肠道免疫细胞范文（精选8篇）
肠道免疫细胞 第1篇
1 材料
体重为 (100±10) g, 体长为 (15±2) cm的试验用罗非鱼, 由广西水产研究所国家级罗非鱼良种场提供。无乳链球菌GX035弱毒苗, 广西水产研究所鱼类病害防治实验室提供。透射电镜 (型号为H-7650) , 日立高新技术 (上海) 国际贸易有限公司生产。
2 方法
2.1 饲养管理
将罗非鱼分别饲养于室内水箱中 (规格为70 cm50 cm40 cm) , 各组水质均为脱氯自来水, 昼夜24 h充氧。试验期间水温保持在27~29℃, 每周换水2/3, 每天投喂2次料 (8:00和16:00) , 日投喂率为2%~3%。
2.2 试验分组及处理
选用体重为 (100±10) g, 体长为 (15±2) cm的健康罗非鱼共30尾, 随机分为对照组和试验组, 每组15尾。驯养2周后, 试验组投喂浓度为1.0109cfu/m L的口服型无乳链球菌GX035弱毒苗 (每100 g饲料用100 m L相应浓度的菌悬液拌匀后在50℃烘箱中烘干) , 按照每尾鱼2.5 g的饲料进行投喂, 对照组投喂等量未添加疫苗的饲料。
2.3 标本的采集制备及观察
免疫15 d, 从各组中随机选取2尾罗非鱼进行解剖, 迅速取出前肠、中肠、和后肠 (前段在胃后端至肠的第1个弯曲之间取材, 中段在肠的第1个弯曲至最后一个弯曲之间取材, 后段在最后一个弯曲至肛门之间取材) , 2.5%戊二醛溶液固定, 4℃保存。按照常规透射电镜制样方法制样, 采用透射电镜 (型号为H-7650) 观察并摄片。
3 结果与分析
利用透射电镜 (型号为H-7650) 观察发现, 对照组罗非鱼肠道黏膜上皮细胞主要包括柱状上皮细胞、杯状细胞以及少量淋巴细胞, 基底膜附近偶见少量肥大细胞且胞质中颗粒较少, 无空泡;各段肠道黏膜上皮的细胞形态无明显差异, 但杯状细胞和肥大细胞在后肠的分布密度略大于前肠和中肠 (见图1A) 。由于试验组各肠段上皮细胞受到弱毒苗刺激, 使得其分泌功能增强, 因此各种上皮细胞游离端胞浆内高电子密度的线粒体、吞饮小泡、溶酶体以及脂肪滴显著增多;此外, 前肠段可见较多的多泡体, 上皮细胞微绒毛刷状缘基部形成连通细胞质与微绒毛的通道, 中肠段可见大量粗面内质网和次级溶酶体, 主要存在于吞饮小泡周围 (见图1B、图1C) 。各肠段杯状细胞内黏液分泌泡明显增多, 呈分泌旺盛状态, 顶部开口于肠腔 (见图1D) 。在弱毒苗的作用下, 各免疫组肠道黏膜中淋巴细胞增多, 可见巨噬细胞、浆细胞等, 这些细胞胞浆内线粒体增多, 粗面内质网发达, 以前肠、后肠变化最明显 (见图1E) 。由此可以推断, 罗非鱼链球菌弱毒苗引起的肠道免疫主要发生在前肠和中肠段。试验组各肠段基底膜附近较易观察到肥大细胞, 其胞质中充满高密度的颗粒, 呈现活跃的分泌状态 (见图1F) 。
4 讨论
鱼类生活在水环境中, 黏膜在鱼体大部分面积均有覆盖, 是病原侵染鱼体时最先接触的部位。动物肠道内存在多种微生物, 巩华等[10]研究表明, 硬骨鱼类肠黏膜可识别有害物质的入侵, 吞噬排出异己物质, 因此肠黏膜是硬骨鱼类预防疾病的一道重要防线。
鱼类的肠道可分为前肠、中肠和后肠三部分, 从前向后黏液细胞的数目逐渐减少, 而且以杯状细胞为黏液细胞发育的成熟状态[11]。黏液细胞分泌的黏液中含有黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶类等多种非特异性的免疫活性物质, 可以抵抗病原微生物入侵[12]。杨桂文等[13]通过免疫电泳证明黏液中含有免疫球蛋白为黏液球蛋白, 与血清免疫球蛋白具有一定的相似性。此外, J.H.Rombout等[14]通过试验发现, 口服疫苗可刺激肠黏液细胞, 提高其分泌免疫球蛋白的能力, 但免疫后肠黏液中的免疫球蛋白含量比血清中免疫球蛋白的含量高出4倍, 表明黏液免疫球蛋白与血清免疫球蛋白对抗原的反应具有一定差异。研究表明, 各免疫组肠道的杯状细胞明显多于对照组, 细胞内黏液分泌泡显著增加, 分泌功能旺盛, 顶部开口于肠腔, 其中后肠的变化最显著, 认为罗非鱼经口服型无乳链球菌弱毒苗免疫后, 其肠道黏液细胞经刺激后分化成熟, 分泌功能增强, 可向肠腔中分泌大量免疫球蛋白等免疫活性物质, 从而提高鱼体免疫力。
B.Fuglem等[15]对鱼肠抗原摄取细胞进行研究发现, 金-BCA检测呈阳性的上皮细胞的刷状缘基底部分布有众多延伸至细胞质的小通道, 游离端细胞质电子密度高且高度空泡化;凝集素试验证明, 这类细胞与哺乳动物M细胞具有相同的区域特性, 并与哺乳动物未成熟的M细胞在形态上具有一定的相似性。研究中, 免疫组前肠可观察到上皮细胞微绒毛刷状缘基部形成连通细胞质与微绒毛的通道, 与相邻肠道上皮细胞相比, 游离端细胞质更加液泡化, 电子密度也随之增加, 推断此类上皮细胞表型的出现可能与肠黏膜摄取抗原有关。
巨噬细胞等是鱼类肠道参与吞噬作用的主要细胞。J.H.Rombout等[14]报道, 鲤鱼的肠道具有免疫学功能, 特别是后肠的巨噬细胞等免疫相关细胞具有抗原呈递作用。研究发现, 试验组罗非鱼后肠有大量大型巨噬细胞, 这些细胞胞质内线粒体增多, 粗面内质网发达, 处于功能活跃状态, 该结果证实了后肠对抗原呈递的作用。肥大细胞是一种高度特异的分泌细胞, 具有抗原呈递及吞噬功能, 在抗原刺激诱导下, 肥大细胞释放炎症介质, 呈现脱颗粒状态。试验组各肠段肥大细胞胞质中可见大量电子密度高的分泌颗粒, 表明肥大细胞分泌功能活跃, 免疫活性物质分泌增多。
线粒体是细胞生命活动所需能量的代谢中心, 是细胞生物氧化的主要场所, 三羧酸循环、氧化磷酸化和脂肪酸氧化均在此发生;核糖体则以mRNA碱基对为指令, 由氨基酸合成蛋白质, 是细胞合成蛋白质的场所;而粗面内质网主要参与蛋白质合成与修饰[14,15]。研究发现, 试验组各肠段上皮细胞以及淋巴细胞内均呈现线粒体、核糖体、溶酶体和脂滴增多的现象, 且内质网发达。在试验组前肠的上皮细胞游离端胞质内可观察到部分线粒体的片层状嵴呈锯齿状, 排列曲折, 这种现象大多见于代谢活性高的组织, 锯齿状嵴可增大线粒体自身表面积, 更适应高代谢率的需要[16]。此外, 还可观察到线粒体与脂滴相随现象, 该现象是指单个线粒体靠近或融合于一小脂滴表面或数个线粒体环绕着一个较大的脂滴, 其有利于脂质代谢的进行[17]。有人对脂滴与线粒体的研究证明, 脂质小滴通过与线粒体的相互作用, 可对其脂质代谢和能量平衡起到调节作用[18]。试验组肠道上皮细胞中上述细胞器数量增多, 并呈现功能活跃状态, 表明上皮细胞对蛋白质、脂类、糖类的代谢增强, 进而促进细胞分化发育, 特别是杯状细胞、淋巴细胞的增殖发育以及功能活化, 从而提高免疫机能。
经口服型无乳链球菌弱毒苗免疫后, 罗非鱼肠道黏膜中的杯状细胞、巨噬细胞、浆细胞、肥大细胞及上皮内淋巴细胞等相关免疫细胞增多, 超微结构发生变化, 均呈现功能活跃状态, 证实该疫苗可以增强罗非鱼肠道黏膜的屏障功能, 进而提高黏膜免疫。
摘要：为了对比观察链球菌弱毒苗使用前后罗非鱼肠道免疫相关细胞超微结构的变化, 探讨无乳链球菌弱毒苗对罗非鱼黏膜免疫的影响, 试验采用体重为 (100±10) g, 体长为 (15±2) cm的健康罗非鱼共30尾, 随机分为对照组和试验组, 每组15尾, 试验组投喂浓度为1.0×109cfu/m L的口服型无乳链球菌GX035弱毒苗, 对照组投喂等量未添加疫苗的饲料, 免疫后15 d, 对前肠、中肠、后肠的超微结构进行常规透射电镜观察。结果表明:与对照组相比, 试验组各肠段杯状细胞内黏液分泌泡明显增多, 呈分泌旺盛状态;巨噬细胞、浆细胞、肥大细胞等增多, 超微结构有变化, 呈现功能活跃状态。说明口服无乳链球菌弱毒疫苗可以提高罗非鱼肠道黏膜免疫。
肠道免疫细胞 第2篇
关键词：三丁酸甘油酯；建鲤；生长；体组成；肠道免疫功能
中图分类号： S96373文献标志码： A
文章编号：1002-1302（201412-0275-04
丁酸是肠道中存在的一种短链脂肪酸，在调节胃肠机能、肠道pH值、胃肠道微生态平衡以及诱食方面发挥重要作用[1]。然而丁酸极易挥发，在体内吸收代谢迅速，半衰期很短，目前生产实践中大多是以丁酸钠的形式添加，但丁酸钠易吸潮结块且有特殊臭味，不利于其广泛应用。三丁酸甘油酯（tributyrin，TB作为丁酸的前体物，几乎没有气味或略有脂肪香气，[JP2]使用方便，可在不改变丁酸生物学特性的前提下，提高其在体内血浆中的浓度并延长作用时间。研究表明，在饲料中添加适量三丁酸甘油酯，能促进动物肠道发育，提高机体免疫力，从而提高生产性能。但目前有关三丁酸甘油酯作用效果的研究主要集中在畜禽方面，对水产动物的影响鲜见报道。本研究通过在建鲤基础日粮中添加不同水平的三丁酸甘油酯，研究其对建鲤生长和肠道免疫功能的影响，筛选出合理添加量，旨在为三丁酸甘油酯在水产养殖中的应用提供参考。
1材料与方法
11试验材料
供试建鲤由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴试验基地提供，三丁酸甘油酯由南京苏科农业开发有限公司提供。
12试验设计与饲粮
选取20 g左右、体质健壮、规格整齐的建鲤600尾，随机分为4组，每组5次重复，每次重复30尾。分别对各处理建鲤投喂在基础日粮中添加0、250、500、1 000 mg/kg 三丁酸甘油酯的配合饲料。试验用基础日粮配方及营养成分见表1。
[F（W20][HT6H][J（]表1基础饲料配方及营养水平[J][HTSS][STB][JY]（风干基础，%
[HJ5][BG（！][BHDFG12，W8，W7，S7，W7W]配方原料含量营养水平含量
[BHDW][XXSX2-SX142]鱼粉100[XXSX2-SX132]干物质8871
[BHDW]豆粕200粗蛋白3352
菜粕260粗脂肪324
棉粕180粗灰分1052
面粉134
食盐03
玉米淀粉50
磷酸二氫钙18
豆油10
鱼油10
沸石粉 25
预混料10
合计1000[HJ][BGF]
注：预混料由南京华牧动物科技研究所提供，为1 kg日粮提供维生素A 1万IU、维生素D 2000 IU、维生素E 30 mg、维生素3 3 mg、维生素B1 6 mg、维生素B2 8 mg、烟酸 20 mg、泛酸钙 25 mg、胆碱 600 mg、维生素B6 5 mg、叶酸 1 mg、维生素B12 002 mg、生物素 01 mg、维生素C 100 mg、肌醇 100 mg、Fe 60 mg、Cu 5 mg、Mn 30 mg、n 50 mg、I 1 mg、Se 03 mg、Co 01 mg等。[F]
13饲养管理
试验在室外循环流水过滤水族箱（100 cm×100 cm×120 cm中进行，每箱30尾。试验为期42 d，其中驯化期7 d，正试期35 d。日投喂饲料3次（08：00、12：00、16：00，日投喂量为鱼体质量的2%～4%，并根据生长、摄食情况进行调整，以每次投饲后无残饵为宜。
14样品采集和处理
饲养试验结束后停饲1 d，于毎个重复中随机选取2尾鱼，取背鳍下方侧线以上的肌肉，去皮去骨后，105 ℃烘干后粉碎，用于测定肌肉成分。分离肠道，剔除周围脂肪组织，挤掉食糜，称取02 g肠道中段组织，按1 g ∶[G-3]9 mL加4 ℃生理盐水，在冰浴下匀浆，3 000 r/min离心15 min后取上清液分装入离心管中，-20 ℃冷藏备用，测定前于4 ℃冰箱中自然化冻，用于测定相关指标。
