第1外显子范文（精选8篇）

第1外显子 第1篇

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

贵州黑山羊15份全血组织, 采自贵州省六盘水市钟山区的月照、大湾及汪家寨三个乡镇, 冰瓶运回实验室, -40℃冰箱保存备用。

1.2 试剂来源

所用试剂来源为:蛋白酶K由北京华美生物工程公司提供, 琼脂糖 (Agarose) 由BIOWEST提供, 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、硼酸由北京奥赛博科技有限公司提供, N, N, N', N':四甲基乙二胺 (TEMED) 由北京鼎国生物技术有限责任公司提供, DNA Marker由宝生物工程 (大连) 有限公司提供, 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na22H2O) 、NaCl、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇购于北京化工厂, Buffer、TaqPCRMasterMix试剂、DNA提取试剂盒和其它的药品与试剂均购自天根 (Tiangen) 生化科技 (北京) 有限公司。

1.3 DNA提取及序列测定

采用血液基因组DNA提取试剂盒提取细胞中总DNA。PCR及测序所用的引物, 根据已发表的羊FSHR基因全序列 (GenBank序列登录号为EU847288) 进行设计, 由上海Invitrogen生物技术公司合成。引物为:上游:5-’ATCATGTTGGTGGGCTGGGT CTT-3’, 下游:5’-AAATGTCTTAG GGGAATGAGTG-3’。PCR扩增条件为:5℃预变性1min, 94℃变性1min, 58℃退火1min, 72℃延伸1min, 32个循环, 72℃再延伸7min, 4℃保存。纯化回收后的PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行纯化和双向测序。

2 结果与分析

2.1 PCR产物扩增结果

将扩增后的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果见图1。由图1可知, PCR扩增出的产物大小在500～750 bp之间, 与设计的目的产物大小 (661bp) 一致。扩增产物条带清晰、明亮、整齐、无杂带, 大小符合所要扩增的目的片断的大小。

2.2 测序结果

测序结果经拼接的DNA序列用DNAsta软件中的SeqMan程序排列同源序列, 并进行人工校正, 确定贵州黑山羊FSHR基因第1外显子序列长度及位置, 并进行序列比对, 通过比对得知, 在贵州黑山羊15只母羊 (胎产仔数平均为1、2、3只的各5头) 中的FSHR基因第1外显子661bp核苷酸系列中, 没有发现任何突变。

2.3 与其它山羊品种比较

将贵州黑山羊测序所得的结果与云南农业大学的Cui H.X等发表的波尔山羊的FSHR基因的第一外显子c DNA同源区段 (GeneBank:EU847288) 序列进行比对, 两者的长度一致, 没有序列的插入或缺失, 没有发现碱基突变。序列的同源性为100%。

将测序结果与云南农业大学的Cu H.X等发表的云岭黑山羊的FSHR基因cDNA同源区段序列 (GenBank登录号EU847283) 相比较, 两者之间出现2个碱基变异, 分别位于466和572位。其中466位在云岭黑山羊的序列碱基为A, 贵州黑山羊变为T, 结果导致编码肽链的酪氨酸GAT突变为苯丙氨基酸GTT, 而572位在云岭黑山羊的序列碱基为T, 贵州黑山羊变为C, 结果导致编码肽链的异亮氨基酸ATC突变为苏氨酸ACC (图2) , 序列的同源性为99.697%, 碱基变异率相应为0.303%。

3 讨论与结论

FSHR基因在人是一个长达54kb的基因, 由10个外显子和9个内含子组成, 内含子长度达52kb。它包括10个外显子和9个内含子, 胞外结构域由9个外显子编码, 编码胞外结构域的羧基端, 跨膜区和胞内区的基因位于超过1234bp的较大第10外显子。目前, 针对FSHR基因多态性所做的研究, 大多认为在5’端序列及第10外显子上存在明显的多态性, 而其它位置的多态性均不明显, 魏伍川[1]对小尾寒羊FSHR基因5’端序列和第10外显子序列进行了测序, 仅在FSHR基因的第10外显子存在显著多态性。雷雪芹等[2]对秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎和单胎母牛的研究发现, 双胎牛和单胎牛之间FSHR基因的第10个外显子的突变率差异明显。本实验只测定了贵州黑山羊FSHR基因第1外显子, 没有任何突变, 显示在贵州黑山羊15只母羊中的FSHR基因第1外显子661bp核苷酸系列中不存在多态性。

山羊的多胎性是一个遗传力较低的性状, 与环境有着较大的相关性, 而本实验所采贵州黑山羊的30个样本分别是在四个不同的乡镇采集, 各采样点间确实存在较大的环境差异, 而实验选择样本的依据是在经产史上曾经有一次双胎或三胎的就被看作是双胎或三胎羊, 单胎羊是截止采样时只产过单胎的母羊。多胎羊产多胎, 有可能是环境所造成的, 例如营养差异, 不一定含有多胎的基因;而单胎羊采样时没有产双胎, 但也许含有双胎基因, 在今后可能会产双胎, 虽然前者含多胎基因的可能性要高于后者, 但本实验根据表型分组后测得的组间个体FSHR基因第1外显子序列并不存在基因型差异, 说明该区段序列变异可能不是影响山羊的排卵率和产羔数的主效基因片段。

众多研究显示, 家山羊存在2个以上的起源, 谢成侠[3]和《中国羊品种志》编写组[4]认为, 家山羊的野生祖先有角呈镰刀状的羊骨羊和角呈螺旋状的羊骨羊两种野生种。达尔文[5]认为山羊是从亚洲山地的角羊骨羊传下来的, 可能还同印度羊骨羊有过混血的情形。贵州黑山羊与波尔山羊的FSHR基因cDNA同源区段序列相比较, 没有出现任何变异, 而与云南云岭黑山羊的FSHR基因cDNA同源区段序列出现的2个碱基变异, 可能属于品种间的差异, 与繁殖性能没有相关性。

摘要：以贵州黑山羊为对象, 研究促卵泡素受体 (FSHR) 基因的遗传多态性。测定表明FSHR基因第1外显子, 没有任何突变, 显示在15只母羊中的FSHR基因第1外显子661bp核苷酸系列中不存在多态性, 本研究为探索该受体基因在繁殖中的作用打下基础。

关键词：贵州黑山羊,FSHR基因,核苷酸系列,遗传多态性

参考文献

[1]魏伍川, 许尚忠, 张英汉, 等.中国小尾寒羊FSHR基因部分序列的克隆与分析[J].中国农业科技导报, 2001, 3:61～65

[2]雷雪芹, 陈宏, 袁志发, 等.牛FSHR基因第10外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系[J].中国生物化学与分子生物学报, 2004, 20:34～37

[3]谢面侠.中国养牛羊史 (附养鹿简史) [M].北京:农业出版社, 1985

[4]涂有仁.中国羊品种志[M].上海:上海科学技术出版社, 1989

精神分裂症—家系外显子 第2篇

【关键词】精神分裂症；外显子

【中图分类号】R749 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）06-0073-01

精神分裂症是一种严重影响认知、行为、情感过程的疾病。精神分裂症广泛的症状以及临床上的变异表明该疾病有复杂的遗传病因。包括连锁分析，全基因组关联分析，拷贝数变异所发现的大量的突变位点。虽然普遍认为精神分裂症跟遗传之间的关系高达80%。但是大多数与之相关联的基因没有被找到。所以本文用外显子高通量测序的方法来研究该病。

1 选取样品以及排除方法[2]：

在该研究中，对本院14个精神分裂症的先症者以及他们的父母进行外显子测序研究。对于精神分裂症患者的确定，研究人员采取了严格的方法，并通过采访来确定其是否为精神病患者。并且这14个患者没有精神病的家族史，并且用拷贝数变异有针对性的数组（copy number variant–targeted array，CNV）（Cytochip 2.0，Affymetrix Inc.）。排除掉之前发现的CNV，结果在14个患者中并没有发现先前发现的CNV。

