核转录因子κB（精选7篇）
核转录因子κB 第1篇
关键词：NF-κB,肾脏,缺血-再灌注损伤
近年来随着器官移植技术的不断进步, 人们对缺血-再灌注损伤 (Ischemia/Reperfusion Injury, IRI) 的发生机制有了进一步的认识。尽管IRI发生的确切机制尚未完全阐明, 但许多学说及理论在临床实践和科研实验中得到证实。在临床上多种疾病均可导致肾缺血-再灌注损伤 (renal Ischemia Reperfusion Injury, RIRI) , RIRI的发生机制也成为人们关注的焦点。最近, 国内外许多文献报道核转录因子κB (nuclear factor of kappa B, NF-κB) 与RIRI方面的新进展, 本文综述如下。
1 肾脏缺血-再灌注损伤研究现状
1.1 RIRI的原因及研究意义
在临床上凡是能引肾脏血流动力学改变的疾病, 例如严重感染、创伤、休克、新生儿窒息、肠梗阻、肠套叠、肺炎、挤压综合征、肾移植、肾切开取石术等均可导致RIRI。RIRI是一种常见且危及生命的严重并发症, 发生率为18%～27%[1], 病死率达35%[2]。因此, RIRI成为近年来研究工作的一个热点。
1.2 RIRI的机制
RIRI机制十分复杂, 目前普遍认为RIRI为缺血和再灌注两大时相多因素、多途径联合发挥作用的病理生理过程。缺血时相病理生理机制为组织缺氧能量代谢障碍;再灌注时相病理生理机制为氧自由基损伤、钙超载、炎症反应、细胞凋亡和无复流现象[3]。
2 N F-κB在肾脏缺血-再灌注损伤
2.1 NF-κB简介
2.1.1 NF-κB的分子生物学属性
核转录因子κB为1986年Sen和Baltmore首次从成熟的B淋巴细胞核中提取, 是一种多功能的转录调节因子, 能和球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列 (5'-GGGACTTTCC-3') 特异结合[4], 其在炎症反应、免疫应答、细胞增殖生长分化、细胞周期和细胞凋亡中起重要调控作用。
据研究发现, NF-κB在机体各种组织细胞中呈二聚体形式广泛存在。由NF-κB家族和与其高度同源的Rel家族成员构成, 在哺乳动物中包括五个成员:NF-κB1 (p50和p105) 、NF-κB2 (p52和p100) 、RelA (p65) 、c-Rel、v-RelB[5]。各成员分别两两配对组成各种NF-κB转录因子[6]。各个成员蛋白质的氨基末端约有300个氨基酸残基构成的Rel同源区 (Rel homogeneous domain, RHD) 。该区主司NF-κB的二聚化、核定向易位、与DNA分子的特异结合。
2.1.2 NF-κB的激活与调控
NF-κB激活的机制较复杂, 目前未完全阐明。研究证实, NF-κB在细胞质中与NF-κB抑制性蛋白质 (inhibitory protein of NF-κB, IκB) 结合呈无活性形态存在, 在细胞核中与IκB解离呈活性形态存在。IκB借锚蛋白重复序列与NF-κB的RHD结合, 掩盖NF-κB的核定位序列 (nuclear localization sequence, NLS) , 使NF-κB呈无活性形态潴留于胞浆内。IκB家族成员包括:IκB-α/MAD-3、IκB-β、P105/IκB-γ、P100/IκB-δ、IκB-ε、Bcl-3等。IκB激酶 (IKK) 激活与IκB磷酸化是从NF-κB解离到最终降解最为关键的步骤。其可能机制为, 当细胞受到外界信号刺激时, NF-κB活化诱导信号先使IκB第32和36位点上的丝氨酸发生磷酸化[7], 其在第21和22位的赖氨酸位置上泛素化, 继而引发26S蛋白体使IκB迅速降解并从NF-κB/IκB复合体中释放出来, IκB失活。IKK可在IκB降解中发挥作用, 使NF-κB活性增强。Chen等[8]研究证实, IκB蛋白激酶-1、IκB蛋白激酶-2、NF-κB诱导型蛋白激酶 (NIK) 等参与IκB磷酸化及降解, 导致NF-κB激活, 从而促进相关基因的转录和表达。目前研究认为NF-κB的活化过程受到正负反馈2方面的精细调节。NF-κB的失活与激活是通过其在胞核和胞浆穿梭的动态平衡来实现[9]。
2.2 NF-κB在肾脏缺血-再灌注损伤中的作用机制
NF-κB在RIRI发生发展中起着重要的作用[10]。由于在多种病理活性物质, 如生长因子、细胞因子、转录因子、趋化因子、粘附分子、急性期蛋白、免疫受体、氧化应激相关酶等的可诱导基因基因启动子和增强子中均含有NF-κB的结合位点, NF-κB成为导致组织损伤的一个共同环节, 因而在免疫反应、炎症发应、细胞凋亡、IRI等病理生理改变过程中NF-κB都起着重要的调控作用。再灌注时相产生的过氧化物可激活NF-κB, 后者可诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18、IL-25、粘附分子、C反应蛋白纤溶活化因子-1、补体C33、MCP-1、GM-CSF等炎症介质的高度表达。同时, NF-κB激活后可以促使单核巨噬细胞增殖及活化[11], 从而诱导炎症反应参与RIRI发病。TNF-α相关炎症因子通过激活NF-κB导致TNF-α受体I表达而产生一系列炎症反应[12]。肾小球的系膜细胞, 肾小球脏层上皮细胞和游走进入肾脏的中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎症细胞可通过自分泌及旁分泌作用产生多种炎性介质作用于肾脏而发挥病理生理作用, 从而对RIRI发生与发展产生影响。国内学者孙艳玲等[13]研究证实, 肾缺血-再灌注2h后NF-κB被大量激活, 主要集中在肾小管上皮细胞内表达, 引起ICAM-1和TNF-α的表达, 导致肾组织损伤。而李开龙等[14]研究发现, NF-κB广泛存在于在IRI达1d的小鼠肾脏的肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞和由血循环浸入肾脏的炎症细胞中。
2.3 抗NF-κB与肾脏缺血-再灌注损伤治疗
RIRI是一个复杂的病理生理变化, NF-κB在其发生发展过程中发挥着重要的作用, 因而NF-κB成为RIRI治疗的一个切入点。目前主要的研究关注点在于通过干预NF-κB的分子生物学结构、激活途经及信号传导等环节, 从而治疗RIRI。国外有学者研究发现, 糖皮质激素类药物可与细胞质中受体结合, 从而可以抑制NF-κB与IκB序列特异性结合;另外其还通过激活IκB基因表达, 促进IκB表达, 诱导活化的NF-κB灭活[15]。环孢菌素A等免疫抑制剂能够与T细胞受体结合, 抑制蛋白酶体活性, 阻止IκBα的降解, 从而抑制T细胞内NF-κB的活化。维生素C、二硫代氨基甲酸吡咯烷、维生素E及其衍生物等抗氧化剂类药物能够阻止半胱氨酸发生氧化, 阻断IκB磷酸化, 从而抑制NF-κB活性。靶向IKKα的反义核酸, 能够阻止IKKα的合成, 阻碍IκB的磷酸化及降解过程, 从而抑制NF-κB活性。NF-κB圈套寡脱氧核苷酸技术阻断了NF-κB与DNA位点结合, 从而抑制了NF-κB的转录活性。此外, 一些中药如银杏叶提取物、绿茶提取物、葛根素、雷公藤、大黄、参附、黄芪和当归等对NF-κB活性也有调节作用。
3 展望
核转录因子κB 第2篇
关键词：针刺,督脉,缺血性中风,核转录因子κB
脑缺血再灌注后的细胞凋亡和炎症反应是缺血再灌注损伤的主要原因之一[1,2],缺血缺氧及其产生的炎性细胞因子,可诱导核转录因子κB(NF-κB)转录各种缺血急性期细胞因子基因,进一步促进炎症反应,同时可能通过NF-κB信号转导途径,诱导神经细胞凋亡[3,4]。针刺对脑梗死的治疗作用有多水平、多靶点的特点,基于前期研究基础,本研究拟观察针刺督脉经穴对脑梗死NF-κB表达的影响,探索针刺督脉经穴改善脑缺血再灌注损伤的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
雄性SD大鼠,体质量(200±30)g。实验动物随机分为假手术组、模型组、针刺对照组、针刺督脉组四组,每组动物按取材时间点为大脑中动脉栓塞(MCAO)后3、6、12、24、72 h分为5个亚组,每亚组6只。