15测定指标与方法
151生长性能
试验开始和结束时，记录每个网箱中鱼的尾数、总质量、耗料量，测定特定生长率、增重率、成活率、饵料系数。计算公式如下：
特定生长率=[ln（终末均质量-ln（初始均质量]/试验时间×100%；
增重率=（终末体质量-初始体质量/初始体重×100%；
成活率=试验末鱼数/试验初鱼数×100%；
饵料系数=投饵量/鱼体增重。
152形体指标
于每个网箱里随机选取2尾鱼，测量体长；在冰盘上解剖并逐尾称取体重、肝胰脏重、去内脏的鱼重，计算建鲤的肥满度、脏体比、肝体比。计算公式如下：
[J]肥满度=（终末体质量/终末体长3×100%；
[J]脏体比=内脏质量/体质量×100%；
[J]肝体比=肝胰脏质量/体质量×100%。
153体成分指标
肌肉的粗蛋白含量采用全自动凯氏定氮仪测定，粗脂肪采用索氏抽提法测定，粗灰分采用马弗炉550 ℃灼烧法测定。
nlc202309041119
154肠道指标
肠道超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶活性和丙二醛、一氧化氮含量采用试剂盒（南京建成生物工程研究所方法测定。
16数据统计与处理
用Excel软件对数据进行初步处理后，采用SPSS 160软件进行统计，用单因素方差分析（one-way ANOVA进行差异显著性检验和Duncan多重比较，结果以“平均值±标准误”表示。
2结果与分析
21三丁酸甘油酯对建鲤生长性能的影响
如表2所示，添加250、500、1 000 mg/kg三丁酸甘油酯使建鲤增重率、特定生长率均有不同程度提高，饵料系数均有不同程度降低，其中增重率分别比对照提高593%（P>005、919%（P>005、1321%（P<005；特定生长率分别比对照提高415%（P>005、674%（P>005、933%（P<005；饵料系数分别比对照降低588%、353%、588%（P>005。[FL]
[F（W8][HT6H][J]表2三丁酸甘油酯对建鲤生长性能的影响[HTSS][STB]
[HJ5][BG（！][BHDFG3，W6，W9。6W]三丁酸甘油酯水平（mg/kg初始体质量（g终末体质量（g增重率（%特定生长率（%/d饵料系数成活率（%
[BHDG12]02972±0656078±1121045±182b193±002b170±0049600±125
[BHDW]2503008±1436326±1601107±386ab201±008ab160±0059533±249
5002831±0656060±1231141±223ab206±003ab164±0059333±105
1 0002806±0996108±1341183±435a211±005a160±0059733±067[HJ][BGF]
注：同列数据后不同小写字母表示在005水平上差异显著。下同。[F]
[FL（22]22三丁酸甘油酯对建鲤形体指标的影响
由表3可知，与对照相比，添加250、500、1 000 mg/kg三丁酸甘油酯对建鲤的肝体比、脏体比、肥满度均无显著影响，但脏体比均得到不同程度增加，分别增加253%、604%、435%（P>005。
23三丁酸甘油酯对建鲤体成分的影响
由表4可知，与对照相比，添加250、500、1 000 mg/kg三
[F（W7][HT6H][J]表3三丁酸甘油酯对建鲤形体指标的影响[HTSS][STB]
[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]三丁酸甘油酯水平（mg/kg肝体比（%脏体比（%肥满度（%
[BHDG12]0154±0111425±083274±006
[BHDW]250172±0261461±083261±006
500143±0181511±077278±008
1 000182±0171487±051268±007[HJ][BG）F][F）]
[F（W8][HT6H][J]表4三丁酸甘油酯对建鲤体成分的影响[HTSS][STB]
[HJ5][BG（！][BHDFG3，W62，W72。3W]三丁酸甘油酯水平（mg/kg粗脂肪（%粗蛋白（%粗灰分（%
[BHDG12]0302±0489028±069579±005
[BHDW]250306±0288934±036587±003
500329±0368952±029590±005
1 000360±0278926±018578±005[HJ][BGF]
注：粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量表示肌肉绝干样中的含量。[F]
丁酸甘油酯对建鲤体成分无显著影响，但肌肉粗脂肪含量得到不同程度提高，分别提高132%、894%、1921% （P>005；而粗蛋白含量分别降低104%、084%、113%（P>005。
24三丁酸甘油酯对建鲤肠道抗氧化和免疫指标的影响
如表5所示，與对照相比，添加250、500、1 000 mg/kg三丁酸甘油酯使建鲤肠道超氧化物歧化酶活性分别提高367%（P>005、728%（P>005、4433%（P<005，且有提高建鲤肠道一氧化氮合酶活性，降低丙二醛、一氧化氮含量的趋势（P>005。[FL]
[F（W8][HT6H][J]表5三丁酸甘油酯对建鲤肠道抗氧化和免疫指标的影响[HTSS][STB]
[HJ5][BG（！][BHDFG3，W12。5W]三丁酸甘油酯水平（mg/kg丙二醛（nmol/mg超氧化物歧化酶（U/mg一氧化氮（μmol/g一氧化氮合酶（U/mg
[BHDG12]01668±1891773±241b9624±8331875±323
[BHDW]2501557±3441838±154b8176±13122085±451
5001107±1331902±161b9172±10072100±431
1 0001441±4012559±272a9286±13452753±303[HJ][BG）F][F）]
[FL（22]3结论与讨论
31三丁酸甘油酯对建鲤生长性能的影响
研究表明，三丁酸甘油酯能够提高畜禽生长性能。刘统等研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加01%、02%三丁酸甘油酯均能有效改善仔猪日增重，降低料重比。刘小萍等也得到了类似结论。Antongiovanni等将02%、035%、05%、1%三丁酸甘油酯添加到肉鸡日粮中，肉鸡体重均明显增加[5]。本研究显示，添加不同水平的三丁酸甘油酯使建鲤增重率和特定生长率均不同程度提高，其中添加1 g/kg三丁酸甘油酯处理达到显著水平。三丁酸甘油酯在胰脂肪酶的作用下缓慢释放出丁酸、甘油，丁酸作为肠黏膜上皮细胞首选的能源底物，能促进肠道细胞增殖与成熟，维持小肠黏膜结构的完整性[6]，并能降低食糜的pH值，影响胰蛋白酶、脂肪酶等分泌和活性；减少肠道不耐酸的大肠杆菌、沙门氏菌等，并促进有益微生物生长[7]，从而提高动物生长性能。
nlc202309041119
32三丁酸甘油酯对建鲤形体指标的影响
鱼的肥满度是检验鱼体肥瘦的重要指标，肝体比、脏体比是判断肝脏和内脏发育及脂肪积累程度的重要标志。郑瑞耕试验发现，添加不同水平的丁酸钠对鲤鱼肝体比、内脏比均无明显影响[8]。孙浪等试验结果显示，添加丁酸钠对鲫鱼的脏体比无显著影响，但25 g/kg丁酸钠处理显著提高了鲫鱼肥满度[9]。丁酸是合成体脂的前体物质，其在肝脏中几乎全部被吸收，在代谢过程中会产生乙酰CoA[10]。Roediger认为，丁酸能够促进乙酰CoA合成脂肪，或通过羟甲基戊二酸单酰CoA途径促进酮体合成[11]。本研究显示，添加不同水平三丁酸甘油酯有提高建鲤脏体比的趋势，这可能是由于丁酸在肠道中转化为酮体和其他代谢物，调节了鱼体内的脂类代谢[12]；丁酸激活了细胞内mRNA蛋白质合成，促进肠道上皮细胞增殖，提高肠绒毛长度和隐窝深度，并增加其质量[13-14]。
33三丁酸甘油酯对建鲤体组成的影响
鱼体肌肉营养成分比较稳定，鱼类营养价值主要取决于肌肉中的蛋白质和脂肪含量。本研究发现，与对照相比，添加不同水平三丁酸甘油酯对建鲤体组成无显著影响，但肌肉粗脂肪含量均有不同程度提高，粗蛋白含量均有一定程度降低。原因可能是，三丁酸甘油酯分解产生的丁酸属于水脂两亲且偏重于亲脂，提高了粗脂肪的利用；也可能是三丁酸甘油酯分解产生的甘油、甘油一酯等促进了脂肪在肌肉的沉积。Chatzifotis等研究发现，大西洋白姑鱼全鱼和肌肉脂肪含量均随饲料脂肪水平的升高而增大[15]。向枭等在白甲鱼幼鱼上的试验也得到相似结论[16]。郑珂珂等也报道，瓦氏黄颡鱼鱼体脂肪、干物质含量随饲料脂肪水平的升高而显著升高，而鱼体蛋白质、水分含量则随着饲料脂肪水平的升高而降低[17]。这与本研究结果基本一致。
34三丁酸甘油酯对建鲤肠道抗氧化和免疫指标的影响
自由基能诱发细胞膜不饱和脂肪酸发生过氧化反应，终产物是丙二醛，其含量可反映脂质过氧化程度和机体抗氧化能力。超氧化物歧化酶能通过催化自由基 O-2[G-2]· [G-3]的歧化反应保护细胞免受损伤。张淞琳等试验发现，01%丁酸钠可提高美洲鳗鲡肝脏的总抗氧化能力和过氧化氢酶活力，减少丙二醛含量[18]。本研究显示，三丁酸甘油酯能提高建鲤肠道超氧化物歧化酶活性，减少丙二醛含量，其中添加1 g/kg三丁酸甘油酯处理可显著提高肠道超氧化物歧化酶活性，提示三丁酸甘油酯可改善建鲤肠道的抗氧化功能，原因可能是丁酸能诱导谷胱甘肽-S-转移酶体系，该体系可防御致癌物质和氧化物质[19-20]。有研究发现，短链脂肪酸酯能激活机体抗氧化防御系统[21-22]。
一氧化氮是一种多功能的生物活性分子，参与多种生理、病理过程。适量一氧化氮是维持和调节胃肠生理功能的重要物质，而过少或过量的一氧化氮则会导致某些胃肠道疾病的发生，即一氧化氮对胃肠道具有保护和损伤的双重作用[23-24]。本研究中，与对照相比，添加不同水平三丁酸甘油酯均能不同程度减少建鲤肠道一氧化氮含量，其机理可能为丁酸抑制了炎症细胞因子的产生和释放，促进肠黏膜的修复及其功能恢复[13]，一氧化氮产生的刺激源减少，从而导致一氧化氮含量降低。
一氧化氮合酶是一氧化氮合成过程中的关键酶，对一氧化氮的调节具有重要作用。一氧化氮合酶分为结构型和诱导型，结构型一氧化氮合酶为细胞内钙离子依赖型，在正常生理状态下即可表达，临时性地产生少量一氧化氮；诱导型一氧化氮合酶为钙非依赖型，只有细胞在受到内毒素、巨噬细胞等刺激时才能启动表达，持续产生大量一氧化氮[25]。黄俊等在研究丁酸钠对溃疡性结肠炎治疗作用时发现，丁酸钠能够通过抑制诱导型一氧化氮合酶的活性来发挥其肠道抗炎作用[26]。本研究中，与对照相比，添加不同水平的三丁酸甘油酯使建鲤肠道一氧化氮合酶活性均得到不同程度提高，这与前面提到的一氧化氮含量减少的结果不一致，其原因尚不明确，有待进一步探讨。
35结论
在建鲤饲料中添加三丁酸甘油酯对建鲤的生长性能、抗氧化和免疫功能有一定改善效果，但对建鲤的形体和体组成无影响，其中添加1 g/kg三丁酸甘油酯处理的效果最佳。
[HS2][HT85H]參考文献：[HT8SS]
[1][（#]唐明红 丁酸钠在畜牧生产中的应用研究[J] 饲料广角，2008（19：22-24
[2]刘统，黄兴国，朱广宁 丁酸甘油酯对断奶仔猪生长性能影响的研究[J] 饲料工业，2011，32（22：39-41