2 研究方法[3]：

选取的样品为患者跟其父母的血液中的DNA。该研究中所用捕获芯片为SureSelect Human All Exome Kit v.1 （Agilent Technologies Inc.）

捕获效率：有72%目标区域被覆盖至少20层。

测序平台：基因组分析仪 IIx （Illumina Inc.）

3 信息分析

在14个患者中，经过在他们的父母中，还有另外的26个控制中筛选，排除最后找到的73个假定的突变。最后用PCR和Sanger测序的方法进行验证。最后找到了15个新的突变。这15个突变集中在8个患者当中。研究人员认为其他的58个突变是假阳性的突变，或者是有患者的父母传递跟子女的突变。在该分析中没有发现插入和缺失。

4 功能分析

最后对每个突变所可能造成的氨基酸的变化，以及其功能的变化对精神分裂症的影响进行分析和评估。得出这些基因突变的地位。

5 结论

该文章只对外显子区域进行研究，找到得新的突变比预想的要高。可能是由于该研究只是对外显子区域进行研究，而没有对内含子等其它区域进行研究。而且在另外的6个患者中并没有找到新的突变。这有可能是因为测序本身的误差的原因，还可能是由于该治病的突变由可能并不处于外显子区域。

参考文献：

[1] Anath C.Lionel， Andrea K.Vaags. Rare exonic deletions implicate the synaptic organizer Gephyrin （GPHN） in risk for autism， schizophrenia and seizures. Hum Mol Genet 2013 22 （10） 2055-2066

[2] Elliott Rees， George Kirow， Michael C. O’Donovan. De Novo Mutation in Schizophrenia Schizophr Bull 2012 38 （3） 377-381

[3] Justi M. Kerr and Thomas A.Blanpied. Phospholipase C{beta}1b associates with a Shank3 complex at the cardiac sarcolemma FASEB J. 2011 25 （3） 1040-1047

作者简介：

第1外显子 第3篇

1.1 血样采集

选择纯种藏鸡24只，纯种寿光鸡24只，纯种白来航鸡24只，ACD抗凝，翅下静脉采血。藏鸡血样采集自西藏农牧学院实习牧场，寿光鸡和白来航鸡血样来自中国农业大学实习牧场。

1.2 药品

d NTP,Taq DNA pol-ymerase,10Buffer,DNA Marker(DL2 000)，琼脂糖，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，氢氧化钠，TEMED，乙醇，Tris，盐酸，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，十二烷基硫酸钠(SDS)，乙酸钾，氯化锂，氯化钠，过硫酸铵，硼酸，冰乙酸，上样缓冲液(Loading Buffer)，四硼酸钠，硝酸银，甲醛，溴化乙锭(EB)，溴酚蓝，去离子甲酰胺，二甲苯青，柠檬酸钠，柠檬酸，胶回收试剂盒。

2 试验方法

2.1 血液总DNA的提取

用高盐法提取血液总DNA。

2.2 引物的设计

下载NCBI上已有的红色原鸡MHC B-G基因序列并比对，在GenBank选择登陆号为NC-006103.2的红色原鸡MHC B-G基因序列，利用软件Primer Premier 5.0针对第1、2外显子区域进行引物设计，对应的引物序列为R:5′ATCCCTCGTTGTGAGACTCTC3′;F:5′CCAACCAGAAGTGTGA TGAT 3′，其引物对应的温度(Tm)为57.8℃，PCR产物的长度为1 178 bp。

2.3 PCR扩增

2.3.1 PCR反应体系见表1。

2.3.2 PCR反应程序见表2。

扩增完毕后在琼脂糖凝胶电泳上检测，观察是否有杂带。

2.4 测序

相关测序实验由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，并由公司提供相关的实验报告。

3 结果分析

3.1 基因组DNA的提取

用适量的灭菌双蒸水溶解鸡血液中的基因组DNA。室温溶解24h后，随机抽检各品种基因组DNA，各吸1μL于0.7%琼脂糖凝胶电泳中检测，结果表明绝大多数基因组都有明显的条带，可以用于PCR扩增反应。同时，对提取结果不好的样品采取重新提取，直到所提基因组DNA符合要求。

3.2 PCR反应结果

根据优化后的PCR条件(见表1和表2)进行PCR扩增，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，结果发现条带大小适合，且无杂带，可以直接进行混合测序。

3.3 不同品种的序列分析结果

3.3.1 鸡MHC

B-G基因177位基因序列将PCR扩增产物抽样检测后，由北京诺赛公司进行正反向测序，测序要求为混合测序。由于突变位点靠近下游引物，反向测序图上该突变点峰值不清晰，故取上游引物进行测序(图1)，图示如下。峰值清晰，结果显而易见，藏鸡序列由C→T突变，从而证实了单核苷酸多态位点的存在。

通过网站http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html上的TFSEARCH(ver1.3)软件对该多态性位点突变前后潜在的调控元件及蛋白结合位点进行预测，对所选取突变位点(箭头所示)上下30 bp左右的序列的预测结果如左下图(预测分值大于85有效)所示。

突变位点发生C→T转换后的序列的潜在调控元件及蛋白结合位点预测结果如左下图(预测分值大于85有效)所示。

以上结果表明，鸡MHC B-G基因第177位碱基处发生的C→T转换未导致任何潜在调控元件和蛋白结合位点的改变。

3.3.2鸡MHC B-G基因345位基因序列

由图3显而易见白来航鸡和寿光鸡MHC B-G基因的345位有插入现象，藏鸡有缺失现象。

3.3.3 鸡MHC

B-G基因511位基因序列通过网站(同上)对该多态性位点突变前后潜在的调控元件及蛋白结合位点进行预测，对所选取突变位点(箭头所示)上下30 bp左右的序列的预测结果如左上图(预测分值大于85有效)所示。

突变位点发生C→T转换后的序列的潜在调控元件及蛋白结合位点预测结果如左上图(预测分值大于85有效)所示。

以上结果表明，鸡MHC B-G基因起始密码子上游第511位碱基处发生的C→T转换未导致任何潜在调控元件和蛋白结合位点的改变。

3.3.4 鸡MHC

B-G基因547位基因序列通过网站(同上)对该多态性位点突变前后潜在的调控元件及蛋白结合位点进行预测，对所选取突变位点(箭头所示)上下30 bp左右的序列的预测结果如下图(预测分值大于85有效)所示。

突变位点发生T→C转换后的序列的潜在调控元件及蛋白结合位点预测结果如下图(预测分值大于85有效)所示。

以上结果显示，鸡MHCB-G基因起始密码子上游第547位碱基发生的T→C转换，减少了两个可以预测到的调控元件结合位点，分别是转录因子HSF1(较高预测分值87.0)和转录因子HSF2(较高预测分值85.9)。

4分析

4.1 MHC B-G等位基因第1、2 外显子的多态性

从本研究结果可以看出，藏鸡MHC B-G基因具有丰富的多态性。在所分析的第1、2外显子的片段中，藏鸡与其它两个品种鸡具有多肽简约性信息位点4个，其中一个有插入现象，另三个为突变位点。但其多态位点的分布不均匀，如：450bp-505bp、510bp-550bp、715bp-730bp区域的多态位点较多，而在177bp-330bp、350bp-450bp区域的多态位点较少，这些保守区很可能是外表性状的重要功能区，这有待进一步的研究。B-G基因第二外显子所编码的类Ig-V结构域氨基酸序列第23位的半胱氨酸残基是形成二硫键的位点之一，该区域的核苷酸序列的保守性可能与这一功能域有关。B-G基因第二外显子丰富的多态性与B-G分子的生物学功能多样性密切相关。笔者认为，B-G基因第二外显子所编码的类Ig-V结构域的多样性可能与B-G分子的多态性抗原决定簇有关，而B-G分子表面决定簇是被B细胞或T细胞表面的抗原特异性受体所识别的部位(Salomonsen et al.,1991)。可见，第二外显子多态性的分子免疫学功能可能在免疫球蛋白向B-G抗原分子的呈递和快速免疫应答以及B-G抗原对其它细胞表面MHC抗原体液免疫应答的“辅助效应”中发挥作用。

