胰岛分泌细胞范文（精选9篇）
胰岛分泌细胞 第1篇
关键词：2型糖尿病,A细胞,胰高血糖素
当前对于2型糖尿病的发病机制,被普遍接受的观点是由于胰岛素抵抗引起的相对胰岛素不足致代偿性高胰岛素血症和B细胞失代偿后的绝对胰岛素不足。但随着研究的深入,胰高血糖素在2型糖尿病发展过程中的作用正被逐步认知,Unger等提出的“二元论”也被大家所接受。但对于如何纠正高胰高血糖素血症,目前报道不多。本研究通过检测不同程度的2型糖尿病患者血胰高血糖素水平,并予以人胰岛素治疗,检测治疗后胰高血糖素的血浆浓度的变化,旨在探讨胰岛素治疗对A细胞分泌的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2006年4月至12月在南通大学医学院附属医院住院的2型糖尿病患者44名,男23名,女21名,均符合1999年WHO关于T2DM的诊断标准,年龄37~70岁。排除肝硬化、急性心肌梗死、感染性疾病、烧伤、休克、胰高血糖素瘤、急慢性胰腺炎、肢端肥大症、嗜铬细胞、库欣综合征、肾功能不全等疾病;无急性并发症,入院前未经胰岛素替代治疗。分组方法:糖尿病组按治疗前空腹C肽水平分成3组,D1组(20例)空腹C肽低于0.48μg/L、D2组(18例)空腹C肽水平在0.48~3.83μg/L、D3组(6例)空腹C肽水平高于3.83μg/L。选取体检中心健康体检者15名为健康对照组。其中男8名,女7名,
年龄35~68岁。其空腹血糖、尿常规、肝、肾功能均正常,询问病史排除心、脑、肝、肾、内分泌疾病、风湿性疾病、肿瘤、感染及原发性血管疾病。
1.2 方法
1.2.1 指标测定方法
空腹血糖:空腹8h后取静脉血清,采用葡萄糖氧化酶法,全自动生化分析仪(葡萄糖测定试剂盒由上海名典生物工程有限公司提供)测定空腹血糖。胰岛素及C肽:空腹8h后取静脉血清,采用化学发光法(胰岛素定量测定试剂盒和C肽定量测定试剂盒由北京源德生物医学工程用限公司提供)测定血清胰岛素和C肽水平。胰高血糖素:空腹8h后取静脉血浆2.0m L后立即加入预先400.0U/m L的肝素和10000.0U/m L抑肽酶处理的玻璃试管中,以3000.0r/min的速度离心5min后取上清液,采用胰高血糖素放射免疫分析药盒(北京克美东雅生物技术有限公司提供)运用γ放射免疫计数器(西安262厂FJ2003/50A)测定胰高血糖素水平;糖尿病组在胰岛素治疗后4周后停药1d复查以上指标,并求得各数据的变化率。
1.2.2 治疗方法
糖尿病组只给予预混人胰岛素诺和灵30R(诺和诺德公司提供)治疗,根据血糖水平调节胰岛素用量,经治疗后空腹血糖控制在9.0mmol/L以下,餐后2h血糖控制在11.1mmol/L以下。使用4周后停药24h后复查上述指标。
1.3 统计学方法
所有数据用均数±标准差表示,统计采用Stata7.0软件进行分析。所有的计量数据用均数±标准差表示。各均数比较采用单因素方差分析。检验水准以P<0.05为差别有统计学意义。
2 结果
在糖尿病各组胰高血糖素水平均显著高于正常组(P<0.05)。同时,对糖尿病各组间治疗前的各项指标进行对比,D2组的胰高血糖素明显高于其他两组(P<0.01),D1组又显著高于D3组(P<0.05)。治疗后3组的胰高血糖素水平都有下降,但3组间差异不明显,P值均>0.05,无统计学意义。糖尿病3组的治疗后胰高血糖素水平虽高于对照组,但无统计学意义,P值均>0.05,见表1。
与治疗前相比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01
在D1组中血胰高血糖素水平下降了14%,P值为0.032,在D2组中血胰高血糖素水平下降了35%,P值<0.01;而在D3组中,胰高血糖素变化不明显,下降了0.42%,P值为0.81,见表2。
3 讨论
Unger等所提出的“二元论”,即在2型糖尿病的发生和发展中不仅胰岛素的功能和分泌出现异常,胰高血糖素也在发挥重要的作用。因此在2型糖尿病的循环中可以测得较高水平的胰高血糖素,本研究测定了不同程度2型糖尿病患者的胰高血糖素血浆浓度,各组的结果都有统计学意义地高于对照组,这些数据所得到的结论与“二元论”相吻合。
高胰高血糖素血症在糖尿病中起重要作用,它的纠正能使糖尿病的异常转归或改善[1]。朱西娥等[2]在胰腺移植后降低胰高血糖素,也有助于控制血糖,缓解糖尿病的病情。给予外源性胰岛素替代治疗后,在本实验中可以看到D3组的高胰岛素血症有所下降,高胰高血糖素血症也下降了,但无统计学意义。而在D1、D2组中胰岛素C肽水平有不同程度的升高,胰高血糖素有所下降。这说明胰岛素替代治疗不仅可以改善胰岛B细胞的功能,同时也影响了胰岛A细胞的分泌。胰岛素替代治疗后血浆胰高血糖素浓度的下降,出现这一现象的机制可能是:(1)胰岛素替代治疗后血浆胰岛素浓度的提高也引起胰岛内环境内胰岛素水平的升高,外源性胰岛素直接抑制A细胞的分泌。(2)胰岛素替代治疗后B细胞的负担减轻,B细胞得以休息,其功能逐步恢复,分泌的内源性胰岛素增加,胰岛内环境中的内源性胰岛素水平升高,抑制了胰高血糖素的分泌。(3)“糖毒性”的解除减轻了血糖对A细胞的刺激,A细胞分泌胰高血糖素下降。(4)朱禧星[3]发现在缺乏胰岛素时,A细胞不再受葡萄糖的影响,随着胰岛素的补充和B细胞功能的恢复,胰岛内环境中胰岛素浓度上升,B细胞对A细胞分泌的抑制加强,已经证实胰岛素通过IRS-1、PI3-K途径抑制A细胞的胰高糖素的基因表达和释放[4,5]。刺激A细胞上的K+敏感的ATP通道开放而完成的[5]。(5)在胰岛内旁分泌作用中,B细胞可能分泌某些因子来抑制A细胞的分泌,随着B细胞功能的恢复,这些因子分泌增加,如Amylin或其类似物[6],加强了对胰高血糖素分泌的抑制。具体的机制尚需进一步的研究来证实。
但在我们的试验中也可以看到,在D2组中随着胰高血糖素血浓度的下降,血胰岛素、C肽浓度非但没有达到正常对照组水平,反而高于正常对照组水平,D3组中血胰岛素、C肽浓度虽有轻度的下降,也仍未降至正常对照组水平,这说明了外源性胰岛素治疗虽然可以改善A、B细胞功能,但并不能从根本上纠正胰岛素抵抗。
综上,在本项研究中进一步证实了在2型糖尿病存在A细胞分泌功能的异常。外源性胰岛素的治疗可以改善A细胞的分泌异常,部分纠正高胰高血糖素血症。胰岛素治疗的尽早使用虽然不能改变胰岛素抵抗,但可以减缓A细胞分泌功能异常的进展甚至可以部分地恢复,特别是在胰岛功能失代偿以后。
参考文献
[1]Raskin P,Unger RH.Hyperglucagonemia and its suppression.Importance in the metabolic control of diabetes[J].N Engl J Med,1978,299(9):433-436.
