高效逆转录抗病毒治疗（精选5篇）

高效逆转录抗病毒治疗 第1篇

1临床资料

1. 1诊断标准西医诊断参照中华人民共和国卫生部2008年制定的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准及处理原则》; 中医诊断符合《中医药治疗艾滋病项目临床技术方案》,辨证为气血亏虚型。

1. 2纳入标准1) HIV抗体确认阳性,CD4+T淋巴细胞 < 350个 / μL,入组前未接受过HARRT治疗且3个月内未接受中药治疗者; 2) 年龄18 ~ 65岁; 3) 中医证型为气血亏虚者; 4) 签署服药知情同意书。

1. 3排除标准急性感染期,孕妇或哺乳期妇女,吸毒人员或正在接受戒毒治疗者,伴有心肝肾等重要脏器功能障碍者,有严重精神疾病者,存在机会性感染者,

1. 4一般资料选择2012年1月 - 2012年12月本院感染科收治的AIDS病人45例,按随机方法分为观察组15例,均为男性,平均年龄( 35. 3 ± 4. 5) 岁; 对照组30例,均为男性, 平均年龄( 36. 5 ± 3. 5) 岁。两组资料比较无统计学意义( P > 0. 05) ,具有可比性。

2方法

2. 1治疗方法观察组患者HARRT治疗的同时予口服八珍汤( 主要成分当归、川芎、白芍药、熟地黄、人参、白术、茯苓、甘草) ,每日1剂; 对照组仅予HARRT治疗。两组患者HARRT治疗药物均为国家艾滋病免费抗病毒药物,HARRT治疗方案包括: 1) AZT + 3TC + EFV; 2) AZT + 3TC + NVP。方案根据患者病情制定。两绷均治疗12个月。

2. 2观察指标治疗期间每3个月监测1次肝功能、血常规及CD4+淋巴细胞计数; 每个月观察患者的临床症状体征、 卡洛夫斯基积分[1]变化。

2. 3统计方法应用PASW Statistics 18统计软件,计量资料采用独立样本t检验和重复测量资料的多元方差分析; 计数资料采用 χ2检验; P < 0 < 0. 05为有统计学意义。

3结果

3.1两组患者治疗前后症状、体征积分见表1。

与本组治疗前比较* P < 0. 05; 与对照组治疗后比较△P < 0. 05

3.2两组患者治疗前后卡洛夫斯基积分比较见表2。

与本组治疗前比较* P < 0. 05

3.3两组患者治疗前后CD4+T淋巴细胞计数变化见表3。

与本组治疗前比较* P < 0. 05

3.4两组患者副作用比较见表4。

△P < 0. 05

高效逆转录抗病毒治疗 第2篇

1症状表现特点研究

HAART治疗后IRS伴肺结核者均在HAART治疗中出现不同程度和类型的感染现象、炎性反应, 且不符合获得性感染特性以及机会性感染原理, 与药物不良反应无关[2]。

从目前国内外的相关治疗数据及IRS、肺结核观察统计结果看来, 所有的HAART治疗后IRS伴肺结核者均有发热现象[3], 70%患者中等以上发热, 且不规则, 无寒战及畏寒现象, 接近30%的患者存在轻微结核中毒现象, 30%左右患者偶有咳嗽现象, 10%左右患者可见颈部淋巴结肿大[4]。

艾滋病患者HAART治疗后会进入免疫功能恢复阶段, 此阶段出现系列潜伏感染、发热、原有感染恶化加重等临床综合征, 难以区分是否是机会感染[5]。由于结核分歧杆菌多为潜伏感染, 抗病毒治疗后就可能出现HIV与结核分歧杆菌双重感染, 进而诱发结核病, 但此种现象出现率远低于治疗前便存在结核分歧杆菌感染者[6]。抗病毒治疗过程中, 药物作用刺激了免疫功能的增强, 短时间激活大量结核菌免疫反应[7], 但此时的集体刚好处于免疫紊乱、失调阶段, 可以发现明显的临床症状表现[8]。此种现象在免疫重建过程中出现, 就会表现出以下临床现象:中等以上发热, 不畏寒、无寒战, 体温变化不规律, 发热时及退热后无明显不适感[9];无明显的呼吸道症状, 偶有干咳等轻微表现, 少痰或无痰, 可见局限性肺部结节病灶, 偶有渗出性病灶及干酪性病灶;鲜有明显结核中毒症状[10]。