1.2 造模方法
按35 mg/100 g以10%水合氯醛腹腔麻醉,手术方法参考Kuge造模法[5],于颈正中切开,分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),离断ECA的分支,在游离出的ECA剪一小口,将制备好的尼龙线插入ECA内,通过CCA分叉处经ICA插至大脑前动脉(ACA),直至大脑中动脉(MCA)入口处,尼龙线插入深度平均为(18.5±0.5)mm。缺血2 h时向外拉取尼龙线,此时即可恢复右侧MCA血供,形成脑缺血再灌注。
1.3 治疗参数
假手术组和模型组动物,于术后即如针刺组大鼠般固定于针刺操作台上20 min,不做治疗,每12小时1次。针刺对照组和针刺督脉组动物MCAO后即针刺,针刺对照组予针刺气海、关元,针刺督脉组予针刺百会、风府,持续20 min,每12小时1次。穴位定位参考人民卫生出版社1997年第1版《实验针灸学》中大鼠的气海、关元、百会、风府取穴方法。针刺后予SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪加电,疏密波刺激(疏波5 Hz,密波10 Hz),电压3~5 V,电流1 m A,持续时间为20 min。术后即给予针刺,每12小时1次。
1.4 取材
取材时间点为MCAO后3、6、12、24、72 h。10%水合氯醛麻醉处死,先以生理盐水灌注,再以4%多聚甲醛内固定,将取出的脑组织以4%多聚甲醛固定24~48 h,转入30%蔗糖溶液至组织块沉底,石蜡包埋切片备用。
1.5 观察指标
1.5.1 免疫组化检测NF-κB表达
石蜡切片常规脱蜡至水,加3%H2O2室温5~10 min以灭活内源性酶。热修复抗原,滴加兔抗NF-κB p65单克隆抗体(1∶100),置于20℃2 h,4℃过夜。滴加生物素化山羊抗兔Ig G,室温20 min,滴加链霉素亲和素一生物素复合物(SABC,1∶100),室温下孵育2 h,DAB显色。脱水,透明,封片,镜检。取8个不重叠的×400视野分析切片的阳性细胞数量。
1.5.2 激光共聚焦扫描显微镜检测NF-κB转录活性
切片脱蜡至水,热修复抗原,滴加山羊血清工作液,室温孵育20 min,滴加兔抗NF-κB p65一抗(1∶100),4℃过夜。滴加FITC(1∶50)标记的羊抗兔Ig G,避光,37℃孵育30 min,滴加碘化丙啶(PI)(0.3μg/m L),避光,37℃孵育20 min,滴加甘油,封片,共聚焦激光扫描显微镜检测。PI(红色荧光,用543 nm光激发,选择560 nm发射滤光片)可与细胞核脱氧核糖核酸(DNA)结合,可指示细胞核所在。异硫氰酸荧光素(FITC),绿色荧光,用488 nm光激发,选择505~530 nm发射滤光片)标记NF-κB的p65亚基,可指示NF-κB在细胞中的位置。检测荧光强弱,以胞核内绿色荧光与胞浆中绿色荧光的比值作定量分析。取8个不重叠的×400视野分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 11.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差表示,采用方差分析,计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 受试动物观察期内死亡率分析
假手术组大鼠未出现死亡,其他组大鼠共死亡22只,经χ2检验,模型组、针刺对照组、针刺督脉组间动物死亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 针刺督脉对脑缺血NF-κB表达的影响
实验结果显示,与假手术组相比,模型组在MCAO后12 h内NF-κB核染色阳性细胞开始增加,阳性细胞的增加至少持续至MCAO后72 h;针刺督脉组与模型组相比,在MCAO后24 h和72 h,阳性细胞减少(P<0.05),与针刺对照组相比,在MCAO后24 h,阳性细胞减少(P<0.05)。见表2。
2.3 针刺督脉对脑缺血NF-κB转录活性的影响
实验结果显示,与假手术组相比,模型组在MCAO后12 h和24 h时NF-κB转录活性增加;在MCAO 24 h,针刺督脉组与模型组相比,NF-κB转录活性减弱(P<0.05)。见表3。
3 讨论
NF-κB是一种核转录因子,是中枢神经系统重要的突触信号转导蛋白,在脑梗死急性期,受到缺血缺氧等信号激活后,可将突触信号传导到核内,调控一系列基因的转录,其参与了脑梗死后多种炎症介质基因的表达,并在脑梗死后细胞凋亡的死亡受体通路中发挥重要作用[6]。
注:与假手术组比较,(1)P<0.05;与模型组比较,(2)P<0.05;与针刺对照组比较,(3)P<0.05
注:与假手术组比较,(1)P<0.05;与模型组比较,(2)P<0.05
目前对于脑梗死急性期的针灸治疗,临床医师和患者的接受度有待提高,正确的针灸辨证论治是提高疗效和确保治疗安全性的关键。本研究结果显示,针灸治疗并不会增加MCAO实验动物的死亡率。针灸治疗在减轻中风急性期患者神经系统损伤等方面有确切效果,并可调节脑梗死后细胞凋亡相关蛋白的表达[7,8],减少脑细胞凋亡的发生[9]。中风病针灸治疗中,重视督脉和任脉的应用,对患者神经功能损伤的改善具有重要意义[10]。《难经·二十八难》指出督脉行于脊里,上至风府入脑,说明督脉在循行上与脑的密切关系,督脉为阳脉之海,统一身之阳气,与诸经交汇,将十四经脏腑气血上输于脑,奉养元神,故脑脉闭阻取督脉治疗可激发阳气,行气血,通经络。而任脉为阴脉之海,与督脉共同协调人体阴阳功能。因此祖国历代医家常应用督脉和任脉经穴治疗中风因脑脉闭阻、阴阳气血失调所表现出的神志异常、言语肢体功能障碍等。实验结果表明,MCAO后3、6、12、24、72 h 5个时间点内,NF-κB核染色阳性细胞数量峰值出现在12 h时间点,在24 h时间点仍维持较高水平,针刺督脉经穴在MCAO 24 h和72 h时可减少NF-κB的过度表达,在MCAO 24 h时可使过强的NF-κB转录活性减弱,提示针刺督脉治疗脑梗死,可能通过调节NF-κB表达,减少炎症反应,减少神经细胞凋亡的发生,从而减轻脑梗死的症状。
参考文献
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核转录因子κB 第3篇
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
成年雄性Wistar大鼠48只, 体重265g±15g, 购自山西医科大学实验动物中心, 随机分为对照组 (8只) 、AS模型组 (40只) , AS模型建立后又随机分为AS模型假手术组及AS模型持续缺血0.5h、6h、12h、24h组, 每组8只。
1.2 模型建立
1.2.1 大鼠动脉粥样硬化模型建立
对照组给予基础饲料, AS模型组均给予高脂饲料 (2%胆固醇、0.2%猪胆盐、0.2%丙基硫氧嘧啶、10%猪油、87.6%基础饲料) 喂养, 自由摄水。喂食量为每只每天30g~40g, 整个试验周期为6个月[2]。
1.2.2 动脉粥样硬化基础上缺血性脑卒中模型建立[3]
参考Takeshi等方法制作双侧颈总动脉 (2VO) 结扎模型[4]。实验前动物禁食8h, 自由饮水, 称重, 10%水合氯醛0.3mL/kg进行腹腔注射麻醉, 仰卧位, 固定, 沿颈中线切开, 分离出双侧颈总动脉。对照组及AS模型假手术组:仅作双侧颈总动脉分离, 不结扎;AS模型持续缺血组:采用外科3-0尼龙线永久结扎双侧颈总动脉, 于相应时间点断头取脑, 做免疫组化实验。
1.3 免疫组化实验检测脑组织NF-κB表达情况
将所取脑组织浸入甲醛中固定, 蜡块包埋。制作石蜡切片, 常规脱蜡至水, 抗原热修复, 正常山羊血清封闭。滴加比例适当稀释的一抗 (按1∶200稀释, 北京博奥森生物技术有限公司, bs-0465R) , 4℃湿盒过夜, 磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂洗, 滴加生物素化二抗工作液, 37℃孵育, PBS漂洗, 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液, 37℃孵育, PBS漂洗, DAB显色, 常规复染, 二甲苯透明, 封片。