[2]朱西娥,李贤初,孙斌等.胰肾联合移植对糖尿病患者胰岛功能的影响[J].空军总医院学报,2000,16(4):193-196.
[3]朱禧星.现代糖尿病学[M].上海:上海医科大学出版社,2000:62-63.
[4]Kaneko K,Shirotani T,Araki E,et al.Insulin inhibits glucagon secretion by the activation of PI3-kinase in In-R1-G9cells[J].Diabetes Res Clin Pract,1999,44(1):83-92.
[5]Leung YM,Ahmed I,Sheu L,et al.Insulin regulates islet{alpha}-cell function by reducing K-ATP channel sensitivity to ATP inhibition[J].Endocrinology,2006,147(5):2155-2162.
胰岛素分泌异常与延迟 第2篇
胰岛素由胰腺中的B细胞分泌．正常人一天约分泌48单位的胰岛素。其中一半与进食无关，我们叫基础胰岛素分泌；还有一半则是在进食后，我们叫餐时胰岛素分泌。实际上，当人在闻到食物香味或看到食物时，胰岛素的分泌就会增加，较多的胰岛素进入肝脏，使肝脏胰岛素化，为机体更好地利用消化吸收的葡萄糖等营养物质作好准备，这样就避免了餐后血糖的过度升高。
经研究证实，对于早期糖尿病患者而言，胰岛素分泌异常主要表现为分泌高峰的延迟而不是分泌量的减少。当然，病程很长的糖尿病患者，其胰岛B细胞的数量和功能都明显降低，胰岛素分泌的绝对量就会明显低于正常人。
胰岛素分泌延迟的直接结果是使肝脏和外周组织难以及时和有效地利用进食后消化吸收的葡萄糖，特别是缺乏进食时的肝脏胰岛素化，不但使肝脏对葡萄糖的利用减少，而且肝脏的糖原分解和糖异生还增加，这就造成了餐后血糖的持续升高。餐后的高血糖又可能进一步刺激更多的胰岛素不恰当分泌，其结果是血糖和胰岛素分泌不能同步：血糖开始升高时，胰岛素未能增加，当血糖被利用而逐渐下降时，胰岛素分泌的高峰反而来临，这就可能导致患者在餐后3～5小时发生低血糖，被称为“高血糖后的低血糖”。
胰岛素分泌的调节剂格列奈类药物能快速刺激胰岛素分泌，对于早期仅仅表现为胰岛素分泌延迟的患者，使用后能显著改善其餐后高血糖。
胰岛分泌细胞 第3篇
对1型糖尿病患者来说, 胰岛移植是目前很好的替代治疗方法之一, 与胰腺移植相比, 胰岛移植具有相对安全、不良反应少的优势[1]。胰岛细胞移植治疗糖尿病已有近百年的历史[2], 它最早始于Ballinger等的大鼠胰岛细胞腹腔移植实验[3]。此后人们在移植部位、能否脱离外源性胰岛素控制和提高移植的胰岛细胞的存活率等进行了深入研究, 但仍然处于低谷。直到2000年, EDMONTON方案及其胰岛细胞移植后免疫抑制改良方案的出现[4], 移植成功率才有了一定的提高, 但其远期效果仍不够理想。最近几年, 临床胰岛移植研究取得了突破性的进展, 加拿大科学家报道的新型胰岛细胞分离纯化技术和无激素免疫抑制方案, 使成人胰岛细胞移植的临床应用成为可能[5]。2005年, 日本报道了世界上首例活体胰岛细胞移植取得成功, 为胰岛细胞移植提供了一个新的治疗思路[6], 但胰岛移植物的远期疗效并不尽满意, 临床上胰岛移植后5年时间内, 仅有约15% 的患者完全摆脱了外源性胰岛素依赖[7]。Shapiro等[8]分析其原因可能是:1慢性移植物排斥反应, 2未查明的急性排斥反应, 3药物对胰岛的毒性作用, 4自身免疫反应或者胰岛重建失败。目前, 国内外学者正积极进行以下几个方面的研究:1改进胰岛的分离技术, 以获得足够数量和高质量的胰岛。2研究对胰岛没有毒性的免疫抑制方案。3利用干细胞技术和异种移植来克服胰岛来源短缺。
2 胰岛素分泌细胞的新来源:脂肪间充质干细胞
间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSC) 是存在于成体组织中的非造血组织干细胞, 除了组织修复和再生功能外, MSC还具有免疫抑制特性。近年来, MSC的免疫调节与免疫抑制作用受到广泛的关注, 因其不表达或者低表达HLA-2抗原, 并且缺乏共刺激分子的表达, 提示其具有免疫赦免特性。Urbán VS等的小鼠实验研究表明MSC可诱导胰腺胰岛素分泌细胞的再生并能够抑制针对新生B细胞的T细胞介导的免疫反应[9]。Solari MG等的大鼠实验表明, MSC可以提高同种异体胰岛移植的移植物存活率, 减少免疫抑制剂用量[10]。Madec AM等通过对NOD小鼠的研究发现MSC可通过诱导调节性T细胞来阻止自身免疫反应对B细胞的破坏[11]。尽管MSC的确切免疫抑制机制还没有完全阐明, 但由于MSC对胰岛没有不良作用, 容易体外扩增, 而且来源丰富, 易于保存, 可以预见必将成为临床胰岛移植免疫治疗的新热点, 这也为胰岛移植中特异性免疫耐受的建立开辟了新途径。
脂肪来源间充质干细胞最早是由Zuk等[12]从抽脂术中取得的脂肪组织分离培养获得, 称为脂肪间充质干细胞 (adipose mesenchymalstem cells, ADSC) 。ADSC与骨髓间充质干细胞拥有相类似的细胞表型, 均为CD73+ 、CD90+ 、CD105+ 、CD45–、CD34 -[13], 然而两者并不完全相同, ADSC表面表达CD49, 而骨髓间充质干细胞表面并不表达该分子;同样, 骨髓间充质干细胞所表达的CD106并不在ADSC中表达。ADSC表面并不表达人淋巴细胞表面抗原-DR (HLA-DR) , 提示ADSC可能具有间充质干细胞的免疫赦免特性, ADSC具有多向分化潜能, 在特定的诱导培养条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及神经细胞等组织细胞定向分化, 甚至可将其定向诱导为心肌细胞、角膜细胞[14,15]等。文献报道, ADSC具有促血管化、抗氧化和免疫耐受调节的作用, 主要通过分泌多种细胞因子参与该调节作用, 包括转化生长因子 -β (TGF-β ) [16]、血小板源性生长因子 ( PDGF ) 、神经生长因子 ( NGF ) [17]等, 这些细胞因子通过内分泌与旁分泌作用参与机体其他组织的生长与重建。脂肪组织来源丰富, 可反复取材, 较少涉及医学伦理学问题[18], 它具有与骨髓间充质干细胞类似的低免疫原性和免疫调节功能, 甚至比其作用更强[19], 是胰岛素分泌细胞来源的理想选择。