4.2 关于MHC B-G等位基因的检测

第1外显子 第4篇

目前, 敌百虫在我国使用范围广、用量大, 是一种毒性低、防治范围广的有机磷杀虫剂, 同时也被广泛用于驱除家畜体内外寄生虫。敌百虫对害虫有很强的胃毒作用, 兼有触杀作用, 并且对植物有渗透性, 但无内吸传导作用, 主要用于消灭咀嚼式口器害虫。周炯林等[4]在对有机磷农药遗传毒性研究中发现, 敌百虫对DNA具有直接或间接的致突变作用, 其机制为烷基化、磷酰化、氧化应激及干扰细胞有丝分裂。利用聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP) 技术和DNA测序技术对敌百虫作用小鼠P53基因第5～8外显子突变情况进行检测, 旨在研究敌百虫的致突变能力, 为其安全性评价提供参考依据。

1 材料

4周龄昆明系小白鼠共39只 (雄性18只, 雌性21只) , 由贵州省贵阳医学院实验动物中心提供。将小鼠随机分为3组并编号, 每组13只 (雄性6只, 雌性7只) , 分群饲养, 在染毒前对每只小鼠进行断尾采血, 肝素钠抗凝, 并保留尾部组织, 备用 (作为空白对照) 。染毒30 d后眼眶静脉采血, 肝素钠抗凝, 取肝脏组织, 备用。

2 方法

2.1 试验动物染毒方式及剂量

采取饮用特定浓度敌百虫水溶液的方法对试验小鼠进行口服染毒, 浓度分别为80, 120, 160 mg/L, 即Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组, 自由饮水, 连续染毒30 d。

2.2 DNA提取及检测

分别利用上海生工生物工程技术服务有限公司血液基因组和组织基因组DNA提取试剂盒, 对所采集的各染毒浓度组染毒前后的所有血液、组织 (尾部和肝脏) 样品进行DNA提取, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 溴化乙锭染色, 最后用凝胶成像系统照相, 保存。

2.3 引物设计及PCR扩增

参照GenBank (登录号为NC_000077.5) 提供的小鼠P53基因序列, 运用Primer Premier 6.0软件设计引物, 送上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 引物设计见表1。

利用所合成的引物分别以3个试验组染毒前后血液和组织基因组DNA为模板进行目标片段扩增。PCR反应体系 (10 μL) :DNA模板1 μL, 上、下游引物各1 μL, 2Tap PCR Master Mix (平生生物有限公司生产) 5 μL, ddH2O 2 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 59 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共30个循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。随机抽取扩增产物, 用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 照相并保存。

2.4 SSCP检测

取PCR产物4 μL、变性缓冲液4 μL [95%去离子甲酰胺, 1 mmol/L乙二胺四乙酸 (EDTA) pH 值为8.0, 0.025%二甲苯青, 0.025% 溴酚蓝, 10%甘油]充分混匀, 置于沸水中变性10 min, 取出后冰浴20 min。用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测:100 V空胶预电泳30 min, 利用微量移液器迅速加入变性样品, 220 V高压预电泳10 min, 调至110 V电泳10 h, 直至溴酚蓝条带接近凝胶下缘。采用银染法显影, 用凝胶成像系统 (白光反射) 照相, 保存并分析。

2.5 DNA序列测定

经SSCP-PCR分析后, 为进一步筛查突变位点, 对3组小鼠染毒前后的血液、组织DNA样品进行PCR扩增, 所得产物经检测后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序, 采用DNAStar软件对所测正反序列进行校正和拼接, 再通过DNAMan软件对序列进行比对分析。

3 结果与分析

3.1 染毒试验动物行为观察

小鼠染毒初期未见异常现象, 随着饲喂时间的延长, 小鼠采食量、活力及运动能力均略有下降, 精神不振, 且染毒浓度越大情况越严重, 但整个试验期间所有染毒小鼠未死亡。

3.2 DNA提取结果

提取的血液、组织基因组DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。其显示条带集中, 整齐明亮无拖尾, 表明可用于下一步试验。

1～4.血液基因组DNA;5～8.尾部组织基因组DNA;9～12.肝脏组织基因组DNA。

3.3 PCR产物检测结果

采用引物第5外显子、第6外显子、第7外显子、第8外显子分别对染毒前后各组小鼠血液、组织 (染毒前尾部、染毒后肝脏) 基因组DNA进行PCR扩增, 随机抽样, 用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 结果见图2、图3。

1～4.引物第8外显子的部分扩增产物;M.50 bp DNA Ladder Marker;5～8.引物第5外显子的部分扩增产物。

1～4.引物第6外显子的部分扩增产物;M.50 bp DNA Ladder Marker;5～8.引物第7外显子的部分扩增产物。

由图2, 3可知:所检测的目的片段长度分别为309, 292, 302, 207 bp, 与预期片段大小相符, 条带清晰、整齐无拖尾, 可直接用于SSCP检测分析。

3.4 SSCP检测结果

血液、组织染毒前后SSCP检测结果见图4、图5。经对比分析, 染毒前后相同编号样品均未发现单链构象差异, 初步认为未发现P53基因突变。

3.5 测序结果分析

运用DNAMan软件将校正与拼接完整的目标序列与GenBank中P53基因第5～8外显子序列进行比对, 发现各组被测样本染毒前后均未出现碱基突变, 与GenBank中登录的小鼠P53基因序列完全一致。第5外显子序列比对结果, 见图6。

4 讨论

敌百虫是一种使用较为普遍的有机磷农药和兽用驱虫药, 其主要毒性作用机制是抑制乙酰胆碱酯酶活性, 引起乙酰胆碱堆积, 造成神经生理功能紊乱。短期内接触大量敌百虫会引起头痛、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性中毒症状。长期接触低剂量敌百虫在未引起胆碱酯酶活性变化的情况下也会表现出部分毒性效应, 所以除了胆碱酯酶抑制外还存在其他机制[5]。邹辉[6]在研究敌百虫对大鼠肝细胞毒性时发现, P53基因在细胞凋亡和分化中起重要作用, 且敌百虫等有机磷农药能使P53基因表达升高, 这可能是引起DNA单链断裂交联而导致突变的原因之一。试验中各试验组小鼠采用敌百虫经口染毒 30 d后, 虽然出现了一定程度中毒症状并表现出一定的剂量效应关系, 但经PCR-SSCP检测分析, 所有试验小鼠P53基因高发突变区第5～8外显子均未发现突变位点, 且DNA测序比对结果也未发现其P53基因第5～8外显子发生突变。

周好乐等[7]在敌百虫的遗传毒性效应及维生素C的颉颃作用研究中, 对小鼠进行50 d的敌百虫经口染毒, 染毒浓度为5 mg/mL, 小鼠未发生急性中毒情况, 但其骨髓细胞微核率出现显著性差异。本试验中染毒剂量最大为160 mg/L, 相比较而言, 本试验所采用的敌百虫溶液浓度相对较小, 是否因为敌百虫染毒浓度太低而不足以引起突变还有待于进一步研究。另一方面, 不同物种间P53基因存在差异, 如大鼠野生型P53基因第249位密码子 (CCG) 与人的P53基因第249 位密码子 (AGG) 不同, 后者第3个碱基突变导致精氨酸被苏氨酸替代, 而在大鼠中同样的突变仅引起沉默突变。而吴一丁等[8]的试验结果表明:敌百虫的致突变性对于生殖细胞类的新生细胞作用较大, 而对于体内已成型的细胞致突变性较小。此外, 曹林芝等人在对P53基因及其分子生物学作用的研究中提到, P53基因的突变不仅发生在外显子上, 也存在于内含子中, 且P53基因存在失活的其他方式, 不仅是突变。

摘要：为了探讨有机磷农药敌百虫对小鼠P53基因高发突变区第5～8外显子有无致突变性, 试验分别配制浓度为80, 120, 160 mg/L的敌百虫溶液, 对昆明系小鼠进行口服染毒30 d, 采用聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP) 技术和DNA测序技术对染毒小鼠血液和组织P53基因第5～8外显子进行突变位点检测。结果表明:3个试验组共39个被检测样本P53基因第5～8外显子区域均未发生突变现象。

关键词：敌百虫,P53基因,第5～8外显子,聚合酶链反应-单链构象多态性 (PCR-SSCP) ,突变

参考文献

[1]许真, 金银龙.环境致癌剂与P53基因突变[J].卫生研究, 2004, 2 (33) :239-242.