[3]杨玲 三丁酸甘油酯对断奶仔猪生长性能、肠道结构和血液生化指标的影响[J] 饲料工业，2012（增刊：46-49
[4]刘小萍，刘昌林，毛子平，等 丁酸甘油酯在仔猪生产应用中的初步研究[J] 江西畜牧兽医杂志，2012（2：15-16
[5]Antongiovanni M，Buccioni A，Petacchi F A，et al Butyric acid glycerides in the diet of broiler chickens：effects on gut histology and carcass composition[J] Italian Journal of Animal Science，2007，6（1：19-25
[6]Chapman M A，Grahn M F，Hutton M，et al Butyrate metabolism in the terminal ileal mucosa of patients with ulcerative colitis[J] British Journal of Surgery，1995，82（1：36-38
[7]Castillo M，Martin-Orue S M，Roca M，et al The response of gastrointestinal microbiota to avilamycin，butyrate，and plant extracts in early-weaned pigs[J] Journal of Animal Science，2006，84（10：2725-2734
nlc202309041119
[8]郑瑞耕 丁酸钠对淡水鱼类生长性能及肠粘膜结构的影响[D] 福州：福建农林大学，2008：21
[9]孙浪，刘臻，郝光，等 丁酸钠对鲫鱼生长和肠细胞增殖的影响[J] 中国水产科学，2013，20（4：893-901
[10][（#]余荣，徐小芳，王雯熙 丁酸对动物肠道影响的研究进展[J] 中国畜牧杂志，2012，48（16：64-68
[11]Roediger W W Famine，fiber，fatty acids，and failed colonic absorption：does fiber fermentation ameliorate diarrhea？[J] Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，1994，18（1：4-8
[12]Jenkins D J，Wolever T M，Jenkins A，et al Specific types of colonic fermentation may raise low-density-lipoprotein-cholesterol concentrations[J] The American Journal of Clinical Nutrition，1991，54（1：141-147
[13]蒋小丰，方热军 丁酸在动物体内的作用[J] 饲料工业，2008，29（20：51-54
[14]Lacorn M，Goerke M，Claus R Inulin-coated butyrate increases ileal MCT1 expression and affects mucosal morphology in the porcine ileum by reduced apoptosis[J] Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，2010，94（5：670-676
[15]Chatzifotis S，Panagiotidou M，Papaioannou N A，et al Effect of dietary lipid levels on growth，feed utilization，body composition and serum metabolites of meagre （Argyrosomus regius juveniles[J] Aquaculture，2010，307（1/2：65-70
[16]向梟，周兴华，陈建，等 饲料脂肪水平对白甲鱼幼鱼生长性能、体组成和血清生化指标的影响[J] 动物营养学报，2013，25（8：1805-1816
[17]郑珂珂，朱晓鸣，韩冬，等 饲料脂肪水平对瓦氏黄颡鱼生长及脂蛋白脂酶基因表达的影响[J] 水生生物学报，2010，34（4：815-821
[18]张淞琳，常建波，叶继丹，等 丁酸钠对美洲鳗鲡摄食、生长性能和抗氧化能力的影响[J] 福建农业学报，2011，26（4：549-551
[19]Habig W H，Pabst M J，Jakoby W B Glutathione S-transferases The first enzymatic step in mercapturic acid formation[J] The Journal of Biological Chemistry，1974，249（22：7130-7139
[20]Prochaska H J，Fernandes C L Elevation of serum phaseⅡ enzymes by anticarcinogenic enzyme inducers：markers for a chemoprotected state？[J] Carcinogenesis，1993，14（12：2441-2445
[21]Abrahamse S L，Pool-obel B L，Rechkemmer G Potential of short chain fatty acids to modulate the induction of DNA damage and changes in the intracellular calcium concentration by oxidative stress in isolated rat distal colon cells[J] Carcinogenesis，1999，20（4：629-634
[22]Redegeld F M，Moison R W，oster A S，et al Alterations in energy status by menadione metabolism in hepatocytes isolated from fasted and fed rats[J] Archives of Biochemistry and Biophysics，1989，273（1：215-222
[23]Nathan C，Xie Q W Nitric oxide synthases：roles，tolls，and controls[J] Cell，1994，78（6：915-918
[24]Hayashi T，Yano ，Matsui-Hirai H，et al Nitric oxide and endothelial cellular senescence[J] Pharmacology & Therapeutics，2008，120（3：333-339
[25]王广军，谢骏，余德光，等 一氧化氮及一氧化氮合酶在水生动物免疫系统中的研究进展[J] 水产科技，2009（3：1-6，13
[26]黄俊，罗和生，杨健新 溃疡性结肠炎一氧化氮异常及丁酸钠的治疗作用[J] 世界华人消化杂志，2001，9（8：967-969[HJ][FL]
肠道益生菌与肠粘膜免疫 第3篇
1 肠道粘膜免疫
1.1 肠道粘膜免疫的重要性
肠道不仅是消化吸收的重要场所, 同时也是“应激反应的中心器官”和“多脏器功能衰竭的始动器官”, 又是机体内最大的细菌和内毒素库。肠道粘膜免疫系统包括肠道相关淋巴组织和有关细胞、分子成分。肠道相关淋巴组织由肠上皮淋巴细胞、固有层淋巴细胞、微皱褶细胞等肠相关淋巴组织构成。它可抵御细菌、病毒和毒素从消化道入侵, 肠粘膜抗体形成细胞占体内抗体细胞的70%~80%, 产生免疫球蛋白A (Ig A) 的量比体内其他Ig类型的总量还要多。肠道与单核-巨噬细胞系统、肝、脾等免疫功能器官相比, 是最大的免疫器官。
1.2 肠道粘膜免疫的机制
粘膜免疫与系统免疫有所不同, 粘膜免疫主要是发挥免疫抑制作用, 而系统免疫主要起免疫增强作用, 这与两个系统的不同作用方式有关。对抗病原微生物的肠粘膜免疫可分为先天性免疫和后天获得性免疫, 其先天性免疫是构成肠粘膜屏障的基础。发生在肠道中的粘膜免疫反应是由肠粘膜表面附着的抗原引发的, 肠道粘膜中的淋巴滤泡集结将抗原物质转移到淋巴滤泡集结中的巨噬细胞, 巨噬细胞对抗原进行加工, 并将抗原转移给辅助性T细胞, 辅助性T细胞激活B淋巴细胞, B淋巴细胞分化增强, 产生大量分泌型Ig A (SIg A) , SIg A是粘膜免疫的主要效应因子, 虽然SIg A难以通过激活补体等途径直接杀伤病毒, 但是可以通过大量非炎性反应途径清除病毒感染。SIg A发挥主要作用的部位是局部粘膜, 局部粘膜免疫的基本原理是由于局部抗原刺激比全身更能有效的刺激机体粘膜分泌大量SIg A, 可有效中和粘膜上皮内的病原体、细菌毒素和酶, 捕捉粘膜内层病原体, 削弱细菌表面疏水性, 阻止病毒附着、细菌粘附和抗原的粘附, 刺激肠道粘膜表面分泌粘蛋白降解病毒, 同时加速粘液在粘膜表面移动, 从而加速了细菌和内毒素等有毒物质的排出, 还可与细菌等形成免疫复合物并排除体外。
1.3 肠道免疫器官
肠道不仅是机体消化和吸收的场所, 而且时刻都要抵御经口进入的大量的细菌、病毒、食物及抗原的侵袭, 所以人体70%以上的免疫细胞位于肠粘膜内, 构成肠道相关淋巴样组织 (GALT) 。按其解剖位置、形态和功能可以分为粘膜淋巴小结、上皮间淋巴细胞、固有膜淋巴细胞和滤胞相关上层皮。
2 益生菌对肠道粘膜免疫的作用
人出生时肠道是无菌的, 肠道菌群定植于出生后。菌群的发展和肠粘膜屏障的建立是一个渐进而互动的过程。婴儿出生后2~3h, 肠道就开始出现肠球菌和大肠埃希菌, 随后出现酵母菌、葡萄球菌、乳杆菌等。7d后, 双歧杆菌明显增加, 这时肠道菌群在数量、种类和比例上基本保持不变, 维持一个动态平衡对宿主来讲, 微生物的定植是一种轻微的感染或者轻微刺激, 定植后若刺激太强烈, 会引起机体的免疫反应来对抗微生物定植。微生物必须有粘附的条件, 而宿主必须有接受微生物粘附的条件。定植在肠道的厌氧菌 (常居菌) 对具有潜在致病性的需氧菌和外来致病菌的抗病能力, 称为定植抗力, 简称“CR”, 这种作用可阻止外来致病菌的定植, 当机体中厌氧菌数量减少, CR水平下降, 就会引起菌群失调, 生态平衡被打破, 机体生病, 因此, 保持肠道菌群的CR水平, 对保持肠道微生态平衡, 防止机体生病具有重要意义。
3 益生菌的免疫作用
3.1 抗炎、抗感染
细菌、病毒或寄生虫感染常常会诱发胃肠炎, 它的主要临床症状是急性腹泻。婴幼儿的胃肠炎多数是由于轮状病毒感染引起的。Guandalinc等人最近报道, 采用双盲法对101名1~36个月轮状病毒感染阳性的幼儿, 用常规疗法辅以乳杆菌或安慰剂良种治疗方案进行疗效观察。辅以乳杆菌治疗的幼儿, 腹泻症状持续时间为 (56±17) h, 常规疗法为 (77±42) h, 两者相比差异有显著性。辅以乳杆菌治疗的幼儿, 住院治疗时间和体重恢复时间也明显缩短。也有报道称, 益生菌对预防儿童的轮状病毒感染, 治疗成人胃肠炎也具有显著的疗效。