3 胰腺 β 细胞发育调控因子:PDX-1
PDX-1即胰十二指肠同源盒基因-1 (pancreaticand duodenal homeobox factor-1, PDX-1) 作为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子, 对于胰腺的早期发育及晚期的增生分化均发挥着重要作用, 并且对维持胰腺β细胞的功能也发挥着重要作用。PDX-1最早是在胚胎发育早期的肠道中表达, 除直接指导、维持前肠内胚层向胰腺祖细胞发展外, 还通过结合调控蛋白HNF3β而实现调控胰腺内分泌细胞的生成。PDX-1在与其他基因的共同作用下, 最终发育为分泌胰岛素的β细胞。随着胰腺的发育, PDX-1表达有所下降, 但在成体中持续表达, 维持着β细胞的表型、胰岛素基因的转录和胰岛素颗粒的成熟与分泌。因此研究者们将PDX-1视为重编程细胞的有力武器, 构建表达外源性PDX-1基因的胚胎干细胞系, 诱导其分化为胰岛素分泌细胞[20]。
PDX-1能调节胰岛β细胞功能的相关基因表达, 将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞 ( 如肝细胞、小肠上皮细胞 ) 后, 这些细胞可以产生胰岛素[21], 在胚胎干细胞中调控PDX-1表达能调节胰岛相关基因表达[22], 在妊娠中期无内分泌细胞出现的时候, PDX-1呈现低水平的表达, 但是在妊娠的中后期胰腺β细胞出现时, PDX-1呈现高水平的表达。这也证实了PDX-1在胰腺的形成与β细胞分化方面都起着重要的作用。此外, PDX-1还是胰腺β细胞内调节葡萄糖反应的重要因子, 通常情况下低血糖可以抑制PDX-1基因表达。短期的血糖升高可以一定程度地刺激PDX-1基因表达, 但长期的高血糖则使PDX-1基因表达明显受抑[23]。如果能获得大量有生物活性的PDX-1基因转染ADSC, 可能会提高ADSC体外诱导分化的定向性, 增加诱导效率, 从而能提供足量的移植胰岛细胞。
4 胰岛移植与脂肪间充质干细胞
Okura等 [24]证实了ADSC能够被诱导分化成胰岛素分泌细胞的猜想, 为1型糖尿病的治疗提供了新方法。Kabelitz等[25] 报道, 多种内源性和外源性因子参与体外诱导ADSC向胰岛内分泌细胞分化的过程, 其中包括生长激素、催乳素、IGF-1、IGF-2、NGF和肝细胞生长因子 ( HGF ) 。脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞等多种间充质干细胞已在体外成功分化为胰岛素分泌细胞 [26], 并且间充质干细胞本身即具有免疫调节功能和抗炎作用, 通过抑制T细胞控制自身免疫反应, 达到对β细胞的保护作用 [27]。糖尿病鼠实验证实将体外分化得到的胰岛素分泌细胞移植到小鼠体内后血糖下降了50% [28] ;另一项鼠模型实验进行了自体间充质干细胞移植, 移植后小鼠血糖水平得到了更好的控制[29]。此外, 间充质干细胞对于糖尿病相关并发症, 如糖尿病肾病[30, 31] 、视网膜病变[32]等, 都被证实具有一定的效果。间充质干细胞在临床上的应用目前仍存在很多问题, 在鼠模型实验中曾发现移植鼠体内出现肿块, 组织病理学证实其恶性征象[28], 这也提示了将脂肪间充质干细胞用于胰岛移植, 尚需进行进一步有效性及安全性的测试。
5 胰岛移植、PDX-1 与脂肪间充质干细胞
近年来, 人们利用PDX-1将非胰岛细胞扩增和诱导其分化为胰岛细胞或类胰岛细胞从而产生和分泌胰岛素。并有研究[33,34,35]显示PDX-1可以将骨髓间充质干细胞、新生胰腺细胞群、脂肪源性干细胞等分化为胰岛素分泌细胞。已知Foxal1和Foxal2都属于forkhead box转录因子家族中的成员, 研究发现转录因子Foxal1和Foxal2共同占据PDX-1基因的多重调控结构域 , 联合敲除胰腺原基中的Foxal1和Foxal2基因将导致PDX-1表达的完全缺失和严重的胰腺发育不全, 突变鼠呈现高血糖及腺泡和胰岛发育的严重破坏, 且出生后不久便会死亡[36]。
研究表明人类脂肪组织源性干细胞 (ADSC) 可以分化为表达胰岛素、胰高血糖素以及生长抑素的细胞[37]。Yuan等[38]利用表达载体将人PDX-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞, 发现PDX-1单独作用足以诱导胰岛素基因的表达及胰岛素分泌, 进一步增加PDX-1的表达水 平将以剂量 依赖性的 增加胰岛 素m RNA水平及胰岛素分泌量, 与此发现相一致, PDX-1的表达水平与MSC的生长率呈正相关。Lee等[34]用编码小鼠PDX-1基因的重组腺病毒转染ADSC , 且将ADSC在高糖环境下分化, 结果发现, 过表达外源性的PDX-1能明显增加胰岛素基因的转录以及胰腺发育所必需关键的转录因子 (如Foxa2、NKx2.2和Neuro D的表达;另外在PDX-1所诱导的ADSC中, 还发现有维持胰岛B细胞功能所必需的GLP-1受体、GLUT2和GCK的表达。进一步将PDX-1所诱导的ADSC移植到STZ诱发的糖尿病小鼠体内, 发现小鼠血糖水平较之前明显下降。
6 问题与展望
胰岛移植作为一种有望根治糖尿病的最新治疗方法而倍受关注, 但目前仍遭受器官来源不足及免疫抑制等问题。PDX-1在促进胰岛细胞增殖与分化以及胰岛素合成与分泌, 尤其在诱导非胰岛细胞转化为胰岛素分泌细胞的巨大潜能已逐渐引起人们的关注。利用PDX-1基因转染技术向细胞内导入PDX-1基因和利用外源性调控因子对其进行诱导分化, 以期提高脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的效率, 提高胰岛素的分泌水平, 来解决胰岛来源难题。PDX-1作为胰腺基因调控中的中枢环节, 是如何影响其他转录因子或与其他转录因子共同作用的, 尚需进一步研究。但尝试将PDX-1基因用于提高脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞方面有一定创新性, 在糖尿病治疗、改善β细胞功能方等面有着巨大的临床应用前景。