[2]HARMS K L, CHEN X.The C terminus of P53 family proteins is acell fate determinant[J].Mol Cell Biol, 2005, 25:2014-2030.

[3]王晓玫, 成志强, 陶凤华, 等.应用PCR-SSCP技术研究非小细胞肺癌P53基因突变[J].第四军医大学学报, 2003, 24 (18) :1650-1652.

[4]周炯林, 徐培渝.有机磷农药遗传毒性研究进展[J].国外医学:卫生学分册, 2007, 6 (34) :339-344.

[5]丁瑜, 周淑芳, 沈莉, 等.敌百虫暴露对孕鼠脏器及胎鼠DNA和生长发育的影响[J].上海交通大学学报:医学版, 2009, 3 (29) :248-251.

[6]邹辉.敌百虫对大鼠肝细胞毒性的研究[D].江苏:扬州大学, 2009.

[7]周好乐, 于国辉, 郑明霞, 等.敌百虫的遗传毒性效应及维生素C的拮抗作用[J].Acta Acad Med Nei Mongol, 2008, 1 (30) :20-22.

第1外显子 第5篇

国际水牛联合会于第六届世界水牛联合会议中指出新世纪水牛的发展应秉持“奶用为主, 肉用为辅”的原则, 会议认为水奶牛业将会成为一项新产业[1]。对家畜在常规育种的基础上进一步进行分子水平的选育, 可以加速遗传进展。通过用分子育种的方法, 筛选与信阳水牛产奶产肉性状密切相关的基因, 挖掘其影响信阳水牛乳肉性能的分子生物学机制是当前信阳水牛育种亟须解决的问题。

正常情况下, 生长激素释放激素 (growth hormone releasing hormone, GHRH) 是在已知的促进生长激素 (growth hormone, GH) 的分泌过程中最为重要的一种激素。GHRH作为GH的正调控因子, 促进GH的合成和分泌, 通过GH间接的影响动物的生长速度和乳腺蛋白质的合成[2]。有研究表明, GHRH基因位于牛的13号染色体上, 其全基因序列长度为9356bp, 并且该基因有5个外显子和4个内含子组成。Hodate等报道, 给奶牛注射GHRH14天后, 实验组比对组产奶量高11%~19%。给牛注射GHRH类似物, 可提高血清中GH和IGF-I的浓度, 连续注射24天, 产奶量增加30%。Hyun Sub Cheng等人在对朝鲜肉牛的基因进行研究时, 发现了其GHRH基因5'端区存在一个单核苷酸的多态性 (SNP) , 该SNP对朝鲜肉牛的产肉性能及肉质性状造成了一定的影响。但是在对信阳水牛进行研究的过程中, 并没有形成关于GHRH基因影响水牛产肉性能的相关报道。本研究应用PCR-SSCP结合测序技术, 对信阳水牛GHRH基因的第4外显子的突变情况以及其产肉的性能、性状存在的关联性进行检测分析, 以推动信阳水牛乳肉产业的科学快速发展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品

采集来自信阳光山牛场的52头信阳水牛血液样本, 采血方式为静脉采血, 为保证结果的准确性, 所使用的血液样本均不存在亲缘关系。以-20℃的温度保存柠檬酸钠抗凝 (ACD) 方便备用。

1.1.2 主要试剂

Platinum Tap DNA聚合酶, 货号C10966-018, 选购自杭州沃森生物技术有限公司;2×Reaction Mix, 选购自天根生化科技 (北京) 有限公司;PCR Marker DL2000, 北京三博远志生物技术有限责任公司;Tris饱和酚、蛋白酶K、丙烯酰胺、二甲基甲酰胺等其他试剂均选购自上海欣百诺生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备

实时荧光定量PCR仪 (型号:TL988-Ⅰ型, 48孔) ;电泳仪 (型号:6C) ;水平电泳槽 (型号:JY-SPBT) ;垂直板电泳槽 (型号:DYC-350L) ;凝胶成像系统 (型号ZF-258型) ;高速离心机 (型号:Mini Spin) ;移液枪 (型号:Finnpipette) 。

1.2 方法

1.2.1 常用试剂及缓冲液的配制

所有溶液和缓冲液均采用蒸馏水配置并高压灭菌。18%聚丙烯酰胺 (PAGE) 凝胶 (两板胶) :40%丙烯酰胺贮液10m L, 10×TBE 10m L, 10%过硫酸胺500μL, TEMED 50μL, 加双蒸水至50m L, 轻轻摇晃使其混匀;2显色液 (2%Na OH) :取无水Na OH 10g, 加入到500m L蒸馏水中, 使其溶解, 用时加入37%甲醛1m L, 现配现用;其他试剂和溶液的配制均参照相关文献的方法进行。

1.2.2 全血基因组DNA提取

用酚氯仿抽提法, 从冷冻血样中提取基因组DNA, 溶于TE中, 4℃保存。

1.2.3 引物设计

根据牛GHRH基因DNA序列, 引用Primer5.0生物软件设计引物表 (引物序列由河南中大生物工程有限公司合成)

1.2.4 PCR扩增

PCR扩增总体积为15μL, 其中2×Reaction Mix为7.5μL、Platinum Tap DNA聚合酶为0.15μL、上游引物GHRH 4S为0.2μL、下游引物GHRH4A为0.2μL、无菌水为5.95μL、DNA模板为1μL。

1.2.5 PCR产物电泳检测

将5μL PCR产物与1μL缓冲液均匀混合, 点样于浓度为1.5%琼脂糖 (0.21g琼脂糖, 14m L 0.5×TBE缓冲液) 在胶孔中进行凝固, 电压=50V, 电泳=50min, 进行溴化乙锭染色, 在紫外灯下观察结果, 利用凝胶成像系统拍照, 保存结果。

1.2.6 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳

SSCP具体操作步骤参照相关文献的方法进行。

1.2.7 分析图像

用凝胶成像分析系统进行照相分析。用EB对琼脂糖凝胶进行染色, 用紫外线照相。用Ag NO3/Na OH对聚丙烯酰胺进行染色和显色, 用白光照相。

1.2.8 DNA序列测定

经SSCP分析后, 将不同基因型个体的PCR扩增产物和对应的上、下游引物送交至河南中大生物工程有限公司进行后续工作。

2 结果

2.1 信阳水牛GHRH基因第4外显子区的PCR凝胶电泳检测

信阳水牛GHRH基因第4外显子区的PCR凝胶电泳检测结果, 见图1。

所合成的引物扩增基因组, 用浓度为1.5%的琼脂糖对其产物进行检测, 将扩增片段扩增至331bp, 保持条带清晰且特异性良好, 无引物带和杂带可直接用于SSCP分析。