2临床检查特点研究

HAART治疗后IRS伴肺结核者均需接受实验室检查与影像学检查诊断和分析[11]。12%左右的治疗后IRS伴肺结核者痰结核菌涂片呈阳性, 15%左右痰结核菌培养结果呈阳性[12];多数患者抗病毒治疗前血红蛋白在90 g/L之内、血常规白细胞计数在4×109/L之内, CD4+T细胞计数在15 cell/μl~125 cell/μl[13];抗病毒治疗后仅有20%患者白细胞计数在4×109/L之内, 33%左右患者血红蛋白水平<90g/L, CD4+T细胞计数在36 cell/μl~218 cell/μl范围内, 抗病毒治疗后结核菌素试验结果阳转阴, 但对于CD4+T细胞计数<200 cell/μl者无意义[14]。另外, 约有10%患者治疗后PPD结核菌素试验结果呈阳性[15]。在肺结核诊断方面, 可灵活选择辅助实验室检查手段, 所有患者均需要留取痰标本, 无痰、少痰者诱导排痰以获取标本, 痰抗酸杆菌涂片及实验室培养观察检验, 或可行支气管镜检查、留取灌洗液检查分析[16]。实验室检查细菌学呈阳性的患者确认为肺结核;颈淋巴结病理活检也可作为肺结核感染的依据, 抗结核治疗观察病灶吸收情况, 若好转即确诊发生肺结核病变[17]。若实验室检查显示痰液标本呈阴性, 抗真菌、抗炎治疗无效, 诊断性抗结核治疗见效, 即为肺结核[18]。

影像学检查方面, 怀疑HAART治疗后IRS伴肺结核者多要接受胸部X线、肺部CT等影像学检查。治疗后上述检查显示, 35%左右的患者存在纵膈淋巴结肿大, 20%的患者可见空洞病灶, 40%左右患者存在结节状病变[19];极少数患者会发现干酪性病变。影像学检查发现的病变范围为:近半数患者累及1个肺段, 30%患者累及2个肺段, 20%左右患者累及3个或多个肺段。IRIS伴肺结核主要发生于患者严重免疫抑制后快速免疫重建的情况下, 有研究表明, 低基线CD4+T细胞计数与快速病毒学反应和机会性感染后过早的抗病毒治疗均是发生IRS伴肺结核的高危因素[20]。IRS伴随肺结核的出现直接决定于Th1细胞数量的激素增加, CD4+T细胞计数越低, 则对应的抗病毒治疗后IRS伴肺结核出现几率越高, 且此病变并没有直接的年龄与性别干扰因素。

3结语

艾滋病IRS指的是病患在HAART之后, 在自身免疫功能进行恢复过程中出现的一种临床综合症状。该症状和机会性感染极易混淆。相关报道表明, 病患在发生HAART之后, 合并发生IRS感染的几率最高, 其概率有68.8%之多。另一组调查数据还表明, 病毒的恢复控制较为理想的病患更加容易患上和结核杆分歧菌感染相关的IRS症状, 从这两项报道中我们能够发现, 虽说HAART能够对艾滋病病患自身免疫功能修复达到重建功能, 但从实际情况来看, 结核性IRS仍然是HAART所面临的重要问题。

结核杆菌的感染方式为潜伏感染, 集合分歧杆菌和HIV双重感染的病患其结核病发生概率约为30%, 这项数据远远高于HIV阴性结核病患的10%以下。

高效逆转录抗病毒治疗 第3篇

关键词：水芹总酚酸,HIV逆转录酶,酶联免疫

水芹是我国的传统中药,文献报道水芹具有良好的保肝降酶退黄作用[1]。研究表明,水芹总酚酸(total phenolics acid extracted from Oenanthe Javanica,OJTPA)是水芹的有效成分之一,体内外实验均表明其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制有较强的抑制作用。水芹总酚酸能够有效抑制HepG22.2.15细胞的HBV DNA、共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)以及乙肝病毒e抗原(HBeAg)水平[2]。此外,在以感染鸭乙肝病毒(duck hepatitis B virus,DHBV)的北京雏鸭为模型的试验中,OJTPA同样能够有效抑制DHBV的复制[3]。由于某些具有抗HBV活性的药物,例如:拉米夫定(Lamivudine,LAM)、替诺福韦(Tenofovir,TDF),同时能够抑制人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的复制,因此本研究通过HIV逆转录酶抑制剂酶联免疫的测定方法探讨OJTPA对HIV逆转录酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 药物