摘要：1型糖尿病主要是由于胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏引起, 胰岛β细胞无法再生, 也不能进行异种移植, 干细胞移植是治疗糖尿病的新型方法。已有研究证实了脂肪间充质干细胞 (adipose mesenchymal stem cells, ADSC) 能够被诱导分化成胰岛素分泌细胞, 也有研究显示了胰十二指肠同源盒基因-1 (PDX-1) 可诱导非胰岛分泌细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等向胰岛素分泌细胞分化, 提示PDX-1在改善胰岛β细胞再生和促进胰岛细胞恢复中有着巨大潜能。本文就当前PDX-1基因提高脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞能力的研究前景作一综述。
胰岛B细胞功能可恢复吗? 第4篇
患上2型糖尿病的原因主要有两方面：一方面是人体的胰岛B细胞功能减退，胰岛素分泌相对不足或绝对不足；另一方面是身体对胰岛素的作用产生抵抗，以致体内利用葡萄糖的能力减弱，又称为胰岛素抵抗。但不同2型糖尿病患者的胰岛B细胞功能状况和胰岛素抵抗程度不同，不同病程的糖尿病患者的胰岛素分泌时相和水平也不同。正常人进餐后胰岛素呈双相分泌。第一时相即快速分泌相，B细胞接受葡萄糖刺激，在1分钟后开始分泌胰岛素，2分钟分泌达高峰，持续5～10分钟后减弱；第二时相即延迟分泌相，快速分泌相后出现的缓慢但持久的分泌峰，进餐6～10分钟开始分泌，30～45分钟达峰，为空腹的5～10倍，90～120分钟恢复基础水平。而早期2型糖尿病患者一般表现为第一时相胰岛素释放曲线高峰延迟，第二时相分泌增强。2型糖尿病早期是胰岛B细胞对葡萄糖的失敏感性阶段，此时高血糖暂时抑制胰岛B细胞分泌胰岛素及降低了外周组织对胰岛素的敏感性，加重胰岛素抵抗。为了控制好血糖，B细胞需要分泌更多的胰岛素，进一步加重胰岛B细胞的负荷，加速胰岛B细胞功能的衰竭。
新发2型糖尿病患者的胰岛功能能否恢复，主要取决于胰岛B细胞功能有多大程度的可逆性。1997年，以色列专家在12例新诊断的2型糖尿病患者血糖水平非常高的时候，就用胰岛素泵强化治疗，结果，其中9例不再服用任何降血糖药物就可使血糖维持正常达9～50个月。平均3年不需用药，血糖水平控制良好。近年来，中国的专家也证明，这种治疗能使新发2型糖尿病患者第一时相胰岛素释放恢复正常。从实验中可以看到，血糖水平很高的初诊2型糖尿病患者，在胰岛素分泌很少、胰岛B细胞功能很差的状况下，经过一段时间的胰岛素强化治疗，使血糖控制到正常水平以后，胰岛素分泌的幅度可以增加，胰岛B细胞功能得到明显改善。
为什么新发的2型糖尿病患者在经过胰岛素强化治疗后，胰岛B细胞功能有得到逆转的可能呢?专家们认为，在高血糖的压力下，胰岛B细胞并没有死亡，它只是暂时“闭上了眼睛”，虽然高血糖对它有强烈的毒害(如较长期高浓度葡萄糖使B细胞发生不可逆性功能缺陷，医学上称为“高葡萄糖毒性”)，但是它还顽强地活着，一旦胰岛素强化治疗驱除了“高葡萄糖毒性”对它所造成的危害，胰岛B细胞可以在很大程度上得到恢复。另外，血糖控制良好后，外周组织对胰岛素的敏感性有所恢复，消除了高血糖对胰岛B细胞的持续刺激，节省了胰岛素的分泌，打断了糖尿病患者的胰岛B细胞功能衰竭的恶性循环。
所以，新发的早期2型糖尿病患者的胰岛B细胞功能，在相当大程度上是可以恢复的，要尽早消除高血糖对它的毒性，创造一个使胰岛B细胞功能恢复的有利条件。当然，我们也看到不同患者的胰岛B细胞功能损害程度也不尽相同，不是所有的2型糖尿病患者胰岛B细胞功能都能完全恢复，也不是所有的患者都需要接受这种强化的胰岛素治疗才能使胰岛功能恢复。但这至少证明了胰岛素强化治疗对糖尿病胰岛B细胞功能恢复有益。由此可见，胰岛素治疗在恢复新发2型糖尿病患者的胰岛B细胞功能上，起到了非常重要的作用。
胰岛分泌细胞 第5篇
关键词：胰岛素,电压依赖性钾通道,动作电位,大鼠
糖尿病是目前临床上常见疾病, 它是继心血管疾病及癌症之后危害人类健康的第三大疾患[1]。并且在全部心脑血管病死亡的病例中, 有13%的病例与高血糖有关, 高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[2]。目前临床上使用的促胰岛素分泌剂大都是通过抑制β细胞KATP通道的开放, 引起细胞膜的去极化和Ca2+通道开放, 最终导致胰岛素释放[3]。然而此种促胰岛素分泌机制绕过了细胞内葡萄糖这一环节, 长期给药容易造成持续过度的胰岛素分泌而引起低血糖等副反应[4]。因此研发具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌剂具有重要的意义。电压依赖性钾通道 (KV) 在葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌过程中起着重要作用[5]。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性SD大鼠, 由山西医科大学实验动物中心提供, 体重230g~270g。
1.2 试剂
胶原酶P、BSA (瑞士Roche) ;MDL-12330A、HEPES、葡萄糖、D-多聚赖氨酸 (美国Sigma) ;H89、TEA (美国Cayman Chemical) ;1640培养基 (武汉博士德公司) ;胎牛血清 (美国Gibco) ;青链霉素 (北京索莱宝公司) ;DispaseⅡ (美国Amresco) ;AO-PI试剂盒 (南京建成生物科技有限公司) ;胰岛素检测试剂盒 (北京北方生物技术研究所) 。
1.3 主要仪器
体式显微镜 (上海中恒仪器有限公司) ;电子天平 (上海精密仪器有限公司) ;倒置显微镜 (日本OLYMPUS) ;细胞培养箱 (北京博奥恒信生物科技有限公司) ;Narishige MODEL PP-830电极拉制仪、MIRO FORGE MF-830抛光仪 (日本Narishige) ;台式离心机 (长沙湘仪仪器有限公司) ;EPC10全自动膜片钳 (德国HEKA) 。