2.2 信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PAGE凝胶电泳检测

信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PAGE凝胶电泳检测结果, 见图2。

根据电泳图发现了2种基因型, 一种为纯合子 (AA型) , 一种为杂合子 (AB型) , 并未发现BB型。

2.3 信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PCR产物的测序结果

信阳水牛GHRH基因的第4外显子区PCR产物的测序结果 (见图3、4) , 由图3、4可知, AB型在GHRH基因的的一种多肽物质, 它是一种生长激素正性调控因子, 具有促进垂体合成以及分泌生长激素的作用。研究表明, 注射GHRH可显著改善动物生长速度和肉质情况。

有研究表明, 直接测序法在Hanwoo牛的GHRH基因中发现了12个SNP, 并发现了-4241>T、CW (cold carcass weight) 和EMA (longissimus muscle area) 有明显的关联性, -4241>T的遗传效应为基因剂量依赖。Moody等人的研究结果表明, 牛GHRH基因的外显子3存在一个GHRH-HaeⅢ多态位点。而且, 赫福特牛和安格斯牛的A等位基因频率分别为0.07和0.70。但在本次研究中, 仅在信阳水牛群体中发现了AA、AB两种类型的个体。

通过对荷斯坦牛进行研究, 发现AA个体的乳脂产量较高;而Girolando奶牛的AB型个体泌乳期则明显高于BB型个体。Curi等人进行的肉牛GHRH外显子3HaeⅢ多态与生长和屠宰性状相关性分析中, 未发现其存在明显相关性。现有研究结果表明GHRH基因是在动物生长发育7066位点 (第4外显子区) 发现A→G突变, 导致Thr转化为Ala (见图5) ;在该基因的7122位点 (第4内含子区) 发现A→C突变。

3 讨论与结论

生长激素释放激素 (GHRH) 是经由下丘脑分泌得到和泌乳过程中一项重要的候选基因。在本研究中, 发现信阳水牛GHRH外显子4和内含子4内存在部分突变, 通过性状关联分析将发现该突变是否影响信阳水牛的乳肉性能。本研究的PCR扩增产物只包含部分内含子, 有可能在未扩增到的内含子里仍然存在部分突变位点, 这些突变有可能也影响信阳水牛的乳肉性能, 有待进一步研究。

摘要：本研究以52头中国信阳水牛血样为材料, 提取基因组DNA, 采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术 (PCR-SSCP) , 对信阳水牛的生长素释放激素 (GHRH) 基因中第4外显子的突变情况进行检测。经SSCP检测发现, 不同个体的PCR反应产物银染后有两种不同的带型, 分别命名为AA型和AB型。针对不同带型所对应的个体PCR产物进行测序, 结果表明, 在该基因 (GI:194719389) 的第4外显子70bp处发现A→G突变, A→G导致Thr转化为Ala, 在该基因的第4内含子6bp处发现A→C突变。

关键词：信阳水牛,GHRH基因,SNP,DNA提取,PCR-SSCP

参考文献

[1]王雷, 丁春华, 栾爽艳.我国水牛奶业的发展现状与开发前景[J].中国奶牛, 2008 (4) :8-10.

第1外显子 第6篇

线粒体转录因子B1 ( mitochondrial transcription factor B1, TFB1M) 由7 个外显子和6 个内含子组成[1], 是线粒体基因表达调控的重要因子, 同时是核基因编码的蛋白质, 其表达受过氧化物体增值活化受体辅活化因子1 ( PGC -1γ) 、核呼吸因子1 和2 ( NRF - 1, NRF - 2 ) 等核转录因子严格调控[2,3]。TFB1M和线粒体转录因子B2 ( mitochondrial transcription factor B2, TFB2M) 、线粒体RNA聚合酶 ( mitochondrial RNA polymerase, POLRMT) [4], 以及线粒体转录因子A ( mitochondrial transcription factor A, TFAM) [5]共同组成线粒体基因组 ( Mitochondrial DNA, mtDNA) 基本转录机器。mtDNA编码能量代谢和大分子生物合成过程中许多关键组分[6], 当能量摄入量大于消耗量时, 肥胖细胞增多继而导致脂肪沉积。而TFB1M是线粒体基因表达调控的重要因子, 近年来对其研究也逐步深入。大理石纹常作为评价肉质性状的一个重要指标寻找与大理石纹有关联的基因对优良肉质动物的选育有重要意义。Jiang等[7,8]发现TFAM与大理石纹显著相关是调节脂肪代谢重要因子, 调控动物脂肪沉积, 表明mtDNA转录机器调控动物脂肪沉积。而TFB1M作为mtDNA转录机器一员, 可能对大理石纹形成也存在相关作用。

贵州黑山羊和贵州白山羊作为地方优良品种, 近年来对其研究多集中在生长与繁殖方面, 而对其肉质关联的研究基本没有。本实验利用贵州黑山羊、贵州白山羊进行DNA池构建, PCR产物直接测序, 进行TFB1M基因多态性位点 ( single nucleotide polymorphism, SNP) 筛查, 并对SNP位点进行等位基因频率估算和生物信息学分析。

1 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1实验材料

实验动物分别来自两个山羊品种的中心产区。其中, 贵州黑山羊103 只来自贵州省毕节市纳雍县鹏腾生态农牧综合开发有限公司, 贵州白山羊146 只来自贵州省铜仁市沿河县贵州白山羊种羊场。实验山羊经颈静脉采血8mL, 装于肝素纳抗凝管中, 快速摇匀, 暂放进冰盒内, 带回后于- 40℃ 条件保存。

1. 1. 2 试剂

血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖、核酸染料、DL2000 DNA Marker和Mixture等购自上海生工生物工程股份有限公司; 双蒸水、TBE缓冲液等为作者实验室自备。

1. 1. 3 仪器

PCR仪和凝胶成像系统 ( 美国Bio. Rad公司) ;电泳仪及电泳槽 ( 北京六一仪器厂) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 构建DNA池

采用试剂盒提取DNA法, 提取2 个山羊品种DNA, 检测提取效果后, 2 个山羊DNA池浓度调至100 ng/μL, 分别从2个山羊DNA样品中提取3μL混合, 构建贵州黑山羊和贵州白山羊DNA池。

1. 2. 2 引物设计和PCR反应

依据TFB1M基因在NCBI数据库中的DNA参考序列 ( GenBank登录号: AC_000166. 1) 在线设计1 对特异性引物, 见表1。PCR反应体系为20 μL: 模版DNA 2 μL, 上、下游引物 ( 10 pmol/μL) 各1. 5 μL, 2 × Taq PCR Master Mix试剂10 μL, ddH2O 5μL。采用TC - 512PCR仪进行DNA扩增, 扩增条件:94℃ 5 min; 95℃ 30 s, 58. 3℃ 30 s, 72℃ 30 s, 72℃ 10 min, 35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1. 2. 3 估算等位基因频率计测量测序图峰高

PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司纯化后双向测序。利用DNAstar软件对测序结果进行校正, 比对后分析确定SNPs。结合MWSnap测量各SNP位点等位基因的相应峰高。根据公式 νi= hi/ ( ha+ hb) , i = a, b估算等位基因频率[9]。νi- SNP位点某等位基因频率, ha- 该SNP等位基因a峰高度, hb- 该SNP等位基因b峰高度。

1. 2. 4 TFB1M的生物信息学分析

参照谢海强等[10]分析外显子多态性方法, 利用RNA二级结构在线软件分析TFB1M基因突变前后导致的RNA二级结构结构变化; 同时利用蛋白质二级结构和三级结构在线软件对突变前后不同蛋白质结构变化进行分析。

2 结果与分析

2. 1 PCR产物扩增测序结果

TFB1M基因PCR产物目的序列共933bp, 见图1。返回的测序结果与所参考的牛TFB1M基因DNA序列 ( GenBank登录号: AC_000166. 1) 基本相符, 确定为所需山羊序列。DNAstar软件比对分析发现2 个SNPs, 分别为: A76G和T221G, 均为新发现位点, 详见图2。

M: DL2000 Marker; H: 贵州黑山羊; B: 贵州白山羊。M: DL2000 Marker; H: Guizhou black goat; B: Guizhou white goat.