3.2 对自身免疫的影响
机体在某种内因和外因的诱导下, 发生异常的免疫应答, 导致组织损伤或功能障碍, 会造成自身免疫病的发生。具体的发病机制, 至今尚未明确。Matsuzaki等人报道, 用四氧嘧啶按70 mg/kg的剂量注入静脉后, 于当日给予乳酸杆菌属shirota菌株口服15d后, 40%患有糖尿病小鼠血糖的平均值为 (366±84) mg/m L, 而对照组小鼠的患病率为100%, 血糖的平均值为 (532±81) mg/m L, 说明益生菌具有预防糖尿病发生的作用。
3.3 抗肿瘤
益生菌可以增强机体的免疫功能, 对肿瘤也具有一定的拮抗作用。双歧杆菌在动物体内可以抑制多种肿瘤的生长, 如杆菌、结肠癌、乳腺癌、MthA纤维肉瘤等等, 乳杆菌可以明显降低MCA诱导的小鼠肉瘤的发病率。
4 益生菌的作用机制
4.1 生物屏障和生物拮抗作用
双歧杆菌是定居在肠道中的有益菌, 通过代谢产生酸或抗菌物质, 抑制有害菌的生长繁殖双歧菌和其他厌氧菌可粘附于肠粘膜上皮细胞上, 通过自身及产生的代谢物和抑制物排斥致病菌, 在肠道微环境下保持菌种优势, 形成一个具有保护功能的生物屏障, 并与肠道中其他菌群相互作用, 调整菌群之间的关系, 以保证肠道菌群之间的最佳组合, 并维持肠道功能的平衡。
4.2 增强免疫和抗肿瘤作用
双歧杆菌等益生菌优化了肠道菌群的组合, 抑制了产生致癌因子的腐败菌的生长, 增强了免疫功能, 抑制了肿瘤细胞的增殖和致癌物质的产生。金世林指出, 双歧杆菌细胞壁肽聚糖在适当条件下呈现免疫原性, 增强了体液性免疫应答, 提高了机体的抗体水平, 激活了巨噬细胞活性, 从而可以抑制肿瘤细胞的增殖。一些动物实验表明双歧杆菌能激活机体的巨噬细胞的吞噬活性, 促进特异性和非特异性Ig A抗体的产生, 增强了免疫系统的功能, 进而提高机体的抗病能力。
4.3 营养作用
双歧杆菌代谢产生的有机酸可以促进维生素D、钙和铁离子的吸收。双歧杆菌可以合成多种维生素, 如硫胺素、核黄素、泛酸、叶酸和维生素B12等等。双歧杆菌还可以改善蛋白质代谢, 它产生的磷蛋白磷酸酶可以将乳中A-酪蛋白降解, 有益于乳蛋白的吸收。双歧杆菌在人体肠道内可产生β-半乳糖苷酶, 促进机体对乳糖的消化吸收。4.4抑制内毒素的产生双歧杆菌等肠道益生菌可抑制肠道中腐败细菌的繁殖, 从而减少肠道中内毒素和尿素酶的含量, 使血液中内毒素和氨含量下降。服用双歧杆菌活菌制剂后, 发现血氨、游离血清酚以及氨基氮明显减少。
4.5 改善肝功能
双歧杆菌能抑制腐败细菌生长, 纠正肠道菌群失调而促进营养吸收, 阻止细菌易位, 减少内毒素来源, 减轻肝脏损害, 改善肝功能。同时通过降低肠内pH, 致使氨变为难吸收状态, 从而减少对肝的危害。
4.6 降低血清胆固醇
双歧杆菌菌体成分或菌体代谢产物具有抗胆固醇物质, 能显著减少肠管对胆固醇的吸收, 同时促进胆固醇转变为胆酸盐, 从而加快其排出体外。
益生菌对肠道黏膜免疫的调节作用 第4篇
1肠道黏膜免疫
胃肠道的主要功能是对摄入的食物进行消化吸收, 它通过口与外界相连。每天胃肠道要面对大量的食物、微生物抗原, 这使得肠道免疫变得至关重要, 它既可以对致病菌免疫清除, 又要对肠腔内数量众多的正常微生物免疫耐受[1]。正常肠黏膜屏障由四个屏障共同构成:机械屏障、化学屏障、生物屏障与免疫屏障。它们能够防止病原体的入侵, 维持肠道正常的微生态平衡。当其中任何一道屏障出现异常, 肠道潜在的病原体就会定植和入侵, 导致肠道免疫功能的异常。
肠道免疫系统在抗原物质通过黏膜的机械屏障、生物屏障、化学屏障进入淋巴组织后发挥作用。机械屏障的构成是由黏膜上皮细胞、细胞间的紧密连接组成。胃肠道上皮的通透性主要决于紧密连接。紧密连接包括存在于细胞膜上的细胞膜蛋白和位于细胞质内的细胞质蛋白。当胃肠黏膜屏障稳态受到破坏时, 肠上皮通透性增加, 具有潜在抗原性的大分子物质就会透过肠黏膜屏障进入血液, 进而产生免疫反应。化学屏障是由肠黏膜上皮分泌的黏液、消化液及肠腔内正常寄生菌产生的抑菌物质构成, 能有效阻止细菌及内毒素等有害物质透过肠黏膜进入血液。生物屏障是肠道常驻菌群在肠腔内形成的微生态环境。即对外来菌株有定植抵抗作用的肠内正常寄生菌群。肠道常驻菌群形成的一个微生态系统构成对抗病原体的重要保护屏障[1]。免疫屏障是由肠黏膜淋巴样组织和肠道内浆细胞分泌型免疫球蛋白A (SIg A) 构成。SIg A是机体内分泌量最多的免疫球蛋白, SIg A能阻碍病原微生物及毒素分子黏附在肠上皮表面, 发挥免疫作用, 抵抗病原微生物对机体的侵袭。
肠黏膜免疫主要诱导部位是派尔集合淋巴结 (简称PP结) , PP结含有大量的免疫细胞, 位于肠系膜缘对侧肠壁黏膜或者黏膜下, 是肠黏膜内的一组淋巴滤泡, 淋巴滤泡由B细胞和T细胞组成, 其中B细胞主要在淋巴滤泡中分布, T细胞主要位于滤泡间区。肠黏膜上皮和固有层是主要效应部位。具有很强细胞毒作用的上皮内淋巴细胞 (IEL) 能够识别上皮细胞是否受细菌、病毒的感染, 产生溶细胞活性, 可以杀死和清除病毒感染或损伤的上皮细胞, 发挥抗细菌、抗病毒、抗感染的作用。固有层淋巴细胞 (LPL) 主要由B淋巴细胞和T淋巴细胞 (以CD4+为主) 组成[2]。
派尔集合淋巴结中专职的抗原提呈细胞是树突状细胞 (DC) 、巨噬细胞。树突状细胞是主要的抗原提呈细胞, 它可以将活的共生菌通过小肠黏膜固有层的DC跨上皮细胞的树突被摄取[2], 活化局部幼稚的淋巴组织, 生成各种效应淋巴细胞, 清除局部的感染病灶。然而并不是所有DC都可诱导产生免疫应答。一般认为, 不成熟DC (i DC) 可诱导T细胞产生免疫耐受, 使免疫系统与食物抗原及共生菌抗原共存;成熟DC (m DC) 则诱导T细胞活化, 发生免疫应答反应。肠道DC携带正常菌群诱导产生大量保护性Ig A, 避免正常菌群进入宿主组织造成损伤。陈永熙等[3]指出DC病原体模式识别和黏附受体是处于DC表面的C型凝集素受体超家族成员DC-SIGN, 它同时还是DC特征性多功能免疫分子。
PP结表面附有一层特殊的微皱褶细胞 (简称M细胞) , M细胞不能递呈抗原, 而是非特异性的以受体介导胞吞的方式摄取和转运抗原, 在诱导黏膜和系统免疫反应中起重要作用。M细胞凹腔面覆有糖蛋白, 其糖基排列可能与周围肠上皮细胞的不同, 进而更容易摄取细菌与病毒。病原体的黏附会激活M细胞内的信号传导途径, 升高局部钙浓度, 使细胞表面发生变化, 通过液相胞吞、受体介导的胞吞和吞噬作用摄入病原体。
肠黏膜免疫反应是从肠黏膜固有层对SIg A的分泌正式开始的。当Ig M+B细胞遭遇抗原刺激, 细胞分化为Ig A+B细胞, Ig A+B细胞在T辅助细胞 (Th细胞) 调控下使其成熟、分化为Ig A+浆细胞, Ig A+浆细胞再进一步分化为分泌型免疫球蛋白SIg A。辅助性T细胞 (Th细胞) 分为Th1和Th2 2种, 在黏膜部位的免疫应答以Th2型为主, 定居在固有层的Th2细胞可分泌TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等细胞因子, 它们在促进SIg A分泌方面起着非常重要的作用。IL-4和TGF-β可以刺激活化B细胞分化为Ig A, IFN-γ可以抑制Ig A抗体分泌是通过拮抗IL-4来完成的。由Th2细胞分泌的IL-5、IL-6和IL-10细胞因子可以使SIg A分泌提高, 并促进表面SIg A+B细胞分化成为SIg A[4]。SIg A包被细菌, 与其表面的特异性结合位点结合后, 刺激肠道黏液分泌, 加速流动, 阻止病原微生物及其毒素分子黏附在肠黏膜表面, 从而有效的抵御抗原入侵。
2益生菌的调节作用
俄国科学家Restalenert等[5]在实验研究中最早提出了益生菌对人体肠道是有益的, 他认为通过防止甚至腐败菌的生长肠道乳酸菌可以起到延长寿命的作用。现在越来越多的学者关注到益生菌对肠道免疫的重要性。人体肠道内栖息着无数的微生物, 种类纷繁。其组成绝大部分为厌氧菌, 以及极少数的需氧菌和兼性厌氧菌。根据对人体的危害情况, 可分为有害菌、益生菌和机会致病菌。其中一部分长期寄居的微生物, 它可以刺激宿主的免疫清除功能, 保持宿主肠道免疫活性, 其与宿主之间处于相互依存、相互制约的动态平衡。一些学者在动物实验中[6]证明益生菌对肠道系统的免疫作用可以提高生存率。
益生菌天然地存在于自然界、动物和人体之中, 对宿主可产生一种或多种有益作用。益生菌 (Probiotics) 的概念于1998年由WHO联合专家组统一定义为“被人体摄入后能产生除细菌本身具有的营养以外的益生作用的一种活菌”[7]。换言之, 益生菌是指给予一定数量的, 有益于其宿主健康的活菌。普遍认为, 出生之初肠道内是无菌的, 与外界的接触增多, 哺乳、拥抱、亲吻等, 细菌开始定植。人体肠道内常见的益生菌主要是各种双歧杆菌、乳酸杆菌, 具有双重作用的大肠杆菌、场球菌。其中双歧杆菌和乳酸杆菌是人体内的固有菌, 也是在人体中占益生菌绝大多数的菌种。
研究表明[8], 益生菌进入肠道可以促进肠内细菌群的正常化, 抑制肠内腐败物质产生, 使肠道菌群的失调恢复正常, 增强肠道黏膜对外界的抵抗力, 降低促炎细胞因子产生引起的局部和全身过敏炎性反应, 降低肠道炎性反应。更多的研究表明, 益生菌免疫活性不仅局限于增强黏膜免疫功能, 在细胞免疫和体液免疫中都起到了很大的作用
2.1增强肠道黏膜机械屏障机械屏障构成是由黏膜上皮细胞、细胞间的紧密连接组成。肠道益生菌是通过抑制肠上皮细胞的凋亡来增强肠道的屏障功能。如果胃肠道黏膜上皮细胞的完整性被破坏, 其通透性会增加, 细菌及毒素等大分子通过胃肠道黏膜屏障进入人体产生异常免疫反应。据报道[9], 益生菌在激活抗凋亡的Akt/PKB的同时, 还能够抑制TNF、IL-1和IFN对促凋亡的p38/MAPK的活化, 继而改善肠黏膜细胞紧密连接, 增强肠机械屏障, 减少细菌移位, 维持细胞的稳态。Resta-Lenert等[10]研究表明, 嗜热乳酸链球菌 (ST) 和嗜酸乳杆菌 (LA) 不仅能维持还可以增强紧密连接蛋白、细胞骨架蛋白的磷酸化表达量, 从而增强了肠上皮细胞的屏障功能。
2.2增强肠道黏膜生物屏障补充益生菌在促进肠道共生菌群的生长的同时, 还可以抑制生长、黏附和侵袭的条件致病菌, 从而可以调节肠道菌群, 维持肠道微生物生态系统, 提高肠道的生物屏障功能。同时, 益生菌能竞争性抑制病原细菌在黏膜的生长[11]。
2.3增强肠道黏膜化学屏障益生菌能够通过提高肠道上皮细胞直接分泌细菌素 (bacteriocin) 和防御素 (defensins) 来阻止病原微生物和病毒入侵上皮细胞, 抑制致病菌的生长, 进而增强肠道的防御能力。此外, 益生菌可以与致病菌竞争性, 通过黏附于上皮细胞刺激其分泌黏蛋白 (MUC) , 使其在肠道黏膜和病原微生物之间形成保护层, 从而来增加肠道屏蔽功能, 阻止病原微生物的侵袭。乳酸杆菌和其他益生菌的区别在于它可在肠道中通过分泌乙酸和乳酸降低p H, 从而抑制有害细菌的生长繁殖。
2.4增强抗原提呈细胞的活性
2.4.1吞噬细胞:吞噬细胞包括巨噬细胞、单核细胞等。有学者通过与较健康成人组作对比, 发现每天少量益生菌的摄入, 能够增强巨噬细胞的吞噬活性, 从而增强机体的免疫功能[12]。