1.4 图像分析
应用MIAS-2000图像分析系统进行定量分析[5], 记录免疫组化结果中的平均光密度值。
1.5 统计学处理
采用SPSS 13.0软件分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示。组间多重比较采用LSD-t法, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
对照组和AS模型假手术组大鼠脑组织NF-κB免疫组化染色阳性颗粒在脑组织中有少量表达, 二者比较无统计学意义 (P>0.05) , 在AS模型持续缺血各组脑组织中有不同程度NF-κB阳性表达, 且主要分布于缺血区及其周边区。各AS模型持续缺血组与对照组比较, 脑组织NF-κB表达均有统计学意义 (P<0.05) ;与AS模型假手术组比较有统计学意义 (P<0.05) , 各AS模型持续缺血组比较有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。
PU
3 讨论
缺血性脑卒中后常出现脑水肿, 引起颅内压增高、脑组织继发性损伤等, 成为影响缺血性脑损伤疗效的重要因素。越来越多的研究结果显示, NF-κB的活化是缺血性脑卒中后继发性损伤的一个重要枢纽。NF-κB是1986年Sen和Baltimore首先从B淋巴细胞核提取物中检测出的一种蛋白因子[6], 它能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合, 它也是一种具有多项转录激活功能的调节因子。正常情况下, 大多数细胞中NF-κB与其抑制蛋白 (Inhibitory Kappa B, IκB) 结合形成复合体, IκB覆盖于NF-κB的核定位信号区, 复合体以非活化状态下存在于静止期细胞的胞浆中。当诱导因子刺激时, 由信号诱导激活的IκB激酶引起IκBa蛋白第32和36位丝氨酸的磷酸化, 磷酸化的IκBQ由泛素蛋白在多个位点形成泛素化。最后, 泛素化的IκBa被26S蛋白酶水解, 暴露出Rel蛋白上的核定位信号区, 这样就使NF-κB快速易位进入细胞核内, 与NF-κB的靶基因的同源序列位点结合, 使这些靶基因表达增加, 从而产生不同的基因产物。NF-κB转录调节的连接位点位于许多促炎细胞因子与免疫调节因子的启动区, 对诱导炎症反应起着重要作用。NF-κB活化后, 细胞因子和炎性介质在脑组织过度表达致使神经元赖以存在的环境发生变化, 使神经元变性[7,8]。
本研究结果显示, 对照组和AS模型假手术组脑组织NF-κB表达处于低水平状态;大鼠急性脑缺血后, 脑组织NF-κB表达显著增强, 实验组大鼠皮层损伤区NF-κB表达0.5h即开始增高, 6h明显增高, 12h达到峰值, 24h开始下降;总体上, 随缺血时间延长, 脑组织损伤程度也逐渐加重, 损伤细胞主要以神经元为主。本实验使用动脉粥样硬化基础上缺血性脑卒中大鼠模型对NF-κB的表达及变化规律进行研究, 更符合动脉粥样硬化病变基础上形成脑梗死的临床实际情况。本研究结果可为缺血性脑卒中的基础研究及临床干预治疗脑卒中提供新思路。
摘要：目的 研究核转录因子-κB (NF-κB) 在动脉粥样硬化 (AS) 缺血性脑卒中 (CIS) 模型大鼠脑组织中的表达规律。方法 48只雄性Wistar大鼠随机分为对照组 (8只) 和模型组 (40只) , 后者制备动脉粥样硬化大鼠模型, 然后再被分为动脉粥样硬化模型假手术组, 动脉粥样硬化模型持续缺血0.5h、6h、12h、24h组, 上述各组大鼠均为8只。免疫组织化学法检测核转录因子-κB在脑组织中的表达及变化。结果 各动脉粥样硬化模型持续缺血组与对照组比较NF-κB表达有明显升高 (P<0.05) , 各动脉粥样硬化模型持续缺血组与假手术组比NF-κB表达也有明显升高 (P<0.05) , 并随时间发生规律性变化了, 其中NF-κB在持续缺血6h组达到高峰。结论 NF-κB在动脉粥样硬化基础上出现缺血性脑卒中后引起的脑损伤过程中发挥了重要作用。
关键词：缺血性脑卒中,动脉粥样硬化,核转录因子-κB,大鼠
参考文献
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核转录因子κB 第4篇
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
清洁级SD大鼠50只, 雄性, 体重270~290 g。由湖南中医药大学动物房提供, 实验动物许可证号:SCXK (湘) 2009-0012。
1.1.2 药物
护心康片剂由湖南省中医药研究院附属医院制剂室生产, 批号为 (湘) 卫药剂20131104, 由瓜蒌壳、茯苓、旋覆花、茜草、生蒲黄、远志、山楂、玉竹等中药精制加工而成, 每片含生药0.3 g, 粉碎后制备成含生药0.2 g/m L的混悬液。胆固醇、胆酸钠 (郑州利伟生物化工厂) ;丙基硫氧嘧啶 (上海朝晖药业有限公司) ;维生素D3注射液 (上海通用药业股份有限公司) ;市售白糖、猪油。
1.1.3 试剂
NF-κB p65, VCAM-1, MCP-1兔源性单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供;二抗:SP-9000免疫组化试剂盒通用型 (K122319A) 由中山金桥有限公司提供;SP试剂盒由北京中山生物制剂公司生产;显色剂:浓缩型DAB试剂盒 (ZLI-9018) 由中山金桥有限公司提供。
1.1.4 仪器
BX43研究型显微镜奥林巴斯;KD2258轮转式石蜡切片机金迪;TP-8组织摊片机久圣医疗;202型电热恒温干燥箱中兴;Forma Scientific电热恒温培养箱;BCD-222KSA冰箱海尔;微波炉海尔;MI动脉粥样硬化医学图像分析管理系统麦克奥迪。
1.2 方法
1.2.1 造模
按文献[2]的方法进行造模, 每日给予高脂饲料3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.3%基础饲料, 连续8周, 并在喂食高脂饲料前一次性腹腔注射维生素D36×105U/kg, 以建立动脉粥样硬化模型。喂养8周后通过随机抽样, 经苏木精-伊红 (HE) 染色观察大鼠主动脉病理解剖, 以确认动脉粥样硬化斑块是否造模成功, 验证模型复制成功后, 将抽样动物及死亡动物分别从相关组的统计学分析中剔除。
1.2.2 分组与给药
动物适应性饲养1周后, 随机抽取6只为正常组, 予以普通饲料喂养。将剩余44只造模动物依据随机数字表进行分组, 随机分为四组, 分别为模型组、护心康低剂量组、护心康中剂量组、护心康高剂量组, 每组11只。用药组依据动物体重, 参照动物与人体体表面积折算的等效剂量计算药物具体剂量, 实验期间每周称体重, 根据体重变化调整给药量。具体分组与用药为:正常组给予蒸馏水灌胃;模型组:从造模后第57天起, 蒸馏水灌胃;护心康低剂量组:从造模后第57天起, 护心康灌胃给药用量为0.41 g/ (kg·d) ;护心康中剂量组:从造模后第57天起, 用护心康进行治疗, 护心康用量为0.81 g/ (kg·d) ;护心康高剂量组:从造模后第57天起, 护心康灌胃给药, 用量为1.62 g/ (kg·d) 。各组每日灌胃体积10 m L/ (kg·d) , 分2次灌胃, 连续4周。
1.2.3 取材
实验8、12周后, 用乌拉坦腹腔注射进行麻醉后, 将大鼠面部向上固定于解剖板上, 沿腹白线剖开腹腔, 并向上剪开胸腔, 将心脏暴露。随后一手固定心脏, 另一手将灌流针插入左心室, 用血管钳夹闭左心室固定灌流针, 分别以生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注, 观察大鼠情况, 尾部僵直、肺叶变白时停止灌注, 于主动脉瓣至髂动脉分叉处剪断, 取主动脉、髂动脉分支处血管。
1.2.4 检测项目及方法
1.2.4. 1 HE染色病理检测
