mmol/L。在优化诱导时间的实验中,在细菌生长至OD600值为1时,加入IPTG,终浓度为0.1 mmol/L。结果发现在诱导1h时融合蛋白就开始表达,并且表达量随着诱导时间的延长而增加,但是诱导9 h和11 h时融合蛋白表达量并没有太大差别,所以最佳诱导时间选定为9 h。最终确定Yfi F融合蛋白的最佳诱导条件为细菌生长至OD600值为1,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导9 h。
在蛋白纯化实验中,选择裂菌后的上清用于Yfi F融合蛋白的纯化,因为上清液中的Yfi F蛋白是可溶性的,经过折叠具有活性和功能,而沉淀中的Yfi F蛋白绝大多数以包涵体形式存在,是不可溶的,没有活性和功能,需要复杂的包涵体裂解、蛋白折叠等步骤,并且有活性蛋白的比例也不容易检测。因此,虽然细菌裂解沉淀中含有较多的Yfi F蛋白,但仍然选择从裂菌上清纯化Yfi F蛋白,以便于后续的蛋白功能和结晶研究。裂菌上清中的Yfi F蛋白经镍柱纯化后经SDS-PAGE分析得到有效的纯化,纯化后的Yfi F蛋白经BCA蛋白定量法计算其浓度为209μg/ml。本实验为接下来研究未知蛋白Yfi F的功能提供了一定的前期基础。
4 结论
本研究成功构建了大肠杆菌未知基因yif F的原核表达系统。经过诱导表达条件的优化,提高了Yif F融合蛋白的表达水平,表达的可溶性Yif F融合蛋白得到有效纯化。
参考文献
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表达和纯化 第10篇
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
宫颈癌Hela细胞全基因组、E.clioDH5α、E.clioBL21、克隆载体pET30a(+)均由本中心保存。
1.2 试剂
T4DNA连接酶、限制性内切酶Bam HⅠ、SalⅠ、NdeⅠ均购自Takara公司,DNA小剂量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自生工(上海)公司,PCR高保真酶购自Fermentas公司。
1.3 目的基因的获得
根据Gen Ban K中人PKM2的全基因序列,长度为2516 bp。设计两对引物,其序列分别为:上游引物p1:5'-GGGATCCATGTCGAAGCCCCAT-AGTG-3'(下划线为Bam HⅠ的酶切位点);上游引物p2:5'-GCATATGTCAGCAGCCATGTCGAAGC-3'(下划线为NdeⅠ的酶切位点);下游引物p3:5'-AGTCGACAT-CACGGCACAGGAACAAC-3'(下划线为SalⅠ的酶切位点)。以宫颈癌Hela细胞全基因组DNA为模板,分别以p1、p3和p2、p3为上下游引物,进行PCR扩增。总体系为:50μl体系,反应条件:96°C预变性5分钟后,98°C变性10秒,62°C退火15秒,72°C延伸90秒,30个循环后,72°C再延伸10分钟。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果。
1.4 pET30a(+)-PKM2的构建
用BamHⅠ、SalⅠ及NdeⅠ、SalⅠ分别双酶切,胶回收纯化后的PCR产物及pET30a(+)载体,然后用T4连接酶进行连接,转化E.clioDH5α感受态细胞。挑取光滑菌落,接种于含卡那霉素的LB液体培养基中。经BamHⅠ、SalⅠ及NdeⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后,将筛选出的阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。
1.5 目的蛋白的表达形式
将测序准确的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞。挑取阳性单克隆再活化后以1∶100的比例转接到含卡那霉素的LB液体培养基中,37°C,180 rpm振荡培养2～3小时后,加入0.4 mmol/L IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)诱导3小时,离心回收菌体;超声破碎后,离心收集上清及沉淀,沉淀用PB重悬。同法处理BL21空菌,作阴性对照。加入凝胶上样缓冲液,煮沸5～10分钟,取20μl进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用考马斯亮兰染色,在凝胶成像分析系统中进行分析目的蛋白的表达情况。
1.6 目的蛋白表达条件的优化
将菌液按1∶100接种于含卡那霉素的LB液体培养基,37°C振荡培养2～3小时后,加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L、0.4mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L,37°C诱导3小时后收菌,进行SDS-PAGE分析。其中在加入IPTG至终浓度0.4 mmol/L时,37°C诱导表达1小时、3小时、6小时、12小时后收菌,进行SDS-PAGE分析。
1.7 含组氨酸标签PKM2B纯化
按上述方法诱导融合蛋白的表达并收集菌体,加入PB重悬菌体,超声裂解菌体,离心,弃上清,沉淀用PB重悬。用镍离子柱亲和层析纯化融合蛋白。
2 结果
2.1 目的基因的PCR扩增
琼脂糖凝胶电泳显示PKM2基因的PCR产物大小均在1820 bp左右,与该基因的CDS区大小相符,见图1。
2.2 重组质粒双酶切验证与鉴定
重组质粒双酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测到大小约为1800 bp、5400bp的2个片段,证明pET30a(+)-/PKM2构建成功,见图2。将质粒p ET30a(+)-PKM2样品送北京六合华大基因科技服务有限公司测序,测序结果与GenBank上公布的PKM2基因序列完全一致。