1.4 方法
1.4.1 大鼠胰岛、细胞的分离与培养
大鼠断头处死, 用1mg/mL胶原酶P溶液 (1640培养基溶解) , 消化胰腺分得胰岛, 放入37℃, 5%CO2的细胞培养箱中培养。分细胞时使用5mg/mL DispaseⅡ酶液消化胰岛, 将细胞悬浮液接种在含多聚赖氨酸的盖玻片上, 加培养液放培养箱中培养[6]。
1.4.2 大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定
用Hanks液配AO:670μmol/L, PI:750μmol/L, 4℃避光保存, 取10μL AO与1mL PI混合, 加入9mL Hanks液, 混匀过滤, 孵育胰岛10min, 在荧光显微镜下采用490nm激发光, 510nm发射光检测[7]。
1.4.3 胰岛素分泌实验
每组6个管, 每管放入5个胰岛, 先用2.8mmol/L葡萄糖孵育液37℃孵育30min, 弃上清, 后加入2.8mmol/L、8.3 mmol/L葡萄糖孵育液以及含有TEA、MDL-12330A、H89等药物孵育30min, 用放免法测上清胰岛素含量。最后加入酸乙醇粉碎胰岛, 测胰岛素的总含量。
1.4.4 膜片钳技术记录KV电流及AP时程
膜片钳使用细胞外液 (mmol/L) :141.9氯化钠, 5.6氯化钾, 1.2氯化镁, 5HEPES, 11葡萄糖, pH=7.4。细胞内液:140氯化钾, 1氯化镁, 0.05EGTA, 10氯化钠和10 HEPES, pH=7.3。细胞电容大于4pF的为β细胞, 在-70mV的钳制电压下给予-70mV~80mV电压刺激400ms, 每次递增10mV检测KV电流。记录动作电位时, 封接破膜后, 转入电流钳模式, 给予150pA、4ms的电流注入, 计算从去极化开始到复极化于静息电位之上10mV为AP时程[8]。
1.5 统计学处理
计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 用Sigmaplot 12.0软件分析, 用t检验。膜片钳数据用Pulsefit软件分析。
2 结果
2.1 大鼠胰岛活性、功能良好
AO/PI染色后, 在490nm激发光, 510nm发射光的荧光显微镜下观察, 培养过夜的胰岛95%以上可被AO/PI染成绿色 (图1A) 。胰岛素分泌实验, 在2.8mmol/L、8.3mmol/L葡萄糖情况下胰岛素分泌量见图1B。
A.95%胰岛被AO/PI染为绿色;B.在2.8mmol/L和8.3mmol/L葡萄糖时胰岛素分泌量。*P<0.05
2.2 标化后胰岛素分泌
胰岛在8.3mmol/L葡萄糖基础上加入TEA (20 mmol/L) 、MDL-12330A (10μmol/L) 、H89 (1μmol/L) , 孵育30min后, 测上清液及胰岛粉碎液内的胰岛素含量, 所测胰岛素以8.3mmol/L为标准, 标化后见图2。
在8.3 mmol/L葡萄糖基础上, TEA、MDL-12330A (MDL) 、H89的胰岛素分泌量。*P<0.05, **P<0.01
2.3 膜片钳检测KV电流
通过全细胞膜片钳技术, 检测了TEA、MDL-12330A、H89对胰岛β细胞上KV电流的影响。细胞外液11.1 mmol/L的葡萄糖阻断了KATP通道的电流对KV电流的影响。如图3C结果表明, 在80 mV电流刺激时, TEA (20 mmol/L) 、MDL-12330A (10μmol/L) 与Control相比明显地抑制了KV电流;而H89 (1μmol/L) 对KV的影响没有统计学意义 (见图3) 。
A.代表性的电流曲线;B.胰岛β细胞上Kv通道的电流-电压曲线;C.80mV去极化时Kv通道电流密度。
2.4 膜片钳检测AP时程
给予细胞150pA、4ms的电流注入, 检测细胞AP时程的变化。图4E结果显示, TEA (20mmol/L) , MDL-12330A (10μmol/L) 与Control相比, 明显延长了AP时程。
给予细胞150pA, 4 ms的电流注入刺激产生动作电位。在11.1mmol/L葡萄糖存在基础上, TEA, MDL-12, 330A (MDL) , H89产生的动作电位时程。*P<0.01, **P<0.001
3 讨论
AO进入活细胞与DNA结合发绿色荧光;PI不能进入活细胞, 只能与死亡细胞的核酸结合, 发出红色荧光[7]。本结果显示在AO/PI染色下, 95%以上的胰岛显示绿色, 胰岛活性良好 (图1A) 。相对于2.8mM的葡萄糖孵育, 8.3mmol/L葡萄糖明显的增加了胰岛素分泌 (图1B) , 大鼠胰岛功能良好。在8.3mmol/L葡萄糖的基础上, TEA (20 mmol/L) 、MDL-12330A (10μmol/L) 进一步增加了胰岛素分泌。而在相同条件下H89对胰岛素分泌没有影响 (图2) 。电流-电压曲线关系表明, TEA、MDL-12330A极大地抑制了KV通道开放, 减小了KV电流, 同样的情况下H89对KV电流没有影响 (图3B) 。通过给予β细胞150pA, 4ms的电流注入, 观察细胞膜AP时程的变化。结果显示, TEA、MDL-12330A通过抑制KV通道的开放, 显著延长AP时程, H89对KV通道电流、AP时程均没有影响 (图3B、4E) 。结合以前关于β细胞上KV通道的研究[5], 在β细胞上通过抑制KV通道的开放, 延长AP的时程而增加了大鼠胰岛素的分泌。高糖可以引起细胞内的KATP/KADP比值升高, 导致了β细胞KATP通道的关闭, 引起细胞膜的去极化和Ca2+通道开放, 细胞内的Ca2+浓度升高, 最终导致胰岛素释放[3,9]。细胞膜去极化过程中还引起了KV通道的开放, 反过来促进细胞复极化缩短Ca2+通道开放时间, 减少胰岛素分泌。胰岛β细胞上KV通道只在高糖的环境下被激活, 而低糖时处于静息状态。大鼠胰岛在高糖时通过抑制KV通道的开放, 延长AP时程, 增加细胞内Ca2+浓度, 增加胰岛素分泌, 这与本实验结果相一致。
高糖环境下在大鼠胰岛β细胞上通过抑制KV通道的开放, 引起细胞膜AP时程的延长, 增加Ca2+通道开放时间, 促进了胰岛素的分泌。此结果对于促胰岛素分泌剂的研发有重要的意义。为医学界对于调控胰岛素分泌的药物研究和开发利用提供了理论依据。