2. 2 SNPs等位基因频率估算结果

根据公式, 将所测贵州黑山羊和贵州白山羊2 个SNPs等位基因峰高结果进行频率估算。估算结果见表2, 据所得结果可看出, 贵州黑山羊在第7 外显子编码区有两个突变碱基, 贵州白山羊只存在一个突变碱基。

H: 贵州黑山羊; B: 贵州白山羊。H: Guizhou black goat; B: Guizhou white goat.

2. 3 TFB1M的生物信息学分析

2. 3. 1 突变前后TFB1M基因RNA二级结构预测

分析结果显示, TFB1M基因RNA二级结构最小自由能发生改变, 贵州黑山羊由-195. 7 kJ/mol变为-194. 6 kJ/mol, 由数据可知, 突变导致其二级结构最小自由能降低, 结构变稳定。详见图3。

2. 3. 2 蛋白质二级、三级结构分析

在线预测贵州黑山羊、贵州白山羊TFB1M基因突变前后蛋白质二级结构变化。表明突变前后, 贵州黑山羊 β 转角由19 变成15, α 螺旋由157 变到163, 自由卷曲由118 变到115, 延伸链由47 变到48; 贵州白山羊 β 转角、α 螺旋、自由卷曲及延伸链均无变化。详见表3。

蛋白质具有的功能取决于其空间结构, 而蛋白质三维结构预测在蛋白质研究领域具有重要地位。依据同源模建原理, 分析突变引起氨基酸序列改变后蛋白质三维结构变化。利用Phyre2 三级结构预测服务器, 提交突变前后贵州黑山羊、贵州白山羊氨基酸序列, 结果显示TFB1M蛋白三维结构构象发生改变。贵州黑山羊 β 折叠链由14% 增加到15%, α 螺旋由42%增加至46%, 混乱度也有13% 上升到14%; 贵州白山羊未有改变。详见图4。

3 讨论

基因SNP位点与相关肉质性状关联性分析, 已成为基本的研究方法之一。马向辉[11]等利用突变位点与体尺和肉质性状的关联性分析发现杂合子ABCD在胴体方面优于其他基因型。大理石纹是肉质性状的重要指标之一, 陈春华[12]等对CAST基因多态位点与甘肃肉牛大理石纹等性状相关性进行实验性研究。此外, 内含子多态性与大理石纹关联性分析也有相关研究[13]。同时, 通过分析多态位点与IMF含量的相关性, 也可为肉用山羊的分子选育提供相关依据[14]。然而, 目前关于山羊这一重要家畜TFB1M基因与大理石纹及IMF的相关研究比较匮乏。

线粒体是细胞内氧化磷酸化, 生成ATP及脂肪酸的 β -氧化等许多代谢的场所[15]。组成mtDNA的转录机器对一些与线粒体相关疾病的发生及某些生物过程的形成具有重要作用[16]。TFB1M在mtDNA转录过程中起到激活作用, 与TFAM、TFB1M及RNA聚合酶一起完成mtDNA的转录等过程[17]。TFB1M不仅起到转录因子的作用, 且在核糖体RNA甲基化中具有一定功能[18]。Kip E. Guja等认为TFB1M介导核糖体RNA修改小核糖体亚单位, 并证明其在影响线粒体功能过程中发挥作用[19]。Jiang Z等[20]通过在TFAM启动子区发现的两个SNP位点进行基因分型, 发现两个位点对大理石纹和皮下脂肪沉积有显著影响, 而TFB1M和TFAM同是mtDNA转录机器的转录因子, 且两者功能关系密切, 推测TFB1M对大理石纹和皮下脂肪沉积同样存在较大影响。

本实验首次在山羊TFB1M基因中鉴定得到SNP位点。其中A76G是精氨酸 ( Arg) 的同义突变; T221G是将半胱氨酸 ( Cys) 变为甘氨酸 ( Gly) 的错义突变。比较2 个多态性位点等位基因频率, 发现贵州黑山羊拥有A76G和T221G两个突变位点, 而贵州白山羊只有A76G发生突变, 这一发现是否在其他山羊品种中也有所不同, 需要进一步扩大山羊的品种及数量进行研究; 突变后TFB1M基因RNA二级结构最小自由能降低, 且TFB1M蛋白质二级、三级结构均发生变化。表明, 突变对TFB1M基因有所影响, 可用于下一步的关联性分析实验。

为山羊的选育工作以及整个mtDNA转录机器成员在山羊中的调控研究奠定基础。

4 结论

本实验在贵州黑山羊和贵州白山羊TFB1M基因均发现突变位点, 且对TFB1M基因RNA二级结构及蛋白质三级结构有一定影响, 可进一步与山羊大理石纹及其他肉质性状做关联性分析, 以期发现有利肉质风味基因型。

摘要：目的:研究TFB1M基因编码区多态性, 筛选出对山羊肉质有显著影响的SNPs位点, 以期为山羊品种选种选育提供科学依据。方法:采用DNA池结合PCR直接测序技术分析TFB1M基因在贵州本地山羊的多态性, 估算等位基因频率, 利用在线软件分析TFB1M基因RNA二级结构及其蛋白二级、三级结构。结果:在TFB1M基因中筛选到2个SNPs:A76G和T221G, 其中A76G为同义突变;T221G错义突变, 导致编码的半胱氨酸 (Cys) 变为甘氨酸 (Gly) 。RNA二级结构最小自由能改变, 贵州黑山羊RNA二级结构稳定性增强。贵州黑山羊β折叠链增加1%, α螺旋增加4%, 混乱度也上升1%。β转角减少4, α螺旋增加6, 自由卷曲减少3, 延伸链增加1。结论:SNPs位点对TFB1M基因RNA二级结构及其蛋白结构均有影响。

第1外显子 第7篇

MHC抗原由多肽结合区、类免疫球蛋白区、跨膜区和胞质区组成, 在家畜机体的免疫系统中发挥重要作用, 其中多肽结合区是决定其抗原呈递功能的结构域, 由MHC第2外显子编码。试验结果表明:虽然MHC的抗原种类很多, 但主要由DR抗原和DQ抗原发挥作用。因此, 有关MHC的报道多集中于DR基因和DQ基因的第2外显子上。绵羊的MHC称为OLA, 位于第20号染色体上, 具有高度的多态性和连锁不平衡。根据MHC抗原结构和功能的不同, 可将MHC分为Class Ⅰ基因、Class Ⅱ基因和Class Ⅲ基因。绵羊ClassⅡ基因区域有DR和DQ 2个亚区, DRB和DQB 2个基因位点所编码的MHC抗原在其免疫系统中发挥最主要的作用。试验通过建立绵羊MHC-DRB3基因PCR-RFLP的最佳反应体系和反应过程, 有助于MHC-DRB3基因第2外显子多态性的研究, 旨在为新疆军垦型细毛羊种质资源的抗病育种奠定理论基础, 为今后在分子水平上深入研究其抗病抗逆性基因提供科学依据。

1 材料

1.1 试验动物及来源

自新疆石河子150团紫泥泉种羊场选成年新疆军垦型细毛羊36只, 颈静脉采血25 mL/只, 以ACD 抗凝, -20 ℃保存, 备用。

1.2 主要试剂

蛋白酶K、Marker、dNTP、Taq聚合酶、PstⅠ内切酶、TaqⅠ内切酶、琼脂糖、苯酚、十二基烷硫酸钠 (SDS) , 宝生物工程 (大连) 有限公司生产;丙稀酰胺, 北京鼎国生物公司生产;绵羊MHC-DRB3 基因引物, 上海生工生物工程技术服务有限公司生产;无水乙醇等常规试剂均为国产分析纯。