将取材组织用4%多聚甲醛固定, 经流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋后, 切片, 做HE染色, 显微镜下观察病理变化。
1.2.4. 2 动脉免疫组化检测
按免疫组化试剂盒操作要求染色:石蜡切片, 常规脱蜡至水。3%双氧水灭活, PBS洗3 min共3次, 抗原修复, PBS洗3 min共3次, 滴加封闭液, 室温 (37℃) 孵育20 min, 倾去, 勿洗。滴加1∶100稀释的一抗, 37℃孵育2~3 h。PBS洗3 min共3次, 滴加生物素化二抗工作液, 室温 (37℃) 孵育20 min, PBS洗3 min共3次, 滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液, 室温 (37℃) 孵育20 min, PBS洗3 min共3次, DAB显色, 自来水洗, 苏木精复染, 脱水, 透明中性树胶封片, 显微镜下见细胞浆或细胞核内有棕黄色或棕褐色颗粒即为阳性表达, 每张切片选取细胞分布均匀的5个区域于400倍视野镜下观察照像, 以MI动脉粥样硬化医学图像分析系统测定其光密度值以进行定量分析, 光密度值越高, 表示其表达越强。
1.3 统计学方法
所有数据经SPSS 16.0软件进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 均数间经方差齐性检验后, 进行单因素方差分析, 多重比较采用LSD-t和Dunnett-t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组主动脉内膜HE染色病理变化
HE染色切片显示, 正常组血管壁层次结构清晰, 主动脉壁内膜表面光滑完整, 平滑肌排列整齐, 无增厚;模型组动脉内膜可见隆起的斑块, 病灶表层为大量胶原纤维, 有纤维帽的形成, 可见炎症细胞的浸润, 内膜下有泡沫细胞的聚集, 确定大鼠动脉粥样硬化模型建立成功。护心康低剂量组动脉壁斑块厚度相较模型组斑块厚度薄, 病灶内可见一定量的泡沫细胞, 护心康高、中剂量组斑块厚度较低剂量组进一步降低。见图1 (封三) 。
2.2 护心康对大鼠主动脉VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达的影响
VCAM-1、MCP-1主要表达于动脉内膜, 内皮表面阳性着色为棕黄色反应产物沉积, NF-κB蛋白主要表达于细胞浆及细胞间质, 五个组比较正常组主动脉染色较浅, 呈淡黄色;模型组动脉内膜呈深棕黄色;3个护心康不同剂量组动脉内膜染色呈棕黄色, 均较模型组颜色浅。模型组VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达比正常组高, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 提示造模成功后, 粥样斑块中VCAM-1、MCP-1、NF-κB蛋白表达升高。NF-κB在护心康高、中、低剂量组均较模型组低, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 护心康高、中剂量组较低剂量组有明显降低, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 护心康高剂量组和中剂量组之间差异无统计学意义 (P>0.05) ;VCAM-1在护心康高、中剂量组均较模型组低, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 护心康低剂量组与模型组之间差异无统计学意义 (P>0.05) , 护心康高、中剂量组较低剂量组有明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.01或P<0.05) , 护心康高剂量组和中剂量组之间差异无统计学意义 (P>0.05) ;MCP-1在护心康高、中、低剂量组均较模型组低, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 护心康高、中、低剂量组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1、图2 (封三) 。
注:与正常组比较, *P<0.01;与模型组比较, ▲P<0.01;与低剂量组比较, △P<0.05, ◇P<0.01;NF-κB:核转录因子-κB;VCAM-1:血管细胞黏附分子-1;MCP-1:单核细胞趋化蛋白-1
3 讨论
动脉粥样硬化是动脉壁疾病, 是发生在大、中动脉的一种缓慢进展的粥样硬化性疾病, 它的特征是循环白细胞的聚集、黏附及跨越, 血管内皮细胞转移, 伴随着一系列化学因子、细胞因子和生长因子的产生, 导致血管壁脂质的形成和纤维组织的损伤[3]。其中的NF-κB、VCAM-1、MCP-1等炎症因子, 大量研究都清楚地显示了它们在动脉粥样硬化中的作用及作用方式[4,5,6,7]。
MCP-1是具有趋化及活化单核细胞功能的重要细胞因子之一, 可聚集单核/巨噬细胞迁移入动脉内皮下层, 然后巨噬细胞通过摄取氧化型低密度脂蛋白 (ox LDL) 形成泡沫细胞, 加速动脉粥样斑块的形成。文献报道, MCP-1的过量表达可以加速动脉粥样硬化的进展和泡沫细胞的形成, 而MCP-1的缺失可以减缓动脉粥样硬化的进展[4,5]。Martinovic等[6]通过对263例志愿者的研究显示, 血浆MCP-1水平升高可以增加冠状动脉粥样硬化的发病风险。
黏附因子是参与细胞间、细胞与细胞外基质间黏附的一系列大分子, 其中VCAM-1及细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) 在动脉粥样硬化的形成过程中起着重要的作用, 其中VCAM-l早期表达促进了血管内皮的损伤[7], 在进展期则主要通过促进已迁入病灶的单核细胞的滚动、T淋巴细胞的激活, 增加细胞间的相互作用及多种细胞因子的释放, 促进平滑肌细胞转化和增殖, 从而形成纤维斑块, 并影响斑块的稳定性。张玉保等[8]研究发现VCAM-1在粥样斑块形成过程中持续表达, 提示黏附分子在动脉粥样硬化的早期与进展期均发挥着重要作用。
NF-κB是多种炎性反应相关基因的重要转录调控因子, 在动脉粥样硬化的发生和发展过程中, NF-κB可以调节一系列炎症因子的基因的表达, 包括MCP-1和细胞间黏附分子-1等的表达, 与动脉粥样硬化的炎性反应的放大与持续密切相关。近年来有学者认为, NF-κB是动脉粥样硬化发生的始动机制之一, 它可通过调控炎症因子的产生, 进而调节白细胞的聚集、泡沫细胞的形成以及影响硬化斑块的稳定性, 参与动脉粥样硬化的发生、发展[9]。Benard等[10]报道在动脉粥样斑块中有NF-κB的活化, 涉及的病变区域与细胞类型多样, 而在血管无粥样斑块的部位则未见或仅见轻微的NF-κB的活化。张玉保等[8]研究显示经相关治疗干预后, 动脉粥样硬化病灶中, 能抑制NF-κB、VCAM-1的激活与表达, 从而有效抑制炎症, 且NF-κB及VCAM-1的表达呈正相关, 体现了NF-κB的重要调控作用。本研究显示, 在动脉粥样硬化组动脉粥样硬化内膜可见VCAM-1、MCP-1、NF-κB的表达明显高于正常组, 表明炎症因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1参与冠状动脉粥样硬化的形成和发展。
动脉粥样硬化根据其临床表现, 中医将其归属于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”、“中风”、“痰饮”、“脱疽”等范畴。本病病位在血脉, 与肝、脾、肾有关, 多为本虚标实。蔡光先教授根据多年的临床经验自拟护心康, 其药物组成为丹参、黄芪、瓜蒌皮、薤白、半夏、陈皮、茯苓、蒲黄、茜草、山楂、三七等十余味中药, 诸药合用, 体现了气、痰、瘀同治, 心肝脾共调的整体辨证思路[11,12]。