OJTPA:解放军第三〇二医院药学部制备(批号:110415)。奈韦拉平(NVP上海迪赛诺制药有限公司,批号:DH027-4-0409016)。

1.2 试剂

二甲基亚砜(Sigma公司,批号:10040214),DTT(Ameresco公司,批号:2502C321),Poly A(Roche公司,批号:12167321),PNPP(Sigma公司),DUTP(上海生工合成),DTTP(Takara公司,批号:CB6901A),Oligo(dT)15(由大连宝生物工程有限公司合成),小牛血清白蛋白(BSA北京中美转导科技公司),HIV逆转录酶(Calbiochemn公司,批号:D00103344),Tris(北京Biodee公司),碱磷酶标记链亲和素(APS,中山金桥公司),MgCl2·6H2O、KCl、NaOH(均为北京化工厂产品)。

1.3 仪器

低温高速离心机(SIGMA 3-18K),电子分析天平(上海宇恒平科学仪器),96孔细胞培养板(丹麦NUNC公司),酶联仪(美国BIO-RAD),漩涡混匀器(海门其林贝尔仪器制造),恒温水浴锅(Grant公司)。

1.4 方法

1.4.1 Oligo(dT)15包被板的制备

将Oligo(dT)15溶于100 mmol/L的1-甲基-咪唑的盐酸缓冲液中(pH 7.4),加入96孔酶标板中,与水溶性碳化二亚胺混匀,于50℃水浴中反应4 h,反应结束后用洗液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5)洗3遍,除去未结合的Oligo(dT)15,将包被后的96孔板置4℃保存。

1.4.2 药液的配制

水芹总酚酸用DMSO和PBS配成10、1、0.1 mg/L的药液,阳性对照药奈韦拉平(NVP)用DMSO和PBS配成50、10、1μmol/L的药液。

1.4.3 HIV逆转录酶活性检测

1.4.3.1将药液分别加入到用PBS洗过的96孔培养板中,每孔10μL,每浓度3孔。反应体系如下:70μL的RT Buffer,20μL含逆转录酶的PBS溶液,使反应系统总体积为100μL[其中含50 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3,3 mmol/L MgCl2,75 mmol/L KCl,5 mmol/L DTT,0.13 mg/mL BSA,10μg/mL poly(A),0.75μmol/L biotin-11-Dutp,1.5μmol/L dTTP及适量酶]。1.4.3.2 37℃水浴1 h,用洗液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,0.15 mol/L NaCl,0.05 mmol/L MgCl2,0.02%Tween20)清洗3次,除去未结合的游离底物,再每孔加入100μL 1%BSA,室温封闭30 min,阻止生物素与链亲和素蛋白的非特异性结合,洗板,每孔加入50μL的SA-ALP稀释液(100 ng/mL),37℃水浴1 h,洗板,每孔加入50μL PNPP(1 mg/mL,pH 9.5),37℃水浴30 min;每孔加入0.5 mol/L的NaOH终止反应。1.4.3.3酶标仪测定405 nm波长处OD值,以确定HIV逆转录酶的活性,同时设置不加药物的空白对照组,计算实验孔OD值/空白对照孔OD值(P/N值)。实验按以上方法重复一次作为第二批实验。

1.5 数据处理

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,组间均数比较采用单因素方差分析。抑制率按以下公式计算:

2 结果

实验结果表明,OJTPA对HIV逆转录酶有显著的抑制作用。抑制率随着药物浓度的增大而升高,OJTPA高、中、低剂量组对HIV逆转录酶的平均抑制率分别为85.20%、73.67%、55.83%,与空白对照组比较差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表1。