2 方法[1,2,3,4,5]

2.1 DNA提取与检测

取冻存血样2 mL, 室温融化后加入等体积的PBS混匀;8 000 r/min室温离心10 min, 弃上清液;加入1 mL裂解缓冲液混匀, 37 ℃温育1～2 h;加入蛋白酶K至终浓度为100 μg/μL, 55 ℃水浴消化过夜;加入等体积饱和酚抽提3次, 2倍冰无水乙醇沉淀DNA;挑出沉淀, 70%乙醇冲冼, 待痕量乙醇挥发干净, 加入适量TE溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测所提取DNA的质量, -20 ℃保存, 备用。

2.2 PCR扩增体系

参照Amills M等[4]报道的西班牙山羊MHC-DRB3基因第2外显子的引物序列合成引物扩增MHC-DRB3基因第2外显子。PCR反应体系 (25 μL) :ddH2O 16.25 μL, 10PCR Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, 2.5 mmol/L MgCl2 2.0 μL, 50 μmol/L DRB3F 0.5 μL, 50 μmol/L DRB3R 0.5 μL, Taq聚合酶0.25 μL, 基因组1 μL。反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性1 min, 63 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 共29个循环;72 ℃延伸6 min, 4 ℃保存。

2.3 PCR产物的浓缩

PCR产物中加入1/10体积的NaAC (3 mol/L, pH值为5.0) 混匀, 再加入2倍体积的95%预冷乙醇, 即有沉淀析出;4 ℃放置10 min, 10 000 r/min室温离心10 min, 弃上清液;再用等体积的70%乙醇洗涤沉淀2次, 10 000 r/min室温离心5 min, 弃上清液;干燥沉淀, 加入24 μL灭菌双蒸水溶解沉淀。

2.4 PCR产物的酶切

分别取PCR浓缩产物8 μL, 加入0.5 U TaqⅠ、PstⅠ, 酶切缓冲液1 μL, 37 ℃温育3 h。取酶切产物10 μL, 加缓冲液2.0 μL, 用3.5%琼脂糖凝胶或12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2.5 数据处理

采用SPSS软件对基因频率、基因型频率进行计算, Hardy-Weinberg平衡的X2适合性检验。

3 结果

3.1 PCR扩增结果

用3.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 (100 V, 30 min) , 根据Marker估测扩增片段的分子大小, 结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1～12.扩增产物。

由图1可知, 扩增片段大小为285 bp, 与预期相符。

3.2 PCR-RFLP结果

分别采用限制性内切酶TaqⅠ、PstⅠ对新疆军垦型细毛羊MHC-DRB3基因第2外显子的PCR产物进行酶切。试验结果表明:内切酶TaqⅠ无多态;内切酶PstⅠ出现了3种基因型, 分别命名为AA (285 bp) 、BB (270 bp/15 bp) 、AB (285 bp/270 bp/15 bp) , 含A、B 2个等位基因控制, 基因型和等位基因的酶切片段及基因频率和基因型频率见表1, 酶切结果见图2、图3。

3.3 PCR-RFLP的统计分析

对新疆军垦型细毛羊MHC-DRB3基因第2外显子的3种基因型和2种等位基因进行统计分析, 试验结果表明:新疆军垦型细毛羊的等位基因A、B的频率差异极显著 (P<0.01) , 基因型BB和等位基因B是新疆军垦型细毛羊的优势基因型和优势基因。X2适合性检验的结果表明, 新疆军垦型细毛羊MHC-DRB3基因的PstⅠ酶切位点处于Hardy-Weinberg平衡状态 (P>0.05) 。

注:同列数据肩标**表示差异极显著 (P<0.01) 。

1.PCR扩增产物;2.空白对照;3.DL-2 000 Marker;4～15.BB。

1, 14. DL-2 000 Marker;2～7, 12.BB;8, 9, 11, 13.AB;10.AA。

4 讨论

通过对抗凝剂、模板的浓度及纯度, Mg2+浓度, 引物浓度, Taq聚合酶和退火温度对扩增产物的影响的研究, 优化并建立了新疆地方绵羊MHC-DRB3基因的PCR-RFLPs 的最佳反应条件。在此基础上对新疆地方培育品种军垦型细毛羊MHC-DRB3基因第2外显子进行多态性分析, 试验结果表明:经PstⅠ限制性内切酶酶切后出现了AA, BB和AB 3种基因型, 这与Amills M等[4]所报道的西班牙山羊及孙东晓[6]报道的蒙古羊和哈萨克羊MHC-DRB3基因第2外显子的PstⅠ的酶切多态性是一致的。但TaqⅠ在西班牙山羊、蒙古羊和哈萨克羊上存在多态性, 而在新疆军垦型细毛羊上酶切后无多态性。分析原因可能是军垦型细毛羊是在新疆地区特殊的地理环境和气候条件下长期培育而成的地方品种, 具有抗逆性、抗病力强的特点。新疆军垦型细毛羊能经受长途跋涉, 能在海拔5 200 m的高山草场抓膘放牧。冬季可在30～40 cm厚的积雪上扒雪吃草, 夏季能忍受炎热气候, 在半荒漠地带的农区抢茬放牧。无论是在山区常年放牧, 还是在农区长期舍饲, 新疆军垦型细毛羊均表现出较高的生产性能和良好的适应能力, 因此与其他品种存在差异。由于MHC突出的特性和其在免疫遗传学、群体遗传学和抗病育种学等领域中的重要作用, MHC多态性可作为品种特征。MHC基因是否与绵羊对疾病的易感性和抗病力有关, 还需要收集更多的疾病记录与MHC基因的基因型进行相关性分析。但是由于MHC基因与疾病抗性和易感性存在正强相关关系, 可作为抗病育种的遗传标记辅助选择的重要位点来培育出高产、抗病力强的家畜品种。因此, 该领域将会成为抗病育种的焦点, 具有极为广阔的发展潜力。此次的研究结果可为新疆地方绵羊的抗病选育提供初步的理论依据。

参考文献

[1]曹红鹤.限制性内切酶片段长度多态性在几个绵羊品种中的研究[J].畜牧兽医学报, 1994, 25 (5) :406-411.

[2]陈克飞.猪ESR基因的PCR-RFLPs多态性分析[C]//第十次全国动物遗传育种学术讨论会议论文集.北京:中国农业科技出版社, 1999.

[3]聂庆华.鸡生长激素基因RFLP的检测[C]//第十次全国动物遗传育种学术讨论会议论文集.北京:中国农业科技出版社, 1999.

[4]AMILLS M, FRANCINO O N.PCR allows the characterization of TaqⅠand PstⅠRFLPs in the second exon of the caprine MHC ClassⅡDRB gene[J].Veterinary Immunology and Immuopathology, 1995, 48:313-321.

[5]WUZ F.Study on the polymorphism of porcine hormone sensitive li-pase gene by PCR-RFLP[J].Journal of HuaZhong Agricultural U-niversity, 2000, 3:194-197.