1:Marker(4500、3000、2000、1200、800、500、200 bp);2:PKM2B基因;3:PKM2B基因阴性对照;4:PKM2N基因;5:PKM2N基因阴性对照
1:Marker(4500、3000、2000、1200、800、500、200 bp);2:pET30a(+)-PKM2B双酶切片段(BamHⅠ/SalⅠ);3:pET30a(+)-PKM2N双酶切片段(NdeⅠ/SalⅠ)
2.3 目的蛋白的表达形式
重组菌诱导后表达产物的SDS-PAGE显示,诱导的重组菌在约58 KDa处有一蛋白条带,同预计的大小相吻合,因PKM2B含有组氨酸标签,所以其分子量较实际增大,条带位置稍高。阴性对照菌BL21无此条带,见图3。
2.4 目的蛋白表达条件的优化
不同IPTG浓度诱导后表达产物的SDS-PAGE显示,在0.1 mmol/L,0.4mmol/L,0.8 mmol/L、1.0 mmol/L,均有目的蛋白的表达。但以0.4 mmol/L表达量最大,见图4A。在0.4 mmol/L诱导浓度下,在诱导的1小时、3小时、6小时、12小时均有目的蛋白的表达,PKM2B、PKM2N最适表达时间均为3小时,见图4B。
1:Marker(97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3 KDa);2:PKM2B培养物上清;3:PKM2N培养物上清;4:PKM2B超声裂解液;5:PKM2N超声裂解液;6:PKM2B超声裂解液上清;7:PKM2N超声裂解液上清;8:PKM2B超声裂解液沉淀;9:PKM2N超声裂解液沉淀;10:BL21超声裂解液沉淀
1:Marker(97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3 KDa);2:0.1 mmol/LIPTG诱导PKM2B;3:0.1 mmol/L IPTG诱导PKM2N;4:0.4 mmol/L IPTG诱导PKM2B;5:0.4 mmol/L IPTG诱导PKM2N;6:0.8 mmol/L IPTG诱导PKM2B;7:0.8 mmol/L IPTG诱导PKM2N;8:1.0 mmol/L IPTG诱导PKM2B;9:1.0 mmol/L IPTG诱导PKM2N
1:Marker(116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4KDa);2:PKM2B1h诱导;3:PKM2N1h诱导;4:PKM2B3h诱导;5:PKM2N3h诱导;6:PKM2B6h诱导;7:PKM2N6h诱导;8:PKM2B12h诱导;9:PKM2N12h诱导
2.5 含组氨酸标签PKM2B蛋白的纯化
从重组菌中制备的包涵体经洗涤后,用8 mol/L尿素变性,经超声裂解后加样到Ni-NAT金属螯合亲和层析柱中。由于质粒PET30a(+)多克隆酶切位点上游插入编码6个连续组氨酸残基的序列(6×His Tag),在重组质粒进行诱导表达时,6×His Tag与外源插入片段共同表达,因而融合蛋白带有6×His Tag,后者可与金属镍发生鳌合,从而使目的蛋白在流经柱床时被特异性吸附,再利用咪唑置换,洗脱下特异性结合的蛋白,见图5。
1.Marker(116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4 KDa);2.PKM2B
3 讨论
PK有4种同工酶:L-PK、R-PK、M1-PK、M2-PK(PKM2又称M2-PK)。所有亚型的分布具有组织特异性,并以高活性的四聚体形式存在,且有不同的生物学活性。L-PK在肝和肾组织中表达,主要负责糖异生。L-PK对其底物PEP的亲和力最低,它可被1,6-2磷酸果糖、ATP别构激活。可被AMP依赖的蛋白激酶磷酸化而失活,cAMP受胰高血糖素控制。L-PK的表达还与营养有关,高糖饮食使其上调,饥饿使其下调。R-PK主要在红细胞中表达,其动力学性质和调节机制与L-PK相似。M1-PK在脑和肌肉中表达,这两个器官都需要高能量。M1-PK对其底物PEP的亲和力最高,且不受别构、磷酸化调节,也较小受营养的影响。PKM2分布于肺、脂肪、视网膜以及所有需要大量核苷酸合成的组织中。后者包括正常的增殖细胞、胚胎细胞、干细胞,尤其是肿瘤细胞中,他们都是增殖旺盛的细胞。在组织分化的过程中,PKM2逐渐消失;在高分化组织癌变的过程中,PKM2会再次表达[6]。
因PKM2在多种肿瘤组织中存在高表达,如肺癌、宫颈癌及结肠癌等,其已作为一种新的肿瘤标志物被提出[7,8,9,10]。其与妇科肿瘤的关系也备受关注。早在1978年,已有文章报道PKM2在宫颈癌组织及子宫内膜癌组织中高表达[11]。2004年,Babita等[12]检测70例宫颈组织,结果显示,PKM2在宫颈癌组织中表达明显高于慢性宫颈炎及正常宫颈组织。该研究同时表明,PKM2在宫颈良性及恶性组织的敏感性及特异性分别为82%及60%,故认为PKM2可作为宫颈癌检查的肿瘤标志物。
最新研究表明,PKM2的表达和肿瘤恶性程度、血管生成、侵袭转移、耐药及预后均有密切关系[2,3,4,10]。Peng等[5]的研究表明,PKM2基因敲出的肺腺癌细胞体外培养,可明显抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡,小鼠体内细胞成瘤率明显较低。在人A549肺癌细胞小鼠移植瘤模型中,PKM2的RNA干扰联合卡铂治疗可有效抑制肿瘤生长,抑制肿瘤细胞增殖[13]。另有研究表明,可以通过减少PKM2的乙酰化作用以间接抑制乙酰化作用抑制肿瘤的生长,但乙酰化的作用减少之后可能会增加肿瘤的抗药性[14]。因此,该蛋白可以作为新治疗的靶点来协助肿瘤治疗。但需要更多、更深入的研究。