3 讨论

自1981年美国发现首例艾滋病以来,研究人员对艾滋病毒以及抗艾滋病毒治疗方法进行了广泛深入的研究。明确了HIV复制周期包括病毒的吸附与穿透、逆转录与整合、蛋白的翻译加工等关键阶段[4]。针对病毒复制的环节,不同作用靶点的抗HIV药物也相继而生。目前,临床应用的抗HIV药物主要包括以下几种类型:(1)病毒进入抑制剂(恩夫韦肽、麦瑞韦若克);(2)核苷类逆转录酶抑制剂(地丹诺辛、司他夫定);(3)非核苷类逆转录酶抑制剂(奈韦拉平、地拉韦定);(4)蛋白酶抑制剂(沙奎那韦、安普那韦);(5)整合酶抑制剂(雷特格韦)[5,6,7]。虽然这些药物的作用机制不尽相同,但临床应用的结果表明以上这些药物均能够抑制病毒的复制,降低病毒载量从而使得艾滋病的流行得到控制,感染者的生命延长[4]。但是,随之而来的不良反应及耐药问题也十分棘手。例如,目前临床应用的8种核苷逆转录酶抑制剂无一例外地诱发了耐药株的产生,并且有交叉耐药现象;HIV蛋白酶抑制剂的使用还会导致患者的肝功能异常、发热等不良反应[8]。因此,研发有效且毒副作用小的抗HIV药物仍然是药学工作者的重要任务。

注:与空白对照组比较,*P<0.01;“-”表示无数据

众所周知,中药是一个丰富的资源宝库,近年来,国内越来越多的抗艾滋病毒药物的研究者也将目光投向了中草药。研究表明,野菊花、知母、黄柏、射干等中药具有抗HIV蛋白酶等作用[9,10]。此外,黄芪、薏苡仁等药物能够通过增强机体免疫达到治疗艾滋病的作用[11,12]。

水芹是一种常见中药,《神农本草经》和《本草纲目》均记载水芹的保肝退黄等作用。现代研究发现,水芹的抗乙肝病毒活性也比较显著,体内外实验结果表明其有效成分OJTPA能够抑制HBV DNA或DHBV DNA的复制[13,14]。此外,小鼠抗疲劳实验结果表明OJTPA能够通过增加能源储备、提高SOD活力等方式达到抗疲劳的作用[15]。但O-JTPA对HIV逆转录酶的作用还鲜有报道,本研究旨在探讨其对HIV逆转录酶活性的影响作用。

不同于黄芪、甘草等中药是通过增强免疫来达到治疗艾滋病的效果,本研究通过酶联免疫的方法证明了OJTPA是一种作用较强的HIV逆转录酶抑制剂[16]。10μg/m L OJTPA对HIV逆转录酶的平均抑制率为85.20%。以往用于筛选HIV逆转录酶抑制剂多采用3H掺入法,但由于这种方法需要使用同位素,因此限制了其广泛应用。在本实验中采取的酶联免疫法测定药物对HIV逆转录酶的活性是一种比较新颖的筛选HIV逆转录酶抑制剂的方法,这种方法不仅能避免实验过程中同位素的使用,而且高效、特异性好[17,18]。

高效逆转录抗病毒治疗 第4篇

关键词：ARLTS1,逆转录病毒载体,肝癌细胞

ARLTS1(ADP-ribosylation factor-like tumor suppressor gene 1)是新近发现的一种肿瘤抑制基因,与家族性肿瘤密切相关[1],但其作用机制尚不明确。本实验通过改造新型复制缺陷型逆转录病毒载体PLEGFP-N1,构建含人ARLTS1基因的逆转录病毒表达载体(PLEGFP-IRES-ARLTS1),观察其在人肝癌细胞株HepG2中的表达,为深入了解ARLTS1基因的抗肿瘤机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶XhoⅠ、SalⅠ、T4 DNA连接酶和LA Taq DNA聚合酶均购自大连宝生物公司;逆转录酶购自TOYOBO公司;Lipofectamine 2000、Trizol购自Invitrogen公司;凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Tiangen公司;MTT购自上海生工生物工程公司;ARLTS1抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 AR LTS1基因扩增

根据GenBank数据库提供的ARLTS1基因的核苷酸序列设计引物。在ARLTS1上游和下游引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位点,引物序列:ARLTS1上游5'-GCTCGAGATGGGTTCT GTGAATTCCAGAGGTC-3',下游5'-GGTCGACA-GATCTCTTGCTGTCTCCGCGCTCA-3'。淋巴细胞分离液分离人外周血白细胞,Trizol提取总RNA,RT-PCR扩增ARLTS1基因。逆转录体系及过程按YOYOBO公司产品说明;PCR反应体系及循环过程按Takara公司产品说明。PCR产物回收与PMD-18载体连接,转化感受态菌DH-5α,挑取阳性菌以M13-47为引物进行测序。