2.4.2树突状细胞 (DCs) :树突状细胞DCs是专职的抗原递呈细胞, 当肠道感染时, 它能够在免疫调节中发挥至关重要的作用。当肠道感染致病菌, 大量DCs被诱导从黏膜移迁至肠相关淋巴结, DC摄取抗原物质后, 在一系列信号分子作用下, DCs发育成熟, 并刺激T、B淋巴细胞产生免疫反应。DCs此时失去吞噬能力, 激活黏膜炎性免疫反应扩大[13]。经益生菌治疗后, 分化的m DC数量减少, 能够减少刺激T细胞增殖, 减少抗原递呈和活化的T细胞数量, 减少异常的免疫反应, 进而肠道炎性反应得到好转[14], 从而起到肠道黏膜免疫的作用。
2.5产生各种细胞因子控制炎性反应益生菌与肠黏膜免疫系统反应, 可以促进免疫调节性细胞因子的生成, 也可以降低局部和全身过敏炎性反应特征性的促炎细胞因子的产生, 调节机体的免疫反应, 减少炎性反应。进入肠道后, 益生菌可以诱导T细胞转化分泌多种细胞因子, 生成TGF-β、IL-4、IL-10, 作用于T辅助细胞, 诱导Th2应答, 刺激B细胞分泌Ig类型转化为Ig E。益生菌可以诱导生成IL-2、IL-12、IFN-γ等细胞因子, 促进T辅助细胞产生Th1应答, 激活B细胞促进SI-g A的产生, 在机体抗胞内病原体感染中发挥重要作用。
有报道指出, 不同种益生菌其特性不同, 对人体的作用亦不同, 甚至是那些均能增强免疫功能的同种类的不同菌株, 它们所发挥的增强免疫功能的水平也可能有显著不同。这些不同的影响 (包括改善的免疫力功能等) 都高度依赖于“菌株的特定性 (strain-specific) ”[9]。这种特异性可能会有所不同, 取决于益生菌细胞壁组成。
尽管益生菌对调节免疫方面有着极为积极的作用, 然而, Baken等[15]应用养乐多代田菌 (LcR) 喂养不同种鼠类, TH1介导的免疫反应效果不尽相同。应用局部淋巴结法发现LcR可抑制BALB/c小鼠中TH1介导的免疫反应, 但是在Lewis大鼠中却会加重实验性自身免疫性脑脊髓膜炎 (EAE) 。但其在人体的相关作用还需要进一步深入研究。
随着人们对肠道内微生物菌落与人类健康的不断深入研究, 益生菌对于肠道健康的重要性逐渐被人们得到认可。其中研究最多的是抗过敏和抗肿瘤作用。在这项研究中, 认为生命早期缺乏正常菌群的刺激, 使得免疫系统的成熟受阻, 使TH的分化向Th2偏移, IL-4、IL-5的生成增多。IL-4、IL-5与变态反应有关, 可促进Ig E的产生, 从而引起过敏反应。有人建议, 治疗过敏性疾病使用益生菌, 并在动物模型中证实了效果。同时有多项研究发现早期应用益生菌能明显抑制小鼠肿瘤的生长。
目前, 对益生菌的免疫调节机制尚不能完全研究透彻。虽然其具有显而易见的优越性, 但是不同菌株之间, 不同剂量之间, 免疫调节效应仍存在不少差异, 而宿主也随着品种、外形的差异, 可出现截然相反的结果。我们仍需要进一步了解益生菌在定植、识别、抗原提呈、免疫诱导等方面的机制, 指导临床应用。
肠道免疫细胞 第5篇
青霉素的发现使人们对病原微生物感染而引起的各类疾病不再束手无策, 并由此开发研制了大量的抗生素, 对人类健康和畜牧业发展作出了巨大贡献。但是随着青霉素等“传统抗生素”的广泛应用, 不断产生出诸多新问题, 如耐药菌株不断增多, 且耐药性不断加强, 特别是多重耐药株的出现, 然而要开发出一种新药并非易事, 寻找天然抗菌药物, 比如抗菌肽 (Antimicrobialpeptides, AMPs) , 为解决耐药细菌的威胁这一棘手世界难题提供了新途径。抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类小分子多肽, 具有分子量小、水溶性好、耐热、无免疫原性等特点, 极有可能成为一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒和抗癌新药[1,2,3,4,5]。近年来, 国内外关于抗菌肽的研究越来越多, 已经成为研究的热点。人们期望通过研究, 一方面在分子水平上弄清抗菌肽精细的合成过程及调控机制;另一方面是探讨抗菌肽的药用开发价值, 努力使之成为继青霉素等传统抗生素之后又一类重要的新型抗菌药物。
小肠既能消化吸收营养, 也是重要的免疫器官, 但关于肠道黏膜免疫的很多机制尚不完全清楚[6,7,8,9,10]。研究外源抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响, 能为进一步探讨肠道黏膜的抗菌机制和开发研制新的抗生素替代品提供一些有益的思路和借鉴。
1材料与方法
1.1主要材料
猪肠道抗菌肽冻干粉为本课题组制备保存。实验动物为1日龄SPF鸡购于北京梅里亚公司, 鼠抗鸡IgA单克隆抗体为SouthernBiotechnology, Inc.产品。
1.2实验方法
1.2.1动物实验及采样
60只1日龄SPF鸡随机分成两组:每组30只, 其中抗菌肽处理组于7、14、21、28、35和42日龄分别通过腿部肌肉注射0.1 mL鸡肠道抗菌肽 (100ug/mL) 。对照组鸡于相同日龄分别注射等体积的无菌生理盐水, 两组鸡隔离饲养。分别于7, 21, 35, 49日龄剖杀实验组和对照组鸡各5只, 分别剪取约2cm长的十二指肠、空肠和回肠, 生理盐水冲洗干净后, 用2.5%的多聚甲醛-戊二醛固定液充分固定以备用。
1.2.2石蜡切片的制作
所有组织经按常规石蜡切片技术脱水、包埋后, 每个组织做5张连续切片 (5μm) , 分别进行H.E染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色和免疫组化染色。
1.2.3 H.E染色法-显示肠黏膜上皮内淋巴细胞
常规H.E染色显示肠黏膜上皮细胞内淋巴细胞, 40倍下取每根肠管横断面, 选5根最长且排列整齐的绒毛计数每100个黏膜上皮细胞间IEL数量。
1.2.4甲苯胺蓝染色法-显示肥大细胞
采用改良甲苯胺蓝染色法 (MTB) [11]:石蜡切片常规脱蜡至水, 0.8%甲苯胺蓝染色10s, 蒸馏水快速洗2次后, 95%酒精分色, 100%酒精脱水, 二甲苯透明封片。Olympus显微镜下观察。镜下MC胞浆呈紫红色或颗粒状红色团块状, 胞核呈浅蓝色。计数每根肠管横断面的肠壁全层 (包括黏膜及黏膜下层、肌层及浆膜层) 的肥大细胞数量, 并观察其分布;
1.2.5 PAS染色法-显示杯状细胞
采用PAS染色显示杯状细胞:石蜡切片脱蜡下行入蒸馏水, 入0.5%～1.0%高碘酸溶液氧化5min, 蒸馏水速洗一次后入Schiff氏溶液, 37℃中反应 (30～60) min后, 以亚硫酸溶液洗2～3次, 再用蒸馏水速洗二次, 苏木素复染, 然后0.5%盐酸酒精溶液分色 (5～10) s, 以镜检为准, 用自来水软化后, 常规脱水、透明、封片。同时设置对照组, (1) 切片出蒸馏水后入醋酸酐与吡啶混合液, 处理 (3～5) min后水洗 (2～3) 次, 再进行PAS染色。染色结果:PAS阳性的杯状细胞有紫红色颗粒。PAS阴性的切片不着色。取每根肠管横切面, 统计观察5根最长且排列整齐的绒毛每100个肠黏膜上皮细胞间杯状细胞数量和分布。
1.2.6肠道分泌型IgA (SecretoryIgA, sIgA) 的免疫组化染色
(1) 石蜡切片脱蜡下行入蒸馏水; (2) 3%H2O2孵育30min, PBS冲洗3次, 每次5min; (3) 山羊血清封闭25min; (4) 滴加小鼠抗鸡sIgA单抗血清 (1∶100倍稀释, 用0.0 1mol/L PBS配制) 溶液, 37℃孵育2h, PBS漂洗3次, 每次5min; (5) 滴加生物素标记的二抗工作液, 37℃孵育30min;PBS漂洗3次, 每次5min; (6) 滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液, 37℃孵育30min, PBS漂洗3次, 每次5min; (7) DAB显色液显色; (8) 用苏木素衬染, 常规方法脱水、透明、封片; (9) 常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗进行孵育做阴性染色对照。
1.2.7数据处理及分析
实验结果用均数±标准差 (X±S) 表示, 应用SPSS11.0统计软件对测定数据进行组间差异性比较。
2结果
2.1猪小肠抗菌肽的活性鉴定
比较了不同温度和pH值处理后对抗菌肽活性的影响, 结果表明该抗菌肽在40℃～80℃处理30min对其抗菌活性基本没有变化, 90℃处理30min抗菌活性略有下降, 100℃处理30min抗菌活性损失约30%左右 (图1 (a) ) 。这说明猪小肠抗菌肽具有良好的热稳定性。在pH (6.5～7.5) 的近中性环境中, 猪小肠抗菌肽的抗菌活性最强, 偏酸性 (pH<6.0) 或偏碱性 (pH>8.0) 的溶剂环境均可导致猪小肠抗菌肽的抗菌活性降低 (图1 (b) ) 。
2.2抗菌肽对鸡生长性能的影响
从7日龄开始, 给鸡肌肉注射猪小肠抗菌肽, 每7d一次。从表1可以看出, 在整个试验周期中, 实验组鸡平均周增重明显高于对照组, 差异显著或极显著 (p<0.05或p<0.01) ;实验组平均每只鸡日增重为13.54±0.20g, 对照组平均每只鸡日增重为11.10±0.19g, 二者差异显著 (p<0.05) 。试验组和对照组全期平均日耗料量基本相同, 没有显著性差异 (P>0.05) ;试验组的料重比 (2.27±0.04) 显著低于对照组 (2.60±0.05) (p<0.05) 。
注:“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) , 下同。
2.3猪小肠抗菌肽对肠道免疫活性细胞的影响
改进的甲苯胺蓝染色结果表明:肥大细胞一般为圆形或梭形, 有紫红色颗粒 (图2A) 。在各段肠管均有分布, 但从计数结果来看, 其数量从前向后逐步减少 (表2) 。检验结果表明, 在应用猪小肠抗菌肽处理之后, 在21日龄时, 从十二指肠开始, 抗菌肽处理组的各段肠道内肥大细胞数量高于对照组, 差异明显 (p<0.05或p<0.01) 。H.E染色结果表明:上皮内淋巴细胞为散在分布于肠绒毛上皮细胞之间的一群特殊淋巴细胞 (图2B) 。不同的肠段, 上皮内淋巴细胞的数量也有所不同。从计数结果来看, 在应用猪小肠抗菌肽处理之后, 其变化趋势与肥大细胞在各段肠道的变化相似 (表2) 。PAS染色结果表明:杯状细胞散在分布于柱状细胞之间, 呈高脚杯状, PAS染色呈红色阳性反应 (图2C) 。从计数结果来看, 杯状细胞的数量从十二指肠到回肠, 呈从前向后逐渐增多趋势 (表2) 。检验结果表明, 在应用猪小肠抗菌肽后, 在21日龄时, 实验组鸡回肠内杯状细胞数量与对照组相比差异显著 (p<0.05) , 在35日龄和49日龄时差异极显著 (p<0.01) , 而在十二指肠和空肠内实验组与对照组相比则是差异显著 (p<0.05) 。
注:肥大细胞、IEL和杯状细胞分别在对照组 (AC) 和抗菌肽处理组 (DF) 的分布图。A:少量的肥大细胞呈紫红色形态, 分布在肠绒毛固有层 (toluidinebluestaining, 20) ;B:IEL主要分布在上皮细胞之间 (H.Estaining, 40) ;C:杯状细胞呈现典型的“高脚杯状”形态 (PAS staining, 20) ;D:大量的肥大细胞分布在绒毛固有层 (toluidineblue staining, 20) ;E:抗菌肽处理组的IEL形态及分布 (H.E staining, 40) ;F:杯状细胞数量明显增多 (PASstaining, 20) 。