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胰岛分泌细胞 第6篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究纳入患者对象均为笔者所在医院2013年1月-2014年9月确诊并收治的124例2型糖尿病患者, 所有患者均以世界卫生组织制订的糖尿病诊断标准进行样本纳入。其中男61例、女63例, 年龄42~73岁, 平均 (56.4±7.3) 岁。病程2~14年, 平均 (6.1±3.5) 年。此外, 将1型糖尿病消化功能紊乱、严重肝肾功能不全、严重心功能不全、长期胰岛素治疗史、酮症酸中毒等不适宜纳入本次研究的情况排除。将所有患者按照随机数字表法分为研究组和对照组, 每组62例。两组患者性别、年龄、病程等比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 研究方法
1.2.1对照组
本组在科学饮食运动调节的基础上, 应用生物合成例胰岛素注射液实施皮下注射, 最初每次应用剂量为0.4 U/kg, 在早午晚餐30 min前各进行注射一次。而后需密切监测血糖, 根据其血糖水平的变化, 适当地对胰岛素给药剂量进行增减。
1.2.2研究组
本组在科学饮食运动调节的基础上, 应用甘精胰岛素注射液实施皮下注射, 最初每次应用剂量为0.4 U/kg, 在每日三餐前30 min各进行注射一次。而后需密切监测血糖, 根据其血糖水平的变化, 适当地对胰岛素给药剂量进行增减。此外, 本组还需应用促胰岛素分泌剂瑞格列奈实施口服治疗, 最初应用剂量为0.5~1 mg/kg, 每日在三餐前15 min各口服1次。而后需密切监测血糖, 根据其血糖水平的变化, 适当地对瑞格列奈给药剂量进行增减。两组均治疗12周。
1.3 观察指标及疗效评定标准
首先评价两组的临床疗效。 (1) 显效:空腹血糖低于7.0 mmol/L或血糖降幅高于30%; (2) 有效:空腹血糖低于8.5 mmol/L或血糖降幅在10%~29%; (3) 无效:好转幅度未达有效标准[2]。其次, 对比两组治疗前后空腹血糖、餐后2 h血糖及糖化血红蛋白的水平变化。再次, 对比两组胰岛素平均给药剂量。最后统计两组低血糖发生情况 (空腹血糖低于4.0 mmol/L) 。
1.4 统计学处理
采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (±s ) 表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组疗效对比
研究组显效率95.16%, 显著高于对照组的83.87%, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.2 两组治疗前后血糖水平变化对比
两组治疗前空腹血糖、餐后2 h血糖及糖化血红蛋白水平无显著差异, 治疗后与治疗前比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 研究组其各指标好转幅度显著好于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
*与对照组比较, P>0.05;#与对照组比较, P<0.05;△与治疗前比较, P<0.05
2.3 两组胰岛素用量及低血糖发生情况对比
研究组胰岛素日平均剂量及低血糖发生率均显著低于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表3。
3 讨论
当前, 临床普遍指出胰岛B细胞内分泌功能衰退及胰岛素系糖尿病发生的直接诱因[3,4,5]。而糖尿病患者一旦确诊, 应终生采取降糖治疗以遏制高血糖对靶器官的损害。一般来说, 病程较长、胰岛B细胞功能显著衰弱的患者, 单纯依靠口服降糖药, 无法收获理想的疗效, 因此, 这些无法靠药物平稳且显著控制血糖的患者必须应用胰岛素注射治疗[6,7,8]。然而, 胰岛素替代疗法虽然行之有效, 然而人工注射药物难以精确符合人体生理内分泌节律, 很容易诱发低血糖。常规的生物合成人胰岛素中、短效低精胰岛素混悬液虽然降糖效果显著, 然而低精胰岛素进入体内后起效速度太快, 很容易在消化系统充分将葡萄糖吸收到血液内之前即迅速达到峰值, 极易造成低血糖[9,10]。因此, 胰岛素替代疗法的相关研究学者始终在致力于解决胰岛素替代疗法中的药效平稳问题[11,12]。
甘精胰岛素系长效胰岛素类似物, 其独特的六聚体结构, 在人体内可缓慢分解为单聚体黄色二聚体并发挥药理作用, 不但能够平稳地降低血糖, 而且还能遏制肝脏将肝糖元释放成游离的葡萄糖进入血液, 从而可显著地控制血糖[13]。和常规合成人胰岛素相比, 甘精胰岛素其胰岛素结构A21位点上的冬酰氨酸被甘氨酸取代, 这一分子结构的变化能够使甘精胰岛素维持全天候的稳定血药浓度, 几乎不会产生药物浓度峰值, 故其安全性更好[14]。
瑞格列奈系苯甲酸衍生物, 该药摄入体内0.5 h内即可发挥作用[15]。该药有效成分能迅速开放胰岛B细胞膜表面的ATP钾通道, 使胰岛B细胞内的胰岛素在早期分泌时相即迅速恢复, 再次实施分泌。因此, 该药可显著增加人体自然胰岛素的分泌量, 以发挥降血糖作用。
胰岛分泌细胞 第7篇
1 对象与方法