1.2.2 重组逆转录病毒载体PLEGFP-IR ES-AR LT S1的构建

以质粒p IRES为模板,PCR扩增IRES片段,上、下游引物分别引入SalⅠ和Bam HⅠ酶切位点。PCR产物回收并与PMD-18载体连接,转化感受态菌DH-5α,挑取阳性菌测序。将测序正确的菌株扩增,提取质粒,酶切IRES片段,插入逆转录病毒载体PLEGFP-N1,构建重组载体PLEGFP-IRES。

将测序正确的PMD-18-ARLTS1质粒酶切ARLTS1片段,插入重组载体PLEGFP-IRES,构建逆转录病毒载体PLEGFP-IRES-ARLTS1。

1.2.3 重组逆转录病毒原液的制备

逆转录病毒包装细胞PT67用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养至70%融合。载体PLEGFP-IRES-ARLTS1和对照质粒PLEGFP-IRES分别与Lipofectamine2000混合,加入无血清培养液,转入包装细胞PT67。36 h后收集病毒上清液,共3 d,过滤(0.45μm)。Hep G2细胞培养至50%融合率后进行病毒感染。病毒上清加入终浓度8 mg/L polybrene至HepG2细胞。24 h后,去病毒液,加入含10%小牛血清和抗生素的培养液,常规培养。感染72 h,荧光显微镜观察GFP表达。

1.2.4 Western Blot

按Bio-Rad公司蛋白电泳系统的说明书进行SDS-PAGE电泳。电泳后再电转印于硝酸纤维素膜上,加一抗并于37℃孵育30 min,缓冲液冲洗;再加辣根过氧化物酶标记的二抗于37℃孵育30min,ECL显色。

1.2.5 细胞增殖反应的MTT比色法检测

取对数生长期的HepG2/ARLTS1、HepG2/IRES和亲代HepG2细胞,以1104个/m L的细胞密度接种于96孔培养板中,每孔加入100 m L细胞悬液,于37℃、5%二氧化碳条件下分别培养0、12、24、36和48 h。培养结束每孔加入5g/L的MTT 20μL,继续孵育4 h。离心吸取上清,每孔加入DMSO 150μL终止反应,用酶标仪于波长570 nm测定吸光度(A)值。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 10.0统计软件包进行分析。实验数据以均数±标准差表示,各组间数据的比较依据资料的性质,采用t检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 重组质粒PLEGFP-IRES-ARLTS1的鉴定

重组质粒PLEGFP-IRES-ARLTS1亚克隆后提取纯化的质粒,经SalⅠ/XhoⅠ和SalⅠ/Bam HⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳,产生两条约600 bp和1 kb的条带,分别代表ARLTS1和IRES酶切产物,与预期相符(图1)。测序结果证明质粒构建正确。

2.2 GFP表达检测

病毒感染靶细胞72 h后,荧光显微镜观察GFP表达,约70%左右靶细胞表达绿色荧光(图2)。

2.3 ARLTS1表达的检测

利用Western Blot检测PLEGFP-IRES-ARLTS1病毒感染及各对照组细胞中ARLTS1表达。结果表明,PLEGFP-IRES-ARLTS1病毒感染的HepG2细胞高表达外源性ARLTS1蛋白。条带经灰度扫描分析,阳性感染组细胞ARLTS1蛋白表达量是对照组2.5倍左右(图3)。

2.4 ARLTS1表达对HepG2细胞增殖的影响

MTT结果显示,HepG2-ARLTS1细胞组的体外增殖率较各对照组明显降低(P<0.05),人ARLTS1基因对HepG2细胞的体外增殖有直接抑制作用(图4)。