2.4猪小肠抗菌肽对肠道中sIgA表达的影响
免疫组化染色观察表明sIgA阳性细胞主要分布于肠道的固有层 (图3) 。不同时期实验组和对照组鸡各段肠道的sIgA阳性物统计结果表明, 从21日龄起, 各段肠道的sIgA阳性物水平是逐渐升高的, 并且差异显著或极显著 (p<0.05或p<0.01) (见图4) 。
注:不同日龄各段肠道内IEL、肥大细胞和杯状细胞的数量。“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) 。
注:A:对照组十二指肠内的sIgA阳性信号 (IHCstaining, 40) ;B:抗菌肽处理组鸡的对照组十二指肠内的sIgA阳性信号 (IHCstaining, 40)
3讨论
生物有机体进化出很多防御机制对抗病原微生物的感染, 其中最原始的一个机制就是分泌抗菌肽[12,13]。大量的证据提示这些小肽分子在保护机体抵御病原体感染过程中发挥重要作用[1,3]。肠道在营养吸收与宿主防御方面扮演双重角色[3], 但关于外源性抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响方面的研究并不多见。
研究发现肠道在维持机体的衡态方面发挥至关重要的作用[3,14]。通常情况下, 肠道发挥功能是通过其免疫活性细胞的活动来完成, 这些免疫活性细胞主要是指定居在肠道内的上皮内淋巴细胞 (IEL) 、肥大细胞 (MC) 和杯状细胞 (GC) [3,14,15]。
注:“*”和“**”, 分别表示抗菌肽处理组和对照组之间比较差异显著 (p<0.05) 或 (p<0.01) 。C:对照组;T:抗菌肽处理组
研究的结果表明, 添加的外源抗菌肽对SPF鸡没有毒性, 并能在一定程度上促进饲料的利用率 (见表1) 。进一步的H.E染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色和免疫组化染色结果的数据分析表明, 抗菌肽能显著提高肠道内IEL、MC、GC及sIgA的含量。已有的研究表明, 作为肠道主要的免疫活性细胞, IEL、MC、GC和sIgA处在肠道与外界病原体斗争的第一线, 这些免疫活性细胞能通过各自独特的分泌方式释放多种细胞因子发挥对病原体的作用[16,21], 如IEL能分泌细胞因子发挥调节效应[16], MC能释放组胺、5-HT和类胰蛋白酶等发挥对肠道的保护作用[18], GC能合成和释放黏液素, 这些黏液素能作为一个动态的防御所来抵抗入侵的病原体[22], sIgA能直接中和毒素或间接阻止外来的有毒物质在肠道的黏附发挥其保护作用[20]。研究表明, 抗菌肽处理后能提高小肠各段的免疫活性细胞的数量, 可以增强肠道的屏障功能, 提高动物的肠道黏膜免疫能力, 对于研究肠黏膜的防御机制提供了新的思路。
当然, 研究只是初步揭示了猪小肠抗菌肽对肠道黏膜免疫功能的影响。至于IEL等免疫活性细胞的增多意味着什么尚不能完全定论。一方面可以认为在一定范围内IEL、肥大细胞和杯状细胞的增多可以增强肠道的免疫学屏障和机械屏障功能, 从而增强了肠道的免疫功能, 对肠道黏膜的防御机制起着积极作用。而另一方面, IEL和肥大细胞的增多会不会意味着免疫增强?其中的详细机制还需要进一步的探讨。
肠道免疫细胞 第6篇
禽类的视觉光谱范围比人类广, 也能够区分不同的颜色, 禽类视网膜分为节细胞层 (GCL) 、内网状层 (IPL) 、内颗粒层 (INL) 、外网状层 (OPL) 、外颗粒层 (ONL) 、视锥视杆层六层, 节细胞 (RGCs) 是视网膜内唯一产生动作电位的细胞, 节细胞最后汇聚成视神经穿出眼球;视杆细胞感受暗视野, 视锥细胞感受亮视野, 视锥细胞分为红锥、绿锥、蓝锥共同产生色觉。光信息首先刺激视锥视杆细胞, 产生的视觉信号传递给视网膜节细胞, 节细胞产生动作电位, 经视神经传出, 几乎集中到视顶盖, 这种光受体对不同波长的光刺激反应存在差异, 产生的神经冲动最后传到视皮质, 视皮质参与大脑各类中枢的调节, 进而影响到机体的各种机能。所以, 光信息尤其是光色信息是影响鸡生产性能和免疫功能的主要因素之一。其中具体的作用机制有待进一步研究, 下面就可能的机制做一个概述。
2 肠神经系统
肠神经系统 (ENS) 是胃肠壁内的自主神经系统, 包含胃肠道的黏膜下神经丛和肠肌神经丛, 它在结构和功能上不同于交感和副交感神经系统, 而与中枢神经系统相类似, 但仍属于自主神经系统的一个组成部分。具有独立于大脑而行使其功能的完整结构, 这种独立于大脑之外的肠神经系统有一个完整的反射装置, 包括感觉神经元、中间神经元和支配胃肠效应器的运动神经元, 称之为肠脑。ENS包括 (1) 5-羟色胺能神经, 这类神经所释放的递质5-羟色胺主要作用于肠壁内其他神经元, 既能兴奋胆碱能神经, 促进乙酰胆碱释放, 导致胃肠平滑肌收缩;又能兴奋非肾上腺素能抑制神经, 当兴奋性神经肌肉传递被阻断后, 可引起肠肌松弛。 (2) 肽能神经, 免疫细胞化学方法显示肠神经系统中存在多种肽能神经。大部分粘膜下神经丛的神经元以及一半以上肌间神经丛的神经元均含有神经肽。从数量来说、肽能神经主要集中在肌间神经丛, 但含有某些神经肽 (例如SOM和VIP) 的神经元则可在粘膜下神经丛占优势。肠神经系统中的肽能神经纤维与胃肠道免疫细胞紧密联系。神经肽是肽能神经元产生的神经递质, 胃肠道免疫细胞存在神经肽受体, 神经肽影响其增生、分化和功能。胃肠道免疫细胞接受肽能神经的直接支配, 其自身也可以合成并释放神经肽。在周围神经末梢出现神经肽受体表示肠神经系统和免疫细胞的相互作用是双向的。
有研究显示许多肥大细胞与神经纤维紧邻, 肥大细胞在这两个系统中起信息传递作用。先是肠道免疫系统的肥大细胞等对抗原进行免疫识别, 然后传到ENS进行神经识别, 后由ENS对肥大细胞进行调节。ENS也接受大脑高级中枢的调控, 光色信息就可以通过大脑中枢对ENS的免疫功能进行调节。目前已知肽能神经末梢有大量形似念珠状的膨体, 在一定条件下, 贮存于膨体内的神经肽 (如P物质 (SP) 和神经肽Y (NPY) ) 可被释放, 并通过受体非依赖机制实现促进肥大细胞的脱颗粒, 进而诱导肥大细胞释放生物活性物质, 促进超敏反应的进行, 以调节周围靶细胞或靶组织产生效应。而血管活性肠肽 (VIP) 则具有抑制肥大细胞脱颗粒并改变其胞内颗粒含量的作用。
3 肠道黏膜免疫系统
肠道黏膜免疫系统即肠相关淋巴组织 (GALT) , GALT包括淋巴细胞、位于集合淋巴结表面的特殊上皮细胞、带有微绒毛的膜细胞, 以及肥大细胞、巨噬细胞和粒细胞等, 分为组织性淋巴样组织和广泛地分布于黏膜固有层中的弥散淋巴组织。组织性淋巴样组织是免疫应答的传人淋巴区, 抗原由此进入GALT, 被抗原呈递细胞捕获、处理和呈递给免疫活性细胞, 诱发免疫应答。弥散淋巴组织是免疫应答的传出淋巴区, 包括固有层内淋巴细胞 (IPL) 和上皮内淋巴细胞 (IEL) , IEL是一群位于肠绒毛上皮细胞之间的淋巴细胞, 大部分位于上皮基底部, 主要是Tcell。浆细胞和致敏淋巴细胞通过归巢机制迁移至弥散淋巴组织, 抗体和致敏淋巴组织在此发挥生物学功能, 是黏膜免疫的效应部位。
4 肥大细胞
肥大细胞起源于骨髓多能干细胞, 在鸡肠道中仅存在一种类型的肥大细胞, 啮齿类动物前体肥大细胞离开造血器官进入腹腔后诱导分化成结缔组织肥大细胞 (CTMC) , 分布于大多数器官的血管周围;进入胸腺后可诱导分化成黏膜肥大细胞 (MMC) , 分布于肠道和肺脏的黏膜, 在肠道寄生虫感染时肠道中MMC数量明显升高。肥大细胞含有大量的膜性结合颗粒, 分布于整个细胞浆, 颗粒内含有组胺、5-羟色胺等化学递质和神经肽、细胞因子等神经调质以及类胰蛋白酶等多种酶类, 肥大细胞激活后以脱颗粒的方式将类胰蛋白酶释放出来, 它可以激活分布于含有神经肽类物质神经表面的蛋白酶激活受体-2 (Proteaseacti-vated receptor 2, PAR2) , 促进SP等神经肽类物质的释放, 这一机制的发现更加证实了肥大细胞和神经肽之间存在着功能上的密切联系。
成熟肥大细胞通过释放颗粒内的物质对相邻的细胞或组织引起不同的效应。肥大细胞是速发型过敏反应的主要靶细胞, 当过敏原进入消化道或呼吸道黏膜, 在黏膜表面引起Ig E应答, 肥大细胞上有与Ig E Fc片段结合的受体, 再次受到同种抗原刺激后脱颗粒而释放生物活性因子, 造成速发型变态反应。肥大细胞通过释放化学介质、神经调质等影响与之毗邻的神经末梢和效应器;同样的, 神经末梢和效应器也可借助神经肽类以及细胞因子等物质影响肥大细胞。肥大细胞和神经末梢之间存在双向的调节机制。它和神经系统的关系提示它有一定的免疫调节功能, 可能在神经免疫内分泌系统中起到了重要作用有待进一步研究。
肥大细胞是速发型变态反应的初级效应细胞, 肥大细胞活化的非免疫途径有: (1) 受体途径, 其中包括:神经递质、多肽 (如P物质、降钙素基因相关肽、VIP等) ;补体C3a、C5a等血管活性物质的作用;Toll样受体;细胞因子 (ILl、IL一3、粒-巨噬细胞集落刺激因子等) 、趋化因子受体。 (2) 非受体途径有:药物:碱性物质 (如多粘菌素B、碱性氨基酸的多聚体等) ;食物;细菌毒素和内毒素。肥大细胞激活后直接影响次级效应细胞嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的募集和激活。
当过敏性炎症反应时, Th2细胞分泌细胞因子, 刺激肥大细胞成熟及增殖。而当刺激因素消退后, 增殖的肥大细胞通过多种途径 (如凋亡或至脾脏) 被清除。肥大细胞即使高度分化仍具有增殖能力, 并且完全脱颗粒后仍能增殖, 并能再次形成颗粒, 恢复原有形态。
许多肠道寄生虫, 经口侵入宿主后, 首先黏附于肠黏膜, 并在肠上皮细胞表面或细胞内进行增殖, 导致肠上皮损伤, 同时诱导宿主产生免疫应答。病原体与肠黏膜细胞的相互作用诱导多种免疫因子及效应分子的表达, 并参与机体的免疫防御功能。MC释放的嗜酸性粒细胞趋化因子, 可使局部嗜酸细胞增多并发挥其抗蠕虫作用[10]。嗜酸性粒细胞对侵入的寄生虫起杀伤作用, 参与寄生虫肉芽肿的形成以局限来自寄生虫的毒性物质, 对寄生虫感染引起的过敏反应起调节作用。MC所释放的组织胺及蛋白酶等产物可显著地增加肠道局部血管的通透性, 促进上皮黏膜分泌, 局部ρH值升高, 有助于寄生虫的排除、黏膜分泌及肥大细胞介质的释放, 也有助于血清、抗体及补体进入肠腔, 从而发挥肠道寄生虫免疫。
5 讨论
大量事实表明, 单色光对鸡的生产性能和免疫功能发挥着重要作用, 由于肠道免疫是重要的一道免疫防线, 希望将来把单色光对肠道免疫的机制研究清楚, 为禽类绿色养殖提供理论基础。
摘要：由于人们对动物产品的安全性要求越来越高, 所以利用健康养殖手段提高动物体的免疫能力变得越来越重要。光信息在禽类的养殖上具有重要作用, 尤其是光色信息对禽类的生产性能和免疫性能有着重要影响。文章综述了光色信息对鸡肠道免疫方面的研究进展。
关键词：单色光,肠道免疫,肥大细胞,神经系统
参考文献
[1]陈耀星, 王子旭, 内藤顺平.鸡投射视顶盖视网膜节细胞的形态学分类.解剖学报, 2002 (01) :47-50.