实验研究表明, 护心康能降低高血脂, 降低血清和动脉粥样硬化斑块中TNF-α的表达, 而抑制由此引发的血管壁炎性反应, 从而起到治疗冠心病的作用[11,12]。临床研究也表明, 护心康对痰瘀阻络型冠心病、心绞痛有较好的疗效, 能有效改善心绞痛的发作症状和心电图表现, 降低全血黏度, 同时提高患者的生存质量[13,14]。
此次实验显示护心康具有降低粥样斑块中NF-κB、VCAM-1、MCP-1蛋白表达的功效, 对VCAM-1、NF-κB的影响, 高、中剂量组明显优于低剂量组, 体现出剂量上的优势。由此可见, 护心康能够抑制斑块内炎性反应, 从而稳定动脉粥样硬化易损斑块, 并且与剂量有一定的相关性, 为护心康应用于临床提供更多有价值的微观研究依据, 其进一步的作用机制还在深入研究中。
核因子κB与肿瘤的关系 第5篇
1 NF-κB系统的组成
NF-κB家族和其抑制物IκB家族共同组成了NF-κB系统, 几乎在所有的组织细胞中都有NF-κB。最初发现NF-κB是由NF-κB1和Rel A这两个亚单位组成的异二聚体。目前发现NF-κB包括5种蛋白亚单位:Rel A (p65) 、Rel B、C-Rel、NF-κB1 (p50及其前体分子p105) 和NF-κB2 (p52及其前体分子p100) [2]。这些蛋白亚单位有约300个氨基酸组成的氨基末端, 具有高度的同源性, 称为Rel同源区 (rel homology domain, RHD) , 其作用是与DNA的特异性结合形成二聚体, 其上有核定位信号 (nuclear localization signal, NLS) , 又称核转移信号 (nuclear translocation signal, NTS) 。静息状态时, NF-κB的二聚体通常与其抑制物I-κBα在胞浆中结合成无活性的三聚体, 使基因转录得到抑制。当机体细胞受到外来因素刺激时, I-κBα迅速裂解, NF-κB二聚体被三聚体解体释放出, 胞浆中游离的NF-κB由p65蛋白亚单位上的NLS介导迅速进入到细胞核内, 参与一些基因的转录调节, 如参与细胞增殖、细胞凋亡和细胞炎性反应等, 促进相应蛋白的表达, 生成相应的m RNA。很多因素能使NF-κB活化, 如免疫受体、紫外线照射[5]、酶、饮酒[6]、各种应激性刺激、病毒、多种细胞因子、细菌黏多糖、氧自由基及吸烟[7]等。通过NF-κB的激活引起机体炎性反应及细胞凋亡生理病理等过程。研究表明, 在多种肿瘤的发生、发展、转移以及抗凋亡等过程中与NF-κB的关系密切, 这也为肿瘤的治疗提供了新的方向。
2 NF-κB在肿瘤细胞中的表达与激活
近年研究发现, NF-κB参与恶性肿瘤发生以及侵袭转移。NF-κB持续激活在某些肿瘤细胞中, 在多种肿瘤细胞中NF-κB高表达, 同时在多种肿瘤细胞中也会发现IκB的降解异常或突变失活, 然而在正常的细胞中没有改变, NF-κB可以被很多细胞和多种病毒的癌蛋白激活。细胞的恶性转移都需要NF-κB的激活, 突变的原癌基因Ras (rat sarcoma) 在多种肿瘤细胞中, 然而NF-κB又是其转化的关键中介因子, 因此NF-κB与肿瘤的关系极为密切。像人急性淋巴瘤细胞、胃癌等。在人急性淋巴瘤细胞中NF-κB蛋白表达升高是因为Ik K复合物被激活。在由HTLV-1诱发的人急性T淋巴细胞白血病中, HBV编码的X蛋白或HTLV-1编码的TAX蛋白能够使NF-κB迅速活化, 所以在病毒诱发的肿瘤过程中NF-κB起介导的作用。在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等肿瘤中IκB家族的Bcl-3基因高表达。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤中, 可见NF-κB1基因高表达。在头颈的鳞癌、胃癌及乳腺癌中可以见到Rel A的高表达。在大部分乳腺癌和结肠癌中, 可见NF-κB2基因的高表达。在卵巢癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、急慢性白血病和前列腺癌等多种肿瘤中, 发现NF-κB持续激活并且有IκB失活的现象。NF-κB可以促进基质金属蛋白酶 (matrix metallo proteinase, MMP) 、纤溶酶原激活物尿激酶 (urokinase-type plasminogen activator, uPA) 、细胞间黏附分子-1 (inter-cellular adhesionmolecules-1, ICAM-1) 及血管内皮生长因子 (vascular epithelial growth factor, VEGF) 等[8]的转录表达, 这些因子都是血管生成相关的因子, 因此NF-κB与肿瘤细胞关系密切。
3 NF-κB与肿瘤细胞抗凋亡与及耐药性
能够促使肿瘤细胞凋亡的药物, 在临床上是抗肿瘤药物的关键。研究表明, NF-κB高表达在肿瘤的耐药细胞株中, 因此NF-κB与肿瘤细胞抗凋亡及耐药性关系密切。NF-κB具有抗凋亡的作用, 主要是通过上调编码某些因子的表达, 如GM-CSP、M-CSF、IL-1、IL-2、IL3、IL-6、IL-12等[9]。因此在细胞凋亡过程中, NF-κB起着抗凋亡的重要作用。
目前, 化疗是治疗肿瘤的主要方法。化疗可以使DNA破坏, 化疗药物可以使肿瘤细胞凋亡, 同时NF-κB也会被激活, 因此, 抑制NF-κB的激活可以促进肿瘤细胞的凋亡。众多研究者发现在肿瘤细胞中, 如果抑制NF-κB可以促进其凋亡, 为肿瘤的化疗提供了一个新的方向[10]。在卵巢癌中, 发现被顺铂耐药了的卵巢癌细胞中NF-κB高表达[8]。在结肠癌中, 若把NF-κB抑制后, 发现可以使5-Fu (5F-d UMP) 的作用增强。用脱氢环氧甲基醌霉素 (DHMEQ) 在甲状腺癌中抑制NF-κB活性, 可以使甲状腺癌的生长得到抑制。他汀类药物也可以阻断NF-κB的激活主要是抑制IκB的磷酸化[11]。肿瘤细胞中, NF-κB对肿瘤耐药的形成与肿瘤细胞的凋亡受到越来越多人的注目。
4 NF-κB与肿瘤的治疗
随着人们深入对NF-κB的研究, 在肿瘤的发生与转移过程中, NF-κB起着重要的作用。针对NF-κB的活性与肿瘤的关系, 可以通过基因方法等使NF-κB的活性得到抑制, 进而阻断肿瘤细胞的生长, 使肿瘤的治疗效果得以提高。阻断NF-κB又可以减少肿瘤细胞的转移[12], 目前大部分肿瘤患者的不良预后主要是因为肿瘤的转移, 所以能够抑制肿瘤的转移被认为是肿瘤治疗中最有前景的。因此, 对NF-κB的研究受到越来越多的重视。对NF-κB的研究目前主要在靶向IKK。NF-κB信号通路能被IKK-α明显抑制[13], 靶向趋化因子的药物主要包括阻断性抗体和受体拮抗剂, 在肿瘤转移治疗上已经有了一定的疗效[14,15]。他汀类药物可以阻断NF-κB, 主要是通过对IκB磷酸化的抑制[16]。细胞因子中有些在临床上被批准用于肿瘤的治疗, 如GM-CSF、、IL-2、G-CSF、IFN-α、IFN-B和TNF-α等, 这些因子都已经被研究证实, 他们与NF-κB的关系密切, 他们是其激活因子或者是与其传导通路有关联[17]。在NF-κB的研究中, 发现NF-κB与妇科肿瘤关系极为密切。在宫颈癌中, NF-κB的活化异常。实验证明, NF-κB高表达在宫颈癌患者中, 尤其是在伴有盆腔淋巴结转移的Ⅲ~Ⅳ期[18]。宫颈癌的发生和宫颈癌的浸润转移都与高表达的NF-κB有关[19]。NF-κB在卵巢癌中也呈高表达, 实验结果说明, NF-κB p65在卵巢癌中的阳性率高于卵巢良性肿瘤和交界性肿瘤, 还发现与卵巢癌的临床分期以及转移有关, 卵巢癌的浸润和转移与MMP-9、HE4的上调有关, 可能是NF-κB p65作用的结果[20]。乳腺癌的发生于发展与血管内皮生长因子 (VEGF) 有关, 研究发现抑制NF-κB的活化进而能抑制肿瘤血管的生成。因此, 对NF-κB的抑制剂BAY 11-7082的研究受到越来越多的关注。据报道, NF-κB在子宫内膜癌中的表达明显高于子宫内膜[21]。在肝癌中, 胞嘧啶脱氨酶 (activation-induced cytidine deaminase, AID) 异常升高[22], 主要是因为TGF-β诱导核因子NF-κB信号通路的产生[23], AID可以使基因不稳定, 进而诱导其突变。因此抑制NF-κB或者抑制STAT3的二聚体化, 都可以使肝癌细胞的生长得到抑制[24]。在多种肿瘤中NF-κB的表达都增高, 因此对于肿瘤的治疗NF-κB提供了一个新的思路。