1.1 细胞培养、胰岛培养和实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR) MIN6细胞和B1、C3亚克隆培养于25 mmol/L葡萄糖DMEM培养基中(美国Invitrogen公司,CA),在振荡恒温器中培养出假性胰岛。为了研究葡萄糖急性和慢性暴露效应,细胞于2 mmol/L葡萄糖中培养7 d,然后将其分成4组:急性暴露两组,分别培养于2或20 mmol/L葡萄糖中1 d;慢性暴露两组,分别培养于2或20 mmol/L葡萄糖中14 d,采用我们以前常用的模型来模拟肾小球膜细胞葡萄糖毒性模型。为了防止长期低浓度葡萄糖暴露引起的细胞凋亡,整个实验过程中其培养基都添加了5 mmol/L的亮氨酸和谷氨酰胺。当细胞生长过密时,我们就传代培养。在选择性实验中,细胞暴露于0～200 nmol/L细胞松弛素D(美国Sigma公司)或0.5 μmol/L jasplakinolide或200 nmol/L鬼笔环肽(美国Invitrogen公司)中,其G/F肌动蛋白比率采用Western blot检测。我们通过胰岛细胞资源库或者在当地人类细胞处理实验室获得人类胰岛细胞[10]。β细胞含量采用激光扫描细胞计量术来确定[11]。7500RF PCR仪检测nephrin和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。PCR和测序引物设计位于内含子外显子连接处(小鼠:5-ATCTCCAAGACCCCAGGTACACA, 3-AGGGTCAGGACGGCTGAT;人类:5-CCTGCTAGAGGTGAATTCCA, 3-CCATTCTTCAGCCACTG CA)。Actin是管家基因(5-TCATGAGGTAGTCCGTCAGG,3-TCTAGGCACCAAGGTGTG)。 PCR扩增人类胰腺含胞外结构域的共938 bp nephrin基因,Blast分析证实是人类nephrin mRNA序列。
1.2 Western blotting和细胞分级分离 采用豚鼠抗nephrin抗体(1∶2 000,MA)和针对人类nephrin 单克隆抗体应用于Western blotting。这两个抗体相对分子质量为180103,其转印效率通过actin来确定(1∶5 000; MA)。培养细胞生物素化后分离细胞膜(IL)。未生物素化的细胞作为对照,其分离效率通过Western blotting检测Na/K-ATPase来评估(1∶1 000, 兔多克隆,Abcam)。细胞处于葡萄糖不足条件下1 h后,暴露于0.5或者25 mmol/L的葡萄糖溶液中30 min,然后重悬于250 μl的HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液中,最后进行蔗糖梯度离心。在重悬于250 μl的HEPES缓冲液上加入4.4 ml线性蔗糖密度梯度液,在SW50离心机中离心(110 000 g)18 h,从梯度顶端开始,可以分成大约15～16个部分。从每部分中取20 μg蛋白质用于免疫印迹分析。E-Cadherin作为细胞膜标志(1∶1 000, CA);VAMP-2 (1∶1 000,MI) 和 insulin (1∶3 000,Abcam)作为囊泡标志。
1.3 细胞转染和siRNA 一个全长的人类nephrin-pCDNA3稳定转染MIN6细胞(Fugene- 6; MA)。空载体pCDNA3作为阴性对照。4个分离出的克隆重复实验。转染GFP-nephrin的MIN- 6细胞通过抗生素选择和荧光激活细胞分选术富集浓缩。为了沉默MIN- 6细胞nephrin基因,我们选择一共4条siRNAs转染。每条siRANs可以下调nephrin表达而不影响4条中其他任意1条基因的表达。siRNA转染后,nephrin基因通过PCR和weastern blotting来证实是否下调。为了便于人类胰岛nephrin基因的沉默,我们在37 ℃ Acctase(CA)作用5 min来分离胰岛细胞。6孔板每孔0.4106细胞培养过夜,培养基为CMRL-1066(Invitrogen)。然后加入4条非靶标siRNA3.5 μg和人类nephrin siRNA3.5 μg转染细胞,最后于2 ml终溶液中加入6 μl DharmaFECT 13.5 d后,每个胰岛约为0.2106个细胞,并用于PCR实验和表面灌流实验。
1.4 共聚焦显微镜、电子显微镜观察和免疫金标记 50A9抗nepherin抗体用于免疫组织化学。为了共区域化研究,冰冻切片上的荧光信号采用酪胺信号放大器,Alexa- 647 结合抗体作二抗(1∶200)。一个无关IgG 2b抗体(MN)作为阴性对照。使用了胰岛素抗体(1∶1 000;英国NeoMarkers公司)、胰高血糖素抗体(1∶500; 美国Sigma公司)、生长激素抑制素抗体(1∶500; 英国Sigma公司)、CD31抗体(英国Abcam公司)和VAMP2 抗体(1∶500,美国Germany公司) 。为了进行免疫细胞化学染色,GFP-nephrin转染细胞先用4%低聚甲醛固定,再复染。在葡萄糖暴露下研究细胞膜内化时,同样的细胞在2 或20 mmol/L葡萄糖培养基中37 ℃孵育20 min,随后加入5 μmol/L FM1- 43 30 min[12]。Leica DMI6000显微镜拍摄图片。为了计数囊泡,细胞用2%的戊二醛、100 mmol/L蔗糖和0.05 mol/L PO4-固定。载玻片用2%锇酸后固定、0.1 mol/L PO4脱水,Epon-812包埋。电子显微镜Phillips CM-10(3900X)获取图片。双免疫金标采用前述的人类胰腺切片免疫金标法程序。胰岛素(5 nm金标)和nephrin染色(10 nm金标)分别采用兔抗胰岛素多克隆抗体和鼠抗nepherin抗体50A9。
1.5 代谢研究 体内外胰岛分泌基线和葡萄糖暴露后胰岛素分泌测试采用前述检测方法[13]。简单地说,对照、nephrin siRNA治疗、nephrin转染的MIN6细胞在20 mmol/L葡萄糖中孵育30 min后,分别计算体外葡萄糖刺激指数(用在20 mmol/L葡萄糖和2 mmol/L葡萄糖暴露下胰岛素分泌比率来表示)。胰岛素含量(细胞裂解加上清液)和胰岛素分泌量(上清液)采用ELISA方法检测,并按照DNA含量进行标化。为了进行人类胰岛表面灌流研究,200 000个离散细胞加入到微型柱中,该微型柱为特制的表面灌流系统,包含一个入口和一个出口。细胞采用以下合成培养基灌流:3 mmol/L葡萄糖、11 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L氯化钾,每隔2 min收集胰岛素和DNA并测定。
1.6 统计分析 独立实验采用undefined来表达结果。如果单因素方差分析有统计学意义时,在多组比较中采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。统计分析采用SPSS 10.0软件进行。