3 讨论

新发现的肿瘤抑制基因ARLTS1是小分子量G蛋白Ras超家族中ARF家族的成员之一,与家族性肿瘤相关[1]。在生物界不同物种之间,ARLTS1序列高度保守,这种进化的保守性表明该基因具有重要的功能。ARLTS1在成人组织里广泛表达,表达丰富的是血液组织,如淋巴结,脾脏和骨髓等,其次是卵巢、肺脏和肝脏[2]。在肿瘤组织与正常组织的比较中,ARLTS1最显著的区别是表达量的不同。通过对卵巢癌、肺癌和慢性淋巴细胞白血病组织进行Northern Blot和定量PCR分析发现,与正常组织相比ARLTS1的表达下调,表明这种表达的改变在肿瘤发生中起重要作用[1,2,3]。等利用腺病毒介导野生型和第149位氨基酸截短的ARLTS1在肺癌细胞株中表达,发现转基因细胞在体外生长率下降,在体内则致瘤性下降。同时,Tunnel和流式细胞术研究证实,转染外源性ARLTS1基因导致的细胞生长抑制可能是Caspase介导的细胞凋亡的结果[2]。在ARLTS1缺失的A549肺癌细胞株中表达外源性ARLTS1,能诱导上调455种基因和下调198种基因。被上调的基因多是发育过程的基因,而被下调的基因多是转运基因。此外,还有众多受ARLTS1表达影响的凋亡相关基因和原癌基因、抑癌基因尚不明确。因此,研究ARLTS1抑制肿瘤生长的分子机制具有重要意义。

本研究以人外周血淋巴细胞总RNA为模板,扩增ARLTS1 c DNA,构建重组逆转录病毒载体PLEGFP-IRES-ARLTS1。利用逆转录病毒载体将外源性基因导入真核细胞,在两端长末端重复序列(LTR)作用下,外源性基因可插入基因组,随基因组复制而复制,并稳定表达[4,5]。其中,载体中携带的GFP作为报告基因,用来提示外源性基因的转导和表达,通过荧光显微镜能便捷检测到被逆转录病毒感染的靶细胞。

为了避免表达融合蛋白,本文在PLEGFP-N1载体上插入了IRES,使ARLTS1和GFP基因能同时转录,但分别翻译成独立蛋白,既保证了在实验过程中随时监测转染和感染的效率,又能使ARLTS1完整表达[6,7]。在克隆IRES过程中,我们将其上游IVS(synthetic intron,合成内含子)一并扩增,插入载体,其作用在于保持转录后的m RNA的稳定性,有利于蛋白翻译[8]。

重组病毒感染HepG2细胞72h后,通过荧光显微镜观察GFP表达。结果显示,表达GFP的靶细胞达70%以上,表明本研究构建的重组病毒有较高的感染率。Western Blot显示,HepG2-ARLTS1细胞过表达ARLTS1蛋白。同时,MTT结果显示,HepG2-ARLTS1细胞增殖能力显著低于各对照组,表明ARLTS1对肝癌细胞株HepG2生长有直接抑制作用。

本研究为更深入地探讨ARLTS1基因高表达对肝癌Hep G2细胞增殖分化的影响,进而深入研究ARLTS1抗肿瘤机制奠定了实验基础。

参考文献

[1]CALIN GA,TRAPASSO F,SHIMIZU M,et al.Familial cancerassociated with a polymorphism in ARLTS1[J].N Engl J Med,2005,352(16):1667-1676.

[2]YENDAMURI S,TRAPASSO F,FERRACIN M,et al.Tumorsuppressor functions of ARLTS1 in lung cancers[J].Cancer Res,2007,67(16):7738-7745.

[3]PETROCCA F,ILIOPOULOS D,QIN HR,et al.Alterations ofthe tumor suppressor gene ARLTS1 in ovarian cancer[J].CancerRes,2006,66(21):10287-10291.

[4]MILLER DG,ADAM MA,MILLER AD.Gene transfer by retro-virus vectors occurs only in cells that are actively replicating atthe time of infection[J].Mol Cell Biol,1990,10(8):4239-4242.

[5]ZHENG QW,DONG XX,PENG Y,et al.Retroviral-mediatedhigh efficient expression of target gene in expanded rat mes-enchymal stem cells[J].China Journal of Modern Medicine,2005,15(22):3424-3431.Chinese

[6]BAIRD SD,TURCOTTE M,KORNELUK RG,et al.Searchingfor IRES[J].RNA,2006,12(10):1755-1785.