第1外显子 第8篇

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 正常对照组选取无血缘关系的正常健康人共100 例。其中男54 例,女46 例;最大年龄75 岁,最小年龄21 岁,平均(56.3±13.2)岁。均为湖南省第二人民医院健康体检人员,病史询问无脑卒中家族史,无肝、肾、血液病、自身免疫性疾病和甲状腺病史。

1.1.2散发性脑梗死组选取无家族聚集现象的散发性脑梗死患者共110例。男63例,女47例,最大年龄86岁,最小年龄32岁,平均(57.2±13.5)岁。其中脑血栓形成组(cerebral thrombosis,CT)及腔隙性脑梗死组(lacunar infarction,LI)分别为77例和33例;有高血压的脑梗死组(HBP+CI)及无高血压的脑梗死组(非HBP+CI)分别为78和32例;有糖尿病的脑梗死组(DM+CI)及无糖尿病的脑梗死组(非DM+CI)分别为10和100例。均为湖南省第二人民医院神经内科2012年6月-2014年1月住院和门诊患者。所有病例均符合1995年全国第4次脑血管疾病学术会议修订的诊断标准[9],经头颅CT或MRI确诊。不包括心源性、动脉炎、外伤、血液病、药物、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑卒中;排除患有严重肝肾疾病、甲状腺疾病、血液病和最近3个月服用雌激素患者,近2周均未服用降血脂药和抗凝药。

1.1.3脑梗死家系组收集10个脑梗死家系共包括成员110例。先证者为湖南省第二人民医院神经内科2012年6月-2014年1月住院和门诊,其中,男61例,女49例,最大年龄78岁,最小年龄15岁,平均(55.4±12.6)岁。其中患病者42例,未患病者68例。

1.2 方法

1人基因组DNA样品的制备:抽取研究对象外周静脉血4 ml,肝素抗凝,用常规酚/ 氯仿抽提法提取DNA。2P47phox基因型检测:扩增P47phox基因第4外显子的引物经Primer Premier 5.0 软件设计,所得引物序列为:正向引物:5'-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3';反向引物:5'-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3'。反应在PE4800 型PCR仪上进行,反应条件为:94℃预变性5 min,93℃变性40 s,56℃复性30 s,72℃延伸1 min,30 个循环后,72℃充分延伸10 min,反应管冷却至4℃。3单链构象多态分析:取4μl PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物,如特异性好,则将PCR产物加等量2×变性载样缓冲液,混合后95℃变性10 min,然后立即置冰上5 min,取8μl上样于含5%甘油的8% 49∶1 的中性聚丙烯酰胺凝胶中,160 V电压4℃电泳10 h,电泳结束后采用银染法染色并拍照。选取中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中有异常泳带的阳性样本进行正反向测序。测序结果在Gen Bank和SNP数据库中进行比较分析。4血脂和脂蛋白的测定:采用氧化酶法测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL);免疫比浊法测定载脂蛋白A-I(apo A-I)及载脂蛋白B100(apo B100);ELISA法测定血清脂蛋白a[Lp(a)]水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析,所有资料在Dbase软件中建立数据库,等位基因频率=(2×纯合子+ 杂合子)/(2×受检人数),基因型频率和等位基因频率的差异用 χ2检验或有关校正方法。按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性。组间血脂比较用t检验,不同基因型亚组间血脂比较用ANOVA方差分析及LSD-t检验,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死组和对照组的临床特点

脑梗死组、脑梗死家系组两组中有高血压病史、糖尿病病史者高于对照组(P <0.01),脑梗死组和脑梗死家系组间差异无统计学意义(P >0.05);3 组在年龄、性别构成、体重指数、吸烟及饮酒史差异无统计学意义(P >0.05)(见表1)。

2.2 P47phox基因第4 外显子G338A多态性分析

P47phox基因第4 外显子G338A有3 种不同的电泳图谱,经测序后证实分别为GG,GA和AA 3 种基因型(见图1~3)。

2.3 P47phox基因第4 外显子G457A多态性分析

P47phox基因第4 外显子G457A有两种不同的电泳图谱,经测序后证实分别为GG和GA两种基因型(见图4~5)。

2.4 P47phox基因G338A多态分布

脑梗死组与对照组基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P >0.05)。脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系组中患病与未患病与对照组G338A多态A等位基因频率分布比较,差异均有统计学意义(P <0.01),见表2。

注:+与对照组比较,P<0.01

2.5 P47phox基因G457A多态分布

脑梗死组与对照组基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P >0.05)。脑梗死组及其两组各自亚型组与对照组G457A多态基因频率分布比较,差异无统计学意义(P >0.05),见表3。

2.6 P47phox基因G338A和G457A多态对血脂、脂蛋白水平的影响

脑梗死组血清TC、TG、LDL-C及Lp(a)水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P <0.01);组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05)。见表4~5。

注:+与对照组比较,P <0.01

注:+与同一基因型不同组间比较,P <0.01

注:+与同一基因型不同组间比较,P <0.01

3 讨论

NADPH氧化酶即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶,又称还原型辅酶Ⅱ氧化酶,其由催化亚基gp91phox,跨膜亚基p22phox,胞浆亚基p47phox、p67phox、p40phox、小G蛋白Rac和Rapl A等组成的酶复合体。研究发现[10],NADPH氧化酶可能是体内生成ROS的主要酶体。当细胞受到刺激后,细胞质亚基p47phox转位至胞膜,与膜上亚基结合激活NADPH氧化酶[11],激活后的NADPH氧化酶经过系列反应产生ROS。可见,ROS的产生过程p47phox发挥了始动功能[12]。p47phox即吞噬细胞氧化酶47 千道尔顿蛋白质,又名嗜中性粒细胞胞质因子1(neutrophil cytosol factor 1,NCF-1),其功能区由5 个功能域组成,翻译产物是一个长度为399 个氨基酸的片段[13]。目前研究发现,ROS可刺激内皮细胞释放血管细胞黏附分子(vascularcell adhesion molecule-1,VCAM-1)、单核细胞趋化因子(mon-ocyte chemoattractant protein,MCP-1)等细胞因子,使单核细胞向血管壁聚集,形成泡沫细胞,反过来泡沫细胞又可以释放氧和过氧化氢。另外,中等量的ROS产物可作为细胞内的第2 信使,通过激活血管平滑肌细胞与生长相关的信号传导系统引起血管平滑机细胞的增生;并通过调节平滑肌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,参与血管重塑及引起斑块破裂[14,15,16],因此它与血管性疾病的发生有密切关系。也有研究发现活性氧与缺血性卒中、动脉粥样硬化的形成、高血压、高脂血症、糖尿病等疾病密切相关,是血管性疾病的危险因素[3,4,5,6,7,8]。可见,p47phox与高血压病、动脉粥样硬化形成和缺血性卒中等血管性疾病和糖尿病、高脂血症密切相关。若编码NAD(P)H氧化酶亚单位的基因多态性或基因突变使ROS生成增加,就可能通过直接氧化作用和间接作为第2 信使参与信号转导加速动脉粥样硬化形成、高血压病、糖尿病和高脂血症的发生与发展,从而使其对脑卒中的易感性增加。

P47phox在ROS产生过程中的功能PX区和两个SH-3 区密切相关, 而第4 号外显子上G338A(Arg90His)、G457A(Thr129Thr)多态是其中的多态位点。本研究结果显示,在中国湖南省汉族人群中G338A(Arg90His)多态位点有GG,GA和AA 3 种基因型;G457A(Thr129Thr)多态位点有GG、GA两种基因型,未发现AA基因型。目前该两个多态位点在不同人种的分布情况国内外尚未见报道,并且G457A(Thr129Thr)为首次发现的新多态位点。在研究P47phox第4 外显子多态位点与湖南汉族人群脑梗死相关性中发现,脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系中患病组与未患病组G338A多态A等位基因频率分布与对照组比较,差异有统计学意义(P <0.01)。脑梗死组及其各亚型组、脑梗死家系中患病组与未患病组G457A多态基因频率分布与对照组比较,其差异无统计学意义(P >0.05)。以上结果提示p47phox基因G338A多态A等位基因可能是脑梗死,尤其是有高血压病的、有糖尿病的脑梗死患者的一个危险因素;P47phox基因G457A多态性可能与脑梗死无关。另外发现,脑梗死组及其各亚型组血清TC、TG、LDL-C及Lp(a)水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P <0.01);组内不同基因型间血脂、脂蛋白水平与对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05)。可见,湖南省汉族人群P47phox基因第4 号外显子多态性可能与血脂代谢有关。