核转录因子κB 第6篇
许多实验研究发现, 在癫痫发病中, 核转录因子-κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB) 作为转录因子参与了急性炎症过程, 作为细胞因子参与了神经兴奋和/或神经胶质瘢痕的形成。因此, 本实验研究NF-κB在癫痫大鼠海马中的表达, 进而研究大针手法对癫痫大鼠神经NF-κB表达的调节作用, 对针刺治疗癫痫的作用机制进行研究, 为针灸临床治疗癫痫提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1实验动物
Wistar大鼠30只, 体重200g~250g, 雌雄各半, 由山西省中医药研究院中心实验室提供, 实验动物生产许可证号:SCXK (晋) 2010-0002, 实验动物使用许可证号:SYXK (晋) 2010-0002, 实验动物合格证号:0000014, 室温22℃~26℃室内, 湿度70%, 分笼喂养。
1.2试剂与仪器
氯化锂 (Lithium chloride, 美国Sigma公司) , 毛果芸香碱 (匹鲁卡品, Pilocarpine hydrochloride, 美国Sigma公司) , 水合氯醛 (Chloral hydrate, 天津市科密欧化学试剂有限公司) , 多聚甲醛 (Paraformaldehyde, 天津市化学试剂研究所) , 兔抗NF-κB多克隆抗体 (sc-372, 美国Santa Cruz公司) , 山羊抗兔IgG (sp-9001, 北京中杉金桥) , DAB显色试剂盒 (ZLI-9032, 北京中杉金桥公司) , 切片机 (德国莱卡RM2015) , 离心机 (北京离心机厂LDZ5-2型) , 电子天平 (瑞士METTER AE100型) , 移液器 (德国EPPENDORF) , 干燥箱 (日本三洋MIR-153型) , 低温冰箱 (日本三洋MDF-382E型) , 恒温水浴箱 (江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型) , 医用微波炉 (浙江临安爱迪仪器厂YWY781B型) , 显微镜 (日本OLYMPUS公司BX51T-PHD-J11) , 计算机图像处理系统CMOS (日本OLYMPUS公司) , 多功能真彩色细胞图像分析管理系统 (美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus) 。
1.3实验方法
1.3.1动物分组及模型制作
30只大鼠随机分为3组:空白对照组 (Α组) 、癫痫模型组 (Β组) 、大针手法组 (C组) , 每组10只, 雌雄各半。Α组:腹腔注射同等容量的生理盐水代替氯化锂和匹鲁卡品;Β组:腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24h后腹腔注射匹鲁卡品30mg/kg, 分3次注射, 每次间隔10min, 直至出现无间歇的癫痫持续状态;C组:腹腔注射氯化锂3mmol/kg, 24h后腹腔注射匹鲁卡品30mg/kg, 分3次注射, 每次间隔10min, 直至出现无间歇的癫痫持续状态。
参考Racine分级标准 (0级~V级) :0级, 正常;Ⅰ级, 湿狗样颤动, 面肌痉挛, 如眨眼、动须、节律性咀嚼等;Ⅱ级, 节律性点头;Ⅲ级, 前肢阵挛;Ⅳ级, 站立伴双侧前肢阵挛;Ⅴ级, 跌倒失平衡, 四肢抽动。B组、C组大鼠诱导出Ⅳ级~Ⅴ级癫痫持续状态 (SE) 且SE发作持续1h视为造模成功, SE发作持续1h后, 予大鼠腹腔注射10%水合氯醛 (300 mg/kg) 终止发作, 若注射水合氯醛30min后未终止发作, 予150mg/kg重复注射, 直至终止发作 (以3次为最高限) 。记录大鼠行为学变化。
1.3.2治疗方法
Α组、Β组不做任何治疗;C组用1寸不锈钢针, 针刺大鼠督脉穴:风府、大椎、陶道、无名 (2~3胸椎棘突之间) 、身柱 (取穴参照《实验针灸学》中大鼠的穴位) , 每日1次, 每次20min, 中间行针1次, 平补平泻, 治疗14d。
1.3.3海马取材
针刺14d后, 第15天时对大鼠脑组织进行取材。各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射, 每只1mL, 过度麻醉, 迅速剪开胸腹腔, 暴露心脏肝脏, 先经左心室快速灌注4℃生理盐水300mL (灌注针由左心室进针穿入主动脉, 止血钳固定, 剪破右心耳, 快速灌注生理盐水300 mL) , 后接含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS, 0.1 mol/L, pH=7.4) 300mL, 先快后慢, 灌注固定, 大鼠迅速出现四肢颤动, 颈部变硬, 尾部变硬伸直, 待大鼠全身僵硬后, 迅速断头开颅取脑, 将修整后的脑组织置于4%多聚甲醛中, 4℃冰箱保存。24h后, 将大鼠脑组织移入含20%蔗糖的0.1molPB溶液 (磷酸盐缓冲液, pH=7.4, 4℃) 中至沉底。待脑组织下沉后, 每个大脑半球于背侧海马最大断面处, 切取3 mm厚的组织, 制成石蜡包块, 再做冠状切片, 厚度为4μm (冰冻切片机切取) , 每只大鼠切取4张切片, 贴于经明胶处理过的载玻片上。
1.3.4 HE染色
石蜡切片经常规脱蜡入水后, 在苏木素溶液浸染10min, 1%盐酸酒精分色3s~5s (当深蓝紫色变为淡粉色则中止) ;氨水反蓝5min (由淡粉红色变为淡蓝色) , 自来水冲洗, 终止反应, 镜下观察, 细胞核清晰染色呈蓝紫色, 细胞浆及其他背景基本无色即可。伊红溶液染色5min, 自来水冲洗, 镜下观察, 细胞浆呈红色, 细胞核蓝色即可。随后经梯度乙醇脱水 (从低浓度到高浓度, 70%乙醇, 80%乙醇, 90%乙醇, 100%乙醇, 每级5min) , 每次2min, 二甲苯透明2次, 每次10min, 最后用中性树胶封片。光镜下观察大鼠海马神经元形态学改变。
1.3.5免疫组化染色
切片常规脱蜡至水, 3%双氧水室温下作用10min后, 以蒸馏水冲洗3次, 每次30s, 滴加复合消化液, 室温下作用10min, 以蒸馏水冲洗3次, 每次30s, 滴加正常山羊血清封闭液室温20min, 甩去多余液体, 吸水纸吸取多余水分, 滴加兔抗鼠NF-κB多克隆抗体 (1∶50) , 4℃过夜;取出后自然复温30 min, PBS (pH7.4) 冲洗3次, 每次5 min;滴加生物素标记山羊抗兔IgG (1∶100) , 37℃孵育20min, PBS (pH7.4) 冲洗3次, 每次3min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液 (1∶100) , 37℃孵育20 min, PBS (pH7.4) 冲洗3次, 每次3min;DAB显色:使用DAB显色试剂盒内AB试剂各一滴, 混合后加至切片。室温下显色, 镜下控制反应时间, 约5 min~20min。然后用蒸馏水充分冲洗。苏木素复染。乙醇梯度脱水 (70%乙醇, 80%乙醇, 90%乙醇, 100%乙醇, 每级5min) 。二甲苯透明5min, 中性树胶封片, 晾干即可。每张切片测5个视野, 以人机交互方式, 由计算机计算出每个视野的NF-κB P65阳性细胞数及平均光密度, 取其平均值。计算机图像处理系统由CMOS及多功能真彩色细胞图像分析管理系统组成。
1.3.6主要观察指标
各组大鼠造模过程中行为学变化;各组大鼠海马神经细胞病理改变;各组大鼠海马神经NF-κB P65表达的变化。
1.4统计学处理
采用SPSS17.0统计软件对NF-κB P65阳性细胞数进行统计学分析。实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1各组大鼠行为学观察