[7]ZHANG T,WAN JY,LIU YJ,et al.Establishment of high effi-cient transfection and expr essionsystem of phPPARα-IRES2-EGFP recombinant plasmid carrying human PPARαgene in vit-ro[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(17):2073-2077.Chinese

高效逆转录抗病毒治疗 第5篇

1 资料与方法

1.1 一般资料

2005年1月～2010年12月在我院接受HAART作HIV母婴阻断并在产科分娩的107例孕妇为研究组:孕妇平均年龄27.5(18～39)岁,抗-HIV检测初筛阳性者,全部经蛋白印迹法确认。随机选取同期在广州市某医院产科分娩的孕妇为对照组,平均年龄29.6(18～43)岁,抗-HIV检测初筛均阴性。

1.2 方法

1.2.1 母婴阻断方法

孕产期应用HAART、剖宫产、人工喂养等综合阻断措施。研究组孕妇接受HAART方案:齐多夫定(AZT)0.3g/次,bid+拉米夫定(3TC)0.3g/次,qd,为骨干,第3种药物为奈韦拉平(NVP)0.2g/次,bid或依非韦伦(EFV)0.6g/次,qd或洛匹那韦利托那韦(LPV/r)0.5g/次,bid,共107例;其中11例因为AZT的不良反应,以司他夫定(D4T)0.03g,bid替代AZT。

1.2.2 观察指标

临产前的白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)、总胆红素(TBil)、白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、乙型及丙型肝炎病毒指标、梅毒指标、CD4+T淋巴细胞计数、孕妇的服药天数。

1.3诊断标准及分组

1.2.3. 1 诊断标准

孕期贫血、贫血程度诊断标准参照《妇产科学》第6版[3];肝功能异常为TBil、ALT、AST任一项异常;TBil、ALT、AST异常度判断参照AIDS临床实验组(AIDS clinic trial group,ACTG)定义的级别[4]。

1.2.3. 2 研究组孕妇再分组研究

(1)以HAART时间的长短对研究组再分组:1组为HAART时间<12w,2组为HAART时间≥12w、且<36w,3组为HAART时间≥36w。(2)研究组开始均使用AZT+3TC为骨干的HAART方案,至分娩时一直使用含AZT的方案的孕妇再分为AZT组,将期间需使用AZT替代方案的孕妇再分为对照组。

1.4 统计学方法

定量数据采用表示,采用SPSS 11.0软件对定量数据进行t检验或方差分析,对计数资料进行person卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组HAART治疗后产前和对照组孕妇产前监测指标的比较见表1。

2.2 以HAART时间分组,研究组孕妇HAART后监测指标的比较见表2。

2.3 研究组与对照组贫血情况比较

研究组无贫血19例、轻度贫血72例、中度贫血15例、重度贫血1例(贫血发生率82.2.%);对照组无贫血83例、轻度贫血46例、中度贫血6例、重度贫血0例(贫血发生率38.5.%),2组比较差异有统计学意义(χ2=48.15,P<0.01)。

2.4 两组孕妇的监测指标比较

2组TBil均在正常范围内,无统计学差异;2组ALT比较差异无统计学意义(χ2=1.56,P=0.32);2组AST比较差异有统计学意义(χ2=6.29,P<0.05)。

2.5 两组病毒感染情况比较

研究组中乙肝病毒(HBV)感染l10例,丙肝病毒(HCV)感染3例,乙丙型肝炎病毒重叠感染3例,梅毒感染4例。对照组中HBV感染15例。

所有病例中的感染肝炎病毒并出现肝功能异常者6例,其中I级5例、II级1例,非感染肝炎病毒者的肝功能异常6例、均为1级。感染组与非感染者的差异有显著性意义(P<0.01)。研究组中,感染肝炎病毒者并出现肝功能异常者6例,其中Ⅰ级5例、Ⅱ级1例,非感染肝炎病毒者的肝功能异常4例(均为1级)。对照组的感染肝炎病毒组未见肝功能异常,非感染肝炎病毒组的肝功能异常2例、均为1级。