[2]谢电, 陈耀星, 王子旭, 等.单色光对肉鸡生产性能和免疫功能的影响.中国家禽, 2007 (01) :14-17.
[3]陈敏.肠神经系统神经肽对免疫系统的作用.国外医学内科学分册, 2005 (07) :296-299.
[4]王利华, 方秀才, 潘国宗.肠易激综合征患者肠黏膜肥大细胞与神经纤维的关联.中华消化杂志, 2003 (06) :332-335.
[5]许乐仁, 高登慧, 欧德渊.家禽的肥大细胞.中国兽医杂志, 2002 (05) :32-35.
[6]呼格吉乐图, 许乐仁, 佘锐萍, 等.肥大细胞的功能.动物医学进展, 2004 (01) :11-13.
[7]杨汉春.动物免疫学 (第2版) .北京:中国农业大学出版社, 2003.
[8]吴景良, 张理涛.肥大细胞免疫生物学研究进展.中国中西医结合, 2008 (01) :60-63.
[9]刘影.嗜酸性粒细胞与寄生虫感染.国外医学寄生虫分册, 1999 (06) :249-252.
肠道免疫细胞 第7篇
1 材料
1.1 试验动物
雌性Balb/c SPF小鼠,购于北京华阜康生物科技有限公司。所有小鼠饲养在单独的隔离器中,食物和水均经过高压灭菌。小鼠长到8~10周龄后颈椎脱臼处死,并取小鼠肠道,用10%福尔马林固定,备用。
1.2 主要试剂与仪器
小牛血清,浙江天杭生物科技有限公司生产;兔抗鼠RegⅢγ一抗、CY3标记的山羊抗兔Ig G二抗,Bioss公司生产;DAPI,Sigma公司生产;0.01 mol/LLPBS(p H值为7.2)、3%CH3OH-H2O2溶液、0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(p H值为6.0),吉林农业科技学院动物医学检测中心提供;荧光倒置显微镜(型号为IX51),OLYMPUS公司生产;恒温箱(型号为3111),Thermo公司生产。
2 方法
2.1 石蜡切片的制作
取颈椎处死的小鼠肠道置于10%福尔马林溶液中固定,固定时间分别设置2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h[10,11,12,13]。之后于自来水中冲洗过夜,经50%~100%梯度乙醇脱水各梯度均30 min,无水乙醇二甲苯1∶1混合溶液30 min,二甲苯透明30 min,60℃浸蜡2 h,并进行石蜡包埋。连续切4μm厚的石蜡切片,40℃水浴展片,60℃烤箱烤片50 min,二甲苯脱蜡20 min共2次,梯度乙醇及纯化水水化。
2.2 最适抗原修复条件的确定
将制备好的组织切片PBS浸洗5 min共2次,加3%CH3OH-H2O2溶液封闭10 min,PBS清洗5 min共2次,0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液95℃水浴加热[14]。根据参考文献[10,13],将加热时间分别设置为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。加热修复后滴加抗原修复液孵育10 min,缓慢冷却至室温。PBS浸洗5 min共3次,加入10%小牛血清抗原封闭30 min。无抗原修复组,切片脱蜡复水后PBS浸洗,其他步骤与抗原修复组相同。
2.3 免疫荧光抗体最佳工作浓度的确定
兔抗鼠RegⅢγ一抗最佳稀释浓度的确定:根据兔抗鼠RegⅢγ一抗说明书推荐的稀释浓度1∶500~1∶1 000,并根据参考文献[15-16]将一抗的稀释浓度做了更大范围的探索,选取同一肠段的已阻断处理的小鼠肠道组织切片。二抗的稀释浓度固定为1∶200,分别对一抗进行1∶200,1∶300,1∶500,1∶700,1∶1 000,1∶1 200倍的稀释。4℃孵育过夜,37℃复温1 h,PBS清洗5 min共3次。选择荧光明亮清晰且稀释倍数最大,稀释度为一抗最佳工作浓度。
山羊抗兔Ig G二抗最佳稀释浓度确定:综合二抗说明书及参考文献[15-16]的稀释范围将二抗稀释倍数定为1∶100,1∶200,1∶300,1∶400,1∶500,1∶600。依次加入组织切片中,37℃温箱避光孵育1 h,PBS清洗5 min共3次,常规DAPI复染,镜检。
2.4 设置其他试验分组
重复试验组,取相同批次的小鼠小肠组织切片、一抗、二抗及DAPI,设置相同条件进行重复性试验,观察荧光强度是否有所改变,检验本方法是否具有重复性。自发荧光组,切片脱蜡复水后直接滴加0.01 mol/L PBS,置于荧光倒置显微镜下,检测样本是否存在自发光现象。空白对照组,用PBS替代一抗,进行间接免疫荧光试验,检测二抗本身是否有非特异性反应并设阳性对照组。
2.5 观察结果
对所有石蜡切片进行镜检,观察组织完整度、机构清晰性,衡量抗原修复和染色方法对组织的破坏程度;观察蛋白阳性荧光信号强度,评定检测方法敏感性;观察阴性样品表达荧光信号,评定染色方法特异性。所有照片均未经过对比度、亮度等调节处理,以最终样本荧光染色后的图像作为观察指标,衡量检测方法的优劣。
3 结果与分析
3.1 不同固定时间对免疫荧光结果的影响
对颈椎脱臼处死的小鼠肠道以相同体积分数的甲醛作为固定液,用不同时间进行固定,根据不同固定时间组织固定是否充分、组织切片蛋白交联程度,最终确定小鼠肠道RegⅢγIFA试验中,确定6 h为最佳固定时间。
3.2 不同抗原修复时间对石蜡包埋组织的影响
对于已知有表达RegⅢγ的阳性标本,未见抗原修复组染色不良,见289页彩图1A。柠檬酸盐缓冲液95℃修复15 min染色良好,对比修复20 min荧光强度相同,且组织形态更完整,结构清晰,见289页彩图1 B、C。修复30 min组织结构模糊,表明过长时间的修复使组织遭到破坏,见289页彩图1D。提示高温热修复15~25 min均能表达较高的敏感性。而对于组织结构完整性和清晰度,由高到低顺序为:高温修复15 min组>高温修复20 min组>高温修复25 min组。
3.3 抗体最佳工作条件的确定
根据镜检结果,判定特异性荧光强度和荧光蛋白的数量,在保证既避免非特异性荧光的干扰,又有特异性荧光以便观察的条件下,一抗的稀释度为1∶300~1∶700时均可见明亮的特异性荧光。3个稀释梯度中以1∶500时镜检结果最为清晰,背景染色低,特异性最强;一抗的稀释度为1∶700时荧光强度微弱,对RegⅢγ表达情况难以做出判断;一抗的稀释度为1∶300时可见荧光强度非常高,考虑到实际应用时染色成本以及染色结果的特异性,确定1∶500倍稀释作为最适稀释浓度。
当二抗稀释度为1∶300~1∶500时均可见特异性荧光,荧光亮度为1∶300时强度最亮且特异性最好,RegⅢγ蛋白呈现亮红色荧光带,分布于小肠黏膜表面,特异性荧光最明显;稀释度为1∶400时荧光已变弱,特异性降低。确定山羊抗兔Ig G荧光抗体的最适稀释浓度为1∶300,见289页彩图2。
3.4 其他试验分组结果
相同条件下对同批切片进行重复性试验,结果表明,试验结果与判定结果完全相同,荧光只有微小改变,提示本方法重复性好。样本自发荧光对照试验结果表明,阳性对照组IFA呈现明显特异性荧光,而将新的封闭处理过的组织切片滴加0.01 mol/L的PBS后直接置于荧光倒置显微镜下观察,不存在自发荧光。空白对照试验结果表明,以PBS代替一抗进行IFA试验,抗原与二抗之间无非特异性反应,免疫荧光显微镜下呈深色背景。
4 讨论
在RegⅢγ蛋白IFA检测过程中,检测条件是影响该检测方法准确性的直接因素。根据本试验的特点,笔者在试验各环节分别作了大量的尝试性试验,确定了检测RegⅢγ蛋白的最适条件。在制作石蜡切片过程中参照参考文献[10-13]发现,免疫荧光试验中常用组织固定时间为3~6 h、12 h、24 h,其中以12 h为最佳的居多[10,11]。但甲醛固定使蛋白质交联,抗原决定簇封闭[17,18,19],导致荧光抗体无法结合。笔者在前人研究结果基础上对小鼠肠道固定时间进行了长期探索,固定12 h或24 h可将小肠固定充分,肠组织交联严重,抗原修复难度大,RegⅢγ蛋白荧光敏感性降低;固定3 h组织固定时间短,固定不充分,后续试验发现组织结构完整性低。综合考虑固定充分性及组织交联情况,最终确定甲醛固定的最佳时间为6 h。小鼠肠道属于管腔结构,且组织厚度低,固定6 h既能达到充分固定,又能降低蛋白交联强度。二者达到最佳平衡点,因此可以作为肠道中RegⅢγ蛋白IFA试验组织固定时间。
抗原修复可将固定时分子之间所形成的交联打破,恢复抗原原有形态。其也成为了甲醛固定组织免疫荧光检测过程中重要的影响因素。试验中,笔者选用柠檬酸盐缓冲液95℃加热15 min后滴加抗原修复液,室温缓慢冷却。高温修复是一种强烈的修复方式,以往研究中选择沸水浴或高温高压加热10 min[10,17,18,19,20],也有研究将修复温度降低至95℃,修复时间为30 min[14]作为最佳修复条件。考虑本试验中RegⅢγ蛋白在肠道中分布量较少,小鼠肠道管壁薄且组织结构复杂,在进行抗原修复时分别设置了95℃、100℃2个温度梯度,5组不同时间。最终筛选出最佳修复条件为95℃15 min。100℃沸水浴和高温、高压修复对组织有一定程度的破坏,安全性低,95℃修复结果稳定,安全性高。15 min的修复时间既能保证RegⅢγ蛋白荧光的特异性,又大大降低了过度修复对组织结构的破坏率。10 min的修复时间修复不足,抗体结合率低,20 min以上的修复时间过长,修复过度又导致组织结构破坏,因此热修复的温度和时间必须精确把握。最终确定本检测方法中抗原修复最佳条件为95℃水浴修复15 min。
在保证抗体本身特异性的基础上,决定IFA敏感性的另一因素为抗体浓度。笔者参考抗体说明书及参考文献[15-16]将一抗、二抗浓度分别作不同稀释倍数,结果表明,一抗、二抗的最佳稀释浓度为1∶500,1∶300,同时在充分的抗原封闭条件下,并不增加背景信号。这与张舍郁[15]1∶200,1∶100的稀释浓度及李红阁等[16]1∶500,1∶500的稀释浓度的研究结果存在差异,可能与不同组织及目的蛋白不同有关。该试验选用经典的DAPI(0.1 mg/m L)衬染,将组织细胞核染成亮蓝色,与特异性红色荧光形成鲜明对比,提高了组织结构分辨率。此外,充分的二甲苯脱蜡、抗原封闭及PBS清洗均能提高试验特异性,大大降低背景荧光信号,保证试验结果清晰明亮。
5 结论
肠道免疫细胞 第8篇
抗氧化机制是鱼类防止氧化损伤的主要屏障, 它能够清除体内氧自由基, 增强机体的抵抗力, 维持体内动态平衡。 超氧化物歧化酶 (SOD) 是重要的自由基清除剂, 它能保护机体免受氧化损伤。过氧化氢酶 (CAT) 能够将过氧化氢分解为水和氧气, 对于维持鱼类细胞的氧化还原状态及对氧化应激的防御起着关键的作用。非特异性的体液免疫和细胞免疫系统是鱼类抵抗外来病原入侵的第一道防线[7]。酸性磷酸酶 (ACP) 作为溶酶体的标志酶, 具有清除衰老或死亡的细胞和细胞器, 识别、吞噬和降解入侵的病原体的作用, 同时在免疫防护方面具有重要作用。碱性磷酸酶 (AKP) 是动物溶酶体的组成部分, 参与营养物质的吸收、利用, 钙的代谢, 在免疫反应中也发挥重要作用[8]。丙二醛 (MDA) 是脂质过氧化物, 可以间接反映组织细胞脂质过氧化的程度, 而且还可以间接反映活性氧自由基产生的数量。因此, 抗氧化酶和免疫酶在维持鱼体稳态, 增强抵抗力方面具有重要的作用。