A组大鼠腹腔注射生理盐水后, 行为活动无异常, 无死亡。B组和C组大鼠腹腔注射氯化锂 (3mmol/kg) 后, 所有大鼠行为活动均无异常, 24h后, 腹腔注射匹鲁卡品 (30mg/kg, 分3次注射, 每次间隔10min) 2次或3次后, 2min~15min内, 大鼠逐渐出现外周胆碱能反应:立毛、流涎、颤抖、流血泪, 同时或先后出现刻板行为:凝视不动、咀嚼、吸鼻或探索行为、湿狗样震颤、反复头颈上仰, 随后出现眨眼、面肌痉挛、点头, 口吐白沫, 嘴唇、四肢皮肤发绀, 甚至大小便失禁, 最后出现反复双侧前肢阵挛伴直立、跌倒或翻转, 部分动物出现四肢强直-阵挛发作。开始发作尚不频繁, 随着时间延长, 发作频率增高, 全部达到Ⅳ级~Ⅴ级癫痫持续状态。SE状态1h后, B组和C组大鼠腹腔注射10%水合氯醛 (300mg/kg) 终止发作。终止发作后, B组死亡1只, 存活率90%, C组死亡1只, 存活率90%, A组存活率100%。B组与A组存活率比较, 差异无统计学意义;C组与A组存活率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。详见表1。
2.2各组大鼠海马神经细胞的病理改变
经HE染色后, 光镜下观察海马组织病理改变:A组海马CA1区神经元结构正常, 排列整齐, 形态完整, 细胞核圆或椭圆形, 规则, 核膜清楚完整, 染色质分布均匀, 胞质内可见尼氏小体, 核仁清晰可见。B组海马CA1区神经元排列不整齐, 正常神经元数量显著减少, 细胞间隙增大, 部分神经元形态不完整, 核膜结构不清楚, 细胞核开始出现固缩, 核仁不明显, 胞浆浓缩深染, 呈空泡样变, 大部分细胞尼氏体消失, 还可见变性坏死的神经细胞。C组海马CA1区神经元排列较整齐, 接近正常, 正常结构的神经元较多, 大部分神经元细胞核、核膜结构清楚, 少部分细胞尼氏体消失或胞浆浓缩深染, 变性或坏死的细胞较少, 损伤程度较癫痫模型组轻。
2.3各组大鼠海马NF-κB P65阳性细胞数的表达
免疫组化结果:A组大鼠海马CA1区, 棕黄色的NF-κB P65阳性反应物在胞浆、胞核染色非常弱, 且几乎都分布于胞浆中, 胞核中的阳性物质很少甚至没有。B组大鼠海马CA1区可见很多NF-κB P65阳性细胞表达, 神经元细胞核、胞浆内棕黄色的NF-κB P65的阳性反应物染色较正常组明显加深, 多呈团块状分布, 且胞核内染色较胞浆深。C组大鼠海马CA1区可见较少NF-κB P65阳性表达细胞, NF-κB P65阳性反应物在胞核、胞浆棕黄色染色非常浅, 在胞核内的棕黄色染色较癫痫模型组染色浅, 接近空白对照组, 未见棕黄色染色团块状分布。详见表2。
3 讨论
目前, 对癫痫的发病机制尚未完全明了, 在治疗癫痫方面, 所有的抗癫痫化学药物都有不良反应。因此, 探寻防治癫痫的新途径、新方法具有重要的意义。针灸治疗癫痫早在《内经》中就有记载, 也是现在临床上较为有效的办法。针灸治疗癫痫选穴多样, 但总的是以任、督穴位为多。彭光超[1]取穴鸠尾、筋缩、腰奇、间使、丰隆, 痰热较盛加太渊;肝热加太冲;体弱加足三里, 痊愈34例, 显效10例, 好转4例, 无效6例。张智龙[2]用意气行针法治疗癫痫35 例, 取丝竹空、三阴交、太冲、阴陵泉、阳陵泉、丰隆、内关 (均双侧) 、鸠尾、关元, 从头到足依次取穴, 针丝竹空得气后密切注意守气勿失, 拇指向前捻转180°, 紧捏针柄不动, 意守针尖, 以意聚气, 待针下有跳动感时, 以意行气, 余穴用平补平泻法, 痊愈25例, 显效7例, 好转2例, 无效1例, 总有效率97.14%。翟文生等[3]用醒脑开窍针法治疗60 例, 治愈9例, 显效18例, 好转30例, 无效3例。许永迅[4]采用芒针治疗102例, 大椎透灵台, 至阳透筋缩, 脊中透命门, 腰奇透长强, 神庭透囟会, 百会透后顶, 璇玑透膻中, 鸠尾透中院、内关 (双) 、丰隆、太冲、双侧顶颞前斜线, 显效54例, 有效25例, 效差10例, 无效13例。
已有研究表明, 针刺可对癫痫动物中枢神经的脑电活动、神经递质、环核苷酸等产生影响[5], 张颖[6]研究了针刺对电刺激癫痫大鼠模型的作用, 发现针刺可显著降低癫痫大鼠的放电平均波幅、放电最高波幅及放电频率, 提高其脑电基本频率, 说明针刺可显著抑制痫性放电、控制癫痫发作。杨帆等[7]发现大鼠癫痫模型组脑内兴奋性氨基酸天门冬氨酸、谷氨酸升高明显, 而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸明显降低, 经电针百会、风池后 γ-氨基丁酸、丙氨酸明显升高, 而谷氨酸降低明显。杨帆等[8]用戊四唑 (PTZ) 制作的点燃型癫痫大鼠模型海马结构内环磷腺苷 (cAMP) 、环磷鸟苷 (cGMP) 含量均有增加, 其中cGMP增加非常明显, 经电针百会、风池、风府后cAMP、cGMP含量均明显降低, 电针对PTZ点燃型癫痫大鼠海马结构内cAMP、cGMP含量的改变有一定的调节作用, 对cAMP的调节迅速但持续时间短, 而对cGMP的调节缓慢而持久。
NF-κB在癫痫发病机制中的作用也是目前研究热点之一, NF-κB是一种重要的核转录因子, 参与真核细胞多种基因的表达调控, 影响细胞的许多生物学功能[9], 其活化形式通常是P50和P65, 当细胞处于静息状态时, NF-κB和其抑制因子IB结合存在于细胞质中, 当细胞受到各种刺激后, 许多实验研究发现, 在癫痫发病中, NF-κB作为转录因子参与了急性炎症过程, 作为细胞因子参与了神经兴奋和/或神经胶质瘢痕的形成。Blon-deau研究发现, 海人藻酸可快速增加NF-κB与DNA的连接活动度, 使其亚单位产生核移位, 认为NF-κB活化作为癫痫发病机制的基础信号转导通路的一个关键步骤[10]。Matsuoka等[11]利用大鼠海人藻酸点燃模型发现痫性发作后4h~16h内海马神经元NF-κB活化明显增加, 并伴胶质细胞NF-κB持续活化。Crespel利用合并海马硬化的颞叶癫痫患者术后病理切片进行免疫组化分析发现, 胶质细胞和大脑锥体细胞NF-κB/P65过度表达, 并推测癫痫形成过程是由NF-κB介导的炎症反应过程, 其过程是一个被痫样发作反复、短折激活的慢性过程[12]。
用大针手法治疗癫痫是我院针灸专家冯尚武和郭耀康老师在长期的临床工作中, 发现的一种治疗癫痫的针刺方法, 疗效确切, 已得到临床验证。此法是用21号、长3寸~4.5寸的不锈钢针, 针刺督脉穴的风府、大椎、陶道、无名 (胸椎2~3之间) 、身柱。操作时, 先用捻转法进针, 当针尖到达两椎骨棘突之间时, 改用缓慢推进法 (不捻转慢慢向前推进) , 约当针尖达脊髓腔时, 其方向为:若针风府穴, 须使针和耳垂成水平线, 缓慢推进;若针大椎、陶道、无名、身柱, 均按45°~60°角向斜上方缓慢推进 (注意:不可用力过猛, 更不可行捻转捣刺术) 。针到适应处时, 患者常尖叫一声, 全身抽动一次, 此时立即停止针刺, 患者意识不清的可能稍转清醒, 有的可出现胸部灼憋闷, 全身发麻发软, 颜面苍白, 瞳孔散大, 全身肌肉松弛, 出冷汗等症状, 属正常反应, 可留针15min~30 min。若在针刺狂躁厉害或体格强壮的患者时, 未出现上述诸症之一者, 可再行抽刺, 抽刺时一般采用扇形往两侧抽刺, 每抽刺一下, 患者的腿随即跳动一下, 抽刺后有的患者可出现双下肢的暂时性瘫软, 一般在1h~2h后即可恢复, 必要时可架扶慢慢行走或适当休息。另外, 如患者体质比较虚弱, 可选用26~28号针进行针刺, 以减少刺激。
核转录因子κB 第7篇
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源
佳木斯大学口腔医院病理科2005～2008年皮肤血管瘤组织蜡块标本42例,其中男13例,女29例,年龄4个月～50岁,平均11岁;这些血管瘤所在的部位包括唇、耳下、颈部、背部、颞下、腮腺和颊部的皮肤。患者术前均未做任何辅助性治疗;患处术前未见破溃。另取5例正常皮肤组织做对照。
1.1.2 标本分组
常规病理切片,厚度5μm,常规HE染色和免疫组织化学两步法检测增殖细胞核抗原(Ki-67),按Mulliken[1]分类标准并结合ki67的表达进行分组。增生期血管瘤27例,退化期血管瘤15例。