3 讨论

贫血在HIV感染的患者中非常多见,病情进展到严重阶段,40%的HIV感染者都存在不同程度的贫血[5]。HIV阳性组的红细胞、血色素比阴性对照组显著下降,而且轻、中、重度贫血的人数显著比对照组增多,说明除常见的妊娠期贫血的原因外,药物可能是导致贫血的重要因素。本研究以AZT+3TC为HAART方案骨干。AZT的最为突出的不良反应是骨髓抑制,患者出现可逆性贫血和粒细胞减少[7]。以HAART时间的长短进行分析,1组(治疗时间<12w组)的RBC显著>2组(≥12w)和3组(治疗>36w),均值依次递减。说明随着使用AZT时间的延长,骨髓受到抑制而RBC生成减少。3组孕妇是均于妊娠前已开始HAART,本研究示3组Hb较1组与2组的有显著的升高,与长期有效HAART治疗能够显著提高AIDS患者的Hb浓度的结论相一致[6]。因此,本研究结果显示接受HAART的孕妇贫血的原因是HIV的疾病状态和AZT的不良反应相互作用的结果。但由于研究条件所限,研究组的大部分患者未进行HIV-RNA相关检测,因此无法进一步研究HIV病毒复制情况与血色素的相关性。

HIV阳性组孕妇的白细胞比阴性组显著降低,组间分析显示1组的白细胞较2组明显下降,2组与3组比较白细胞已无差异,提示AZT对白细胞的影响主要发生HAART的早期。但1组与3组间上无差异,有可能是长期治疗以后稳定的结果。由于3组的样本量较少,可以在今后扩大样本量进一步研究[7]。

肝毒性是HAART治疗的常见副作用。国外有研究认为发现由于肝脏原因的死亡占所有AIDS死亡的30%～55%,是AIDS发病和死亡的主导原因之一[8,9]。HAART引起的肝毒性主要表现为脂肪肝和乳酸酸中毒。本研究发现HIV阳性组中的ALT、TB与对照组比较差异无显著性意义。AST升高与对照组比较有显著性差异,但其升高的幅度很小,均为I级;感染肝炎病毒者与非感染组比较则差异有显著性意义,提示肝炎病毒感染可能是引起HIV阳性孕妇肝功能异常的主因。此外,研究组中感染乙型肝炎病毒占多数,而3TC对乙肝病毒有明确的抑制作用,使其炎症活动降低而致使肝损害的发生减少。因此,可以认为在本研究HAART方案无明确的肝毒性,可能与母婴阻断干预的时间比较短和含3TC方案有关。

本研究发现研究组与对照组的白蛋白、总胆固醇、甘油三酯等无显著性差异,可能提示接受HAART治疗对孕妇的营养状况无明显影响。研究组的空腹血糖较对照组低,结合其他营养指标均无差异,我们分析可能与HIV基础病导致消耗增多。球蛋白较对照组明显升高,考虑可能与HIV慢性感染以及其他一些继发的感染所致。同时3组的Glb较1组和2组的明显降低,反映机体的体液免疫因子在长期HAART后下降,间接提示继发感染和HIV体液免疫功能状态的好转。

本研究结果提示,短期应用HAART药物对HIV阳性孕妇是安全的,对营养和肝功能没有明显的影响。值得特别关注的是接受HAART治疗短于12w的孕妇白细胞、血色素有较明显下降,因此临床医生在进行HIV母婴阻断工作时应注意监测HIV阳性孕妇的血常规,及时调整治疗方案并对症治疗。

参考文献

[1]European collaborative study.Mother-to-child transmission of HIVinfection in the era of highly active antiretroviral therapy[J].ClinInfect Dis,2005,40(5):458-465.

[2]MagderL S,Mofenson L,Paul M E,et al.Risk factors for inutero andintrapartum transmission of HIV[J].J Acquir Immune Defic Syndr,2005,38(1):394-402.

[3]乐杰,谢幸,丰有吉.妇产科学[M].第6版.北京:人民卫生出版社,2005.162-165.

[4]AIDS Clinical Trials Group Table of grading severity of adult ad-verse experience[R].Rockville,M D:US division of AIDS,Nationalinstitute of Allergy and Infectious Diseases,1996.

[5]Morcroft A,Krk O,Barton SE,et al.Anaemia is an dependent predi-etive marker for clinical prognosis in HIV-infected patienis fromacross Europe[J].AIDS.1999,13(6):943-50.

[6]Carr A,Cooper DA.A dverse effects of antiretroviral therapy[J].Lancet,2000,356(9239):1423-1430.

[7]吴丽娟.高效抗逆转录病毒治疗对艾滋病患者血常规的影响[D].浙江大学硕士学位论文,2007.

[8]Bica I,McGovern B,Dhar R,et al.Increasing mortality due to end-stage liver disease in patients with human immunodef i ciency virus in-fection[J].Clin Infect Dis,2001,32(11):492-4971.