花鲈 (Lateolabrax maculatus) 隶属于鲈形目鮨科花鲈属, 主要分布于太平洋西部, 在我国黄海、渤海等海域及朝鲜半岛均有分布, 是我国重要海产经济鱼类之一。花鲈是一种广盐性鱼类, 在海水、半咸水、淡水中都有养殖。然而, 对花鲈在盐度胁迫下, 免疫和抗氧化方面的研究还较少。该文以花鲈幼鱼为研究对象, 通过测定不同盐度胁迫下, 肠道超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、酸性磷酸酶 (ACP) 碱性磷酸酶 (AKP) 的活力以及丙二醛 (MDA) 的含量的变化, 探讨花鲈在盐度胁迫下抗氧化能力和免疫能力的变化, 分析花鲈对盐度变化的适应性。通过该项研究, 在理论上丰富花鲈免疫生理学研究内容, 在生产实践上为花鲈的健康养殖和水环境调控提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验鱼种。试验所用花鲈为珠海市斗门区河口渔业研究所池塘养殖的幼鱼, 试验之前在盐度为10‰的水泥池中暂养10 d。试验选用体质健壮、活力旺盛的幼鱼进行, 试验用鱼体长为 (5.56±0.68) cm、体重为 (1.50±0.31) g。
1.1.2试验试剂。试验测定超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、 酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活力和丙二醛、蛋白含量所用试剂盒均采购于南京建成生物工程研究所。
1.2试验设计
试验在30 L的塑料箱中进行, 分为5‰、10‰、15‰、 20‰、25‰ 5个盐度组, 其中10‰为对照组 (CK) , 每个处理3个平行。试验过程中每日换水1/3, 试验用水为曝气自来水和过滤海水配制而成。24 h不间断充气, 及时清除残余饵料及粪便。
1.3样品采集
在试验开始的1 d、11 d和21 d采集样品, 每个时间点在每个塑料箱中采集3尾鱼, 将其用MS-222麻醉剂进行快速麻醉, 解剖后采集其肠道, 迅速放入离心管中, 保存于液氮, 待测。
1.4样品的制备
准确称取0.2 g样品, 按重量体积比1∶9 (g/m L) 向样品中加入生理盐水, 在冰水浴条件下, 采用转速为2 500 r/min离心10 min, 取上清液, 保存于-20 ℃冰箱中, 在1周内进行测定。
1.5酶活力的测定
蛋白质浓度的测定运用考马斯亮蓝法, 考马斯亮蓝遇蛋白质显现蓝色, 在595 nm波长处测其吸光度, 再转换为蛋白质含量;超氧化物歧化酶采用黄嘌呤氧化酶法测定, 在显色剂作用下反应系统呈现紫红色, 在550 nm波长处测定其吸光度, 通过公式转化为酶活力值。定义1 mg组织蛋白在1 m L反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位 (U) 。过氧化氢酶采用钼酸铵法测定[8], 过氧化氢与钼酸铵产生黄的淡络合物, 在405 nm波长处测定其吸光度, 计算转化为酶活力。定义1 mg组织蛋白1 s分解1 μmol过氧化氢的量为一个活力单位 (U) 。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力的测量采用磷酸苯二钠法, 2种酶与磷酸苯二钠作用产生红色的衍生物, 在520 nm波长处测其吸光度, 转化为酶活力。酸性磷酸酶定义1 g组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个金氏单位。碱性磷酸酶定义1 g组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位; 丙二醛采用硫代巴比妥酸 (TBA) 法进行测定, 反应体系产生红色产物, 在532 nm波长处测其吸光度, 计算转换为丙二醛含量。
1.6数据分析
该试验数据用平均值±标准差表示, 利用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA) 以及Duncan多重比较检验数据差异的显著性, 以P<0.05为差异显著。
2结果与分析
2.1盐度胁迫下超氧化物歧化酶活力的变化
如图1所示, 在急性胁迫的第1天, 随着胁迫强度的增加, SOD活力逐渐增强, 1 d时25‰组活力显著高于其他各盐度 (P<0.05) 。在11 d时, 各盐度组之间, SOD活力差异不明显 (P>0.05) , 已经基本恢复至正常水平。在21 d时, 25‰ 处理组SOD活力显著低于其他盐度组 (P<0.05) 。在5‰、10‰ 处理组, 随着时间变化, SOD活力变化不明显。而15‰、20‰、 25‰盐度组第1天SOD活力显著高于另外2个时间点。
注:大写字母不同表示同一时间不同盐度处理组间存在显著性差异 (P<0.05) ;小写字母不同表示同一盐度不同时间处理组间存在显著性差异 (P<0.05) , 下同。
2.2盐度胁迫下过氧化氢活力的变化
盐度胁迫下CAT活力变化如图2所示。总体看来, CAT变化趋势和SOD有很高的相似性。在急性盐度胁迫作用下, 第1天胁迫组CAT活力有增高的趋势, 25‰盐度组活力最高, 5‰盐度处理组次高, 其余3个盐度组没有显著性变化 (P>0.05) 。在第11天, 各组活力逐渐恢复至正常水平。胁迫后21 d, 各盐度组没有表现出显著性差异 (P>0.05) , 此时25‰ 组CAT活力最低。 在同一盐度各不同时间处理组中, 5‰、10‰、15‰盐度组在各时间点之间没有显著性差异, 变化较小。20‰和25‰盐度组第1天的CAT活力显著高于11 d和21 d (P<0.05) , 而后二者之间没有显著差异 (P>0.05) 。
2.3盐度胁迫下酸性磷酸酶活力的变化
如图3所示, 花鲈在盐度胁迫下, 酸性磷酸酶的活力有降低的趋势。在急性胁迫的第1天, 各处理组酸性磷酸酶活力都低于对照组, 并且低盐度胁迫 (5‰) 下, 活力降低最为显著 (P<0.05) 。在第11天, 25‰盐度组活力迅速上升, 活力显著高于其他各组 (P<0.05) 。在21 d, CAT活力随盐度升高而升高。各盐度处理组, 随着时间的推延, CAT活力都有上升的趋势。
2.4盐度胁迫下碱性磷酸酶活力的变化
如图4所示, 在盐度的急性胁迫下, 碱性磷酸酶活力在第1天的各处理组中都有下降的趋势, 5‰、20‰、25‰显著低于对照组 (P<0.05) 。在11 d时, 各处理组AKP活力都有所回升, 各组之间也表现出明显的差异。在21 d, 25‰组AKP活力快速升高, 并显著高于其他盐度组。AKP活力在总体上也表现出随盐度升高而上升的趋势。
2.5盐度胁迫下丙二醛含量的变化
盐度胁迫下, MDA含量变化如图5所示, 在急性胁迫的第1天, 各处理组MDA都显著升高 (P<0.05) , 且随着胁迫强度的增加, MDA含量升高。在11 d, 各处理组MDA含量都显著下降 (P<0.05) 。在胁迫后的第21天, 各盐度组MDA含量都恢复正常水平, 含量比较低。
3讨论与结论
抗氧化机制和非特异性免疫体系在维持鱼类动态平衡、增强鱼体抵抗力等方面具有重要作用[9]。该研究发现, 试验中所测得的抗氧化酶和非特异性免疫酶类在盐度胁迫下都有较为显著的变化。这也说明盐度胁迫对花鲈幼鱼抗氧化能力和非特异性免疫能力有显著的影响。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶, 能够清除体内超氧自由基 (O2-) , 保护鱼体细胞免受活性氧自由基的损伤, 是抗氧化机制中的关键酶[10]。有研究发现, 当鱼类生存环境 (盐度、水温、溶解氧等) 发生变化时, 均能够引起鱼体抗氧化能力的变化[11]。在盐度急性胁迫开始的第1天, 盐度处理组SOD活力较对照组 (10‰) 升高, 这是由于在盐度胁迫下, 鱼体要消耗更多的能量来维持身体平衡, 而在这个代谢旺盛的过程中会产生大量的活性氧自由基, SOD活力升高用以清除这些自由基, 进而保护鱼体免受氧化损伤。在11 d的样品中, 各盐度条件下SOD活力没有显著差异, 推测这是随着时间推移, 鱼体适应各自盐度环境的缘故。21 d时, 25‰盐度组SOD活力显著低于其他组, 这可能是由于此盐度是花鲈幼鱼最适生长盐度, 因此受到胁迫压力小而其SOD活力也较低。
过氧化氢酶 (CAT) 是生物体内过氧化物酶类的标志酶, 占过氧化物总酶体量的40%[12]。CAT能够将体内的过氧化氢分解成水和氧气, 保护机体免受氧化的危害。该研究发现, 盐度胁迫下, 花鲈幼鱼肠道中SOD和CAT在急性盐度胁迫下的变化趋势高度相似, 推测这是由于二者在功能上的协同性导致的[13]。胁迫后第1天, 各处理组CAT活力都显著升高, 且随着胁迫强度的增加, CAT活力升高也更加显著, 推测这与SOD变化原因相同。但是, 可以发现低盐度胁迫 (5‰ ) 对花鲈幼鱼的影响较高盐度强烈。 在之后各时间点, CAT恢复正常水平, 推测是由于花鲈幼鱼此时已经适应各自的盐度环境, 胁迫程度也显著降低。
酸性磷酸酶 (ACP) 是高等动物体内巨噬细胞溶酶体的标志性酶, 在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢[14]。酸性磷酸酶作为溶酶体的标志酶, 参与消除生物大分子, 维持细胞正常代谢活动, 清除衰老或死亡的细胞和细胞器, 识别、 吞噬和降解入侵的病原体, 在免疫防护方面起重要作用[15]。 该试验发现, 在胁迫试验开始的第1天, 各盐度处理组ACP活力低于对照组, 低盐度胁迫 (5‰) ACP活力显著低于对照组, 这可能是由于盐度的急性变化抑制了ACP的活力, 并且低盐度胁迫的抑制作用明显。随着鱼体对环境的适应, 在11 d和21 d各盐度处理组ACP活力都有所上升。在最后一次采得的样品中, ACP活力显现出随着盐度升高而升高的趋势, 根据白秀娟等在文昌鱼 (Branchiostoma lanceolatum) 中的研究结果[16], 推测这是由于金属离子对ACP活力的激活作用。
碱性磷酸酶 (AKP) 是溶酶体酶的重要组成部分, 在鱼体的生长、物质代谢以及免疫方面具有重要作用[17]。在该试验中, 急性盐度胁迫下, AKP活力在第1天受到抑制。各盐度组AKP活力随着时间都有显著升高的趋势。且随着盐度的升高, AKP活力也有升高的趋势。与该试验结果相比较, 刘存歧等发现海水中金属离子的升高对酸性磷酸酶活力有促进作用[18];冯娟等在军曹鱼 (Rachycentron canadum Linnaeus) 盐度胁迫的试验中得到的结果与该文试验结果一致[19]。推测这种变化趋势是由于水中金属离子对AKP活力的促进作用。
丙二醛 (MDA) 是脂质过氧化物, MDA含量的高低能够直接反应脂质氧化的程度, 也能间接反应自由基的数量。因此其可以作为脂质氧化程度和自由基产生数量的反应指标[20]。在盐度胁迫初期 (1 d) , 各盐度处理组MDA含量显著高于对照组。这是由于在盐度胁迫下, 花鲈幼鱼需要消耗额外的能量来维持机体渗透压平衡, 在这些过程中产生的活性氧自由基将脂质氧化, 从而导致MDA含量增多。随着SOD和CAT等抗氧化酶类活力的增加, MDA含量在第11天和第21天活力都显著降低, 最后恢复至正常水平。