1.2 主要试剂
兔抗人CD31单克隆抗体(abcam,货号ab59251,1:200稀释),即用型兔抗人Ki-67单克隆抗体(Zymed公司,货号za0502),NF-kB p65(Santa cruz 提供,货号sc-372,1:80稀释),兔抗人Angiopoitin-2抗体(武汉博士德提供,货号BA1530,1:100稀释),S-P通用型免疫组织化学两步法试剂盒、DAB、PBS磷酸盐缓冲液:北京中杉公司提供。
1.3 方法
免疫组织化学两步法检测NF-κB p65、Ang-2、CD31和Ki-67抗原。主要步骤: 5μm组织切片常规脱蜡至水化,Ang-2、NF-κB p65、CD31、Ki-67采用微波抗原修复,3%H2O2处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性,正常山羊血清处理30min以减少非特异性染色背景,一抗(NF-κBp65,Angiopoietin-2;CD31;Ki-67) 4℃孵育过夜,生物素标记的二抗37℃处理30min,DAB显色液显色,自来水冲洗终止反应,苏木精复染,脱水,透明,封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
NF-κB p65以胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应;Ang-2蛋白主要表达于细胞的胞浆和(或)胞膜中,阳性反应为颗粒或线网状黄色至棕黄色;CD31阳性反应呈现棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇;Ki-67以细胞核出现棕褐色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外,应无棕黄色或褐色反应物。
1.5 统计学处理
数据分别应用 Medcalc软件进行统计分析,用χ2检验,等级相关用Spearman等级相关检验等统计学方法,P<0.05具有统计学意义。
2 结果
①HE染色增生期血管瘤组织中可见条索状或团块状内皮细胞增生,其间有不规则的内皮间隙和完整的血管腔,内皮细胞核肥大而淡染。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞减少,血管腔增大,血管间结缔组织增多,内皮细胞核扁平。
②NF-κB p65的表达增生期血管瘤内皮细胞胞浆和内皮细胞胞核内有较多棕黄色颗粒,NF-κB p65表达强(图1);退化期血管瘤内皮细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积,胞核内无棕黄色颗粒沉积, NF-κB p65表达极弱或无表达(图2);正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积,胞核内无棕黄色颗粒沉积,NF-κB p65表达极弱或无表达。经单因素方差分析,增生期与退化期及正常组之间的差异有显著性意义(P<0.05),退化期与正常组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
③Ang-2蛋白主要定位于胞浆或胞膜中,为淡黄色至棕黄色颗粒或线网状。增生期血管瘤内皮细胞胞浆或胞膜有较多棕黄色颗粒, Ang-2表达强(图3);退化期血管瘤内皮细胞内有少许或无棕黄色颗粒沉积,Ang-2表达极弱或无表达(图4);正常皮肤组织血管内皮细胞内有少许或无棕黄色颗粒沉积, Ang-2表达极弱或无表达。经单因素方差分析,增生期与退化期及正常组之间的差异有显著性意义(P<0.05),退化期与正常组之间差异无显著性意义(P>0.05)。
④CD31蛋白定位血管内皮细胞呈现棕黄色或棕褐色的单个血管内皮细胞或细胞簇。计算血管瘤微血管密度,统计p65、Ang-2与Ki-67的值。见表1～2。
注:P为增生期与消退期相比较 。
3 讨论
核转录因子NF-κB是1986年由美国麻省理工学院癌症研究中心的Baltimore和麻省Whitehead生物医学研究所的Sen[2]在成熟B细胞和浆细胞中发现的能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列(5′-GGGACTTTCC-3′)特异结合蛋白,并能促进κ轻链基因的表达,并将其命名为NF-κB(Nuclear factor κappa B)。当细胞受到炎症、紫外线、病毒感染等因素激活细胞外信号刺激时,IκB从NF-κB复合体上脱落,IκB迅速被分解激活NF-κB,活化的NF-κB进入细胞核,与细胞核内特定的靶基因的结构域结合,引起相应基因的转录。NF-κB P65被活化并上调与肿瘤发生及进展阶段相关的基因,影响细胞增殖和凋亡,从而导致肿瘤的发生。
本研究结果证实,NF-κB p65在血管瘤增生期的表达处于较高水平,而在血管瘤的退化期NF-κB p65的表达降低。我们分析NF-κB p65可能与血管内皮细胞的增生活跃状态有关。处于增生期的血管瘤组织中NF-κBp65处于活化的状态,从而促进血管内皮细胞的增殖以及血管瘤的形成。而且NF-κB与血管形成相关因子TNF-α,IL-8和VEGF之间存在调控关系。本研究用免疫组化法检测血管瘤内皮细胞中Ki-67抗原的表达,结果显示血管瘤中增殖期Ki-67表达明显高于消退期,差异具有显著性,说明增生期内皮细胞的增殖活性要高于消退期。我们的研究证实了NF-kBp65与Ki-67在血管瘤发展过程中存在正向相关性,为NF-kBp65可能成为血管瘤分期标记提供依据。
血管生成素-2(Angiopoietin-2)作为血管生成素家族之一,是一种多功能活性肽。实验表明,在肿瘤生长过程中,Ang-2在血管新生中的作用是允许性的,所以单独的Ang-2并不刺激血管的生长,只是调节内皮细胞和周围支持细胞对VEGF的反应。在本研究中,Ang-2在增生期血管瘤中高表达,而在消退期血管瘤中表达低及正常组织中表达较低或无表达;结果与Yu等[3]的研究发现婴儿期血管瘤内皮细胞Ang-2、Tie2、VEGF呈高表达相吻合。我们的解释是在增生期,Ang-2上调,Ang2可以加强VEGF的促血管生成作用,诱导血管出芽,血管重建;同时,也由于Ang2高表达,血管内皮细胞处于高度不稳定状态,因而导致Ang1、Ang2分泌调节环路失衡,破坏了原来的动态平衡,如此就为新生血管提供了生存空间。在消退期,由于血管瘤进入消退期后,在没有VEGF等生长因子存在的条件下Ang-2阻断Ang1 稳定血管的作用,使血管退化,血管数目减少。而对血管瘤中VEGF的表达情况早就有报道,VEGF在增生期血管瘤中高表达,而在消退期血管瘤中很少表达。本实验结果提示Ang-2参与并促进血管瘤的形成;而NF-kBp65与Ang-2在血管瘤发展过程中呈正向相关性提示在血管瘤发展过程中NF-kBp65可能正向调节Ang-2促血管瘤发展。
本研究对NF-kBp65,Angiopoietin-2,CD31和Ki-67的在血管瘤组织中表达情况及其相互关系研究表明,NF-kBp65与Angiopoietin-2呈正相关,可能为我们对研究血管瘤的发病机理及临床药物治疗提供新的思路。NF-kBp65的促进细胞增殖的能力及在血管瘤中与Ki-67的正相关性说明NF-kBp65可能成为评价血管瘤的一种新的病理分期标记物。
参考文献
[1]Mulliken JB,Glowacki J.Hemangiomas and vascular malformations in infants and children:a classification based on endothelial characteristics[J].Plast Reconstr Surg,1982,69(3):412-422
[2]Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear interact with theimmunoglobulin enhancer sequences[J].Cell,1986,46(5):705-716