2 结果
2.1 胰岛nephrin表达下降并受葡萄糖调控 为了弄清葡萄糖在糖尿病患者中是否有下调nephrin的作用,我们设计了急性和慢性葡萄糖暴露下nephrin的表达情况。我们发现,急性暴露于20 mmol/L的葡萄糖中的胰岛细胞(包括人类胰岛细胞和MIN-6细胞)上调nephrin表达,见图1A,然而慢性暴露于20 mmol/L葡萄糖中的MIN-6细胞却下调nephrin表达。人类胰岛细胞培养14 d后,不表达nephrin,见图1B。
注:A葡萄糖浓度对nephrin表达的调控
注:B 糖尿病对nephrin的表达调控
注:A:nephrin western blotting检测。1:COS7(阴性对照);2:人类足细胞;3:人类胚胎胰腺;4～6:3个不同捐赠者胰岛;7:人类肾脏;8:MIN6细胞。
注:B:nephrin和actin的RT-PCR。样本1～6是人源,7～10是鼠源。1:肾脏; 2:胚胎胰腺; 3和5:不同捐赠者胰腺; 4和6:同一捐赠者胰岛; 7:肾脏; 8:胰岛; 9:胚胎胰腺; 10:MIN- 6细胞。
2.3 Nephrin影响MIN- 6细胞中的GSIR表达 与对照组比较,nephrin过表达可以提高静态孵育实验中的胰岛素含量和胰岛素释放(GSIR)表达,见图3A、B。为了进一步确定β细胞中nephrin的功能,我们将4种siRNA转染胰岛素瘤细胞(效率为85%)。体外实验证实,Nephrin的表达与胰岛素含量和葡萄糖刺激的胰岛素释放GSIR同步降低,见图3C、D。我们也比较了对葡萄糖反应和葡萄糖不反应的MIN- 6细胞亚克隆B1和C3中nephrin的表达。MIN- 6 B1细胞表达的nephrin3倍于MIN- 6 C3细胞(P<0.05)。尽管如此,转染nephrin的C3细胞对葡萄糖的反应并不充分。我们用电子显微镜对转染nephrin的单细胞层与转染空载体(对照)细胞的囊泡进行了定量分析。Nephrin转染的细胞分泌颗粒和聚集的分泌性囊泡显著多于对照组,见图3E。过表达nephrin可提高GSIR的表达,见图3F、G。转染nephrin的细胞、转染空载体的转染细胞和未转染细胞对生长率没有差异,见图3H。
注:A nephrin过度表达增加胰岛素的总含量
注:B在孵育状态下可以增加对葡萄糖的应答
注:C si RNA对胰岛素总含量的效应
注:D孵育状态下葡萄糖的应答效应
注:E过表达nephrin可以增加分泌性囊泡数量(通过计数20个不同电子显微镜图像的囊泡数来评估)
注:F过表达nephrin可提高GSIR的表达
注:G过表达nephrin可提高GSIR的表达
注:H 转染细胞核对照组细胞生长率
2.4 nephrin影响人类胰岛GSIR的表达 为了避免使用胰岛素瘤细胞来研究nephrin对胰岛素分泌作用的局限性,我们将分离的人类胰岛细胞(来自4个不同捐赠者)转染nephrin siRNA。平均干扰效率是62%。siRNA转染的分离细胞通过苔盼蓝染色来检测细胞活力,结果提示死细胞不多(数据未显示)。与不以nephrin作为靶标的siRN比较,nephrin siRNA影响胰岛细胞表面灌流葡萄糖反应的第1时相和第2时相。对氯化钾的刺激与正常应答无异,提示细胞去极化依耐性的胰岛素出胞作用很可能不是受nephrin的直接调控。
2.5 nephrin主要聚集于胰腺β细胞的细胞膜和胰岛素囊泡中 人类胰腺切片β细胞共聚焦显微镜观察显示,颗粒细胞定位与部分胰岛素共区域,见图4。正常人胰腺切片nephrin(10 nm金颗粒)和胰岛素(5 nm金颗粒)双免疫金标记显示,nephrin在胰岛素囊泡周边表达更高更密集,见图4A。分析囊泡融合到细胞膜过程时,发现nephrin仍然在融合膜中表达更高,见图4B。我们也观察到了细胞膜中的nephrin与囊泡中的nephrin,发现他们是没有关联的,见图4C。此外,我们在极少数空囊泡(<5%)中也检测到了nephrin的表达。在培养细胞MIN- 6的nephrin免疫荧光共区域化检测中发现部分nephrin与胰岛素和VAMP2共区域化。生物素实验显示有一个优势的胞质定位(未结合)和一个有限的细胞膜定位(结合)。通过reblotting细胞膜Na/K ATPase进一步证实这种情况。
注:A放大的单个胰岛素囊泡
注:B胰岛素囊泡与细胞膜融合
注:C不含胰岛素囊泡的细胞膜
2.6 葡萄糖可以影响nephrin的入胞作用 因为nephrin 定位于细胞膜和胰岛素囊泡,同时在足细胞中发现了nephrin的入胞作用[14],我们考虑葡萄糖浓度是否可以影响nephrin的亚细胞定位。为了证实这个想法,我们采用共聚焦成像来观察GFP-nephrin转染细胞。我们将细胞与活性膜染料FM4-64共染色来观察囊泡状况,培养于2 mmol/L葡萄糖的细胞和部分在20 mmol/L葡萄糖的刺激下发生入胞的细胞,其nephrin主要定位在其细胞膜中。免疫荧光观察未转染MIN- 6细胞的亚细胞分级分离实验也证实了这种情况。暴露于0.5 mmol/L葡萄糖中的MIN-6细胞在其E-cadhesin阳性细胞膜中可以很容易检测到nephrin,但是nephrin/E-cadherin相对密度在25 mmol/L的葡萄糖培养细胞中显著下降,见图5A。相反,分析囊泡片段时(VAMP2阳性),nephrin和胰岛素阳性囊泡片段不论是在0.5 mmol/L还是在25 nmol/L葡萄糖暴露中均存在,见图5B。
注:A MIN-6细胞
注:B 囊泡片段
注:A在2 mmol/l葡萄糖中,GFP-nephrin转染的MIN6细胞表达的nephrin主要存在于细胞与细胞接触间。一旦有葡萄糖刺激,nephrin有一个时间依赖的内吞作用。
注:B 0.5μmol/l jasplakinolide稳定actin状态后,可以阻止葡萄糖诱导细胞膜和细胞质中GFP-nephrin重新定位
4 讨论
本揭示了nephrin可以调节胰腺β细胞功能并在葡萄糖诱导下可以促进胰岛素的分泌。nephrin的这个作用不同于我们以前所知道的在肾脏足细胞中的功能,在足细胞中,它可以调节肾小球裂孔隔膜的结构和功能[16];也不同于最近报道的在骨骼肌中的功能,在骨骼肌中,它可以促进肌母细胞重新转化为新生的肌管[17]。尽管nephrin在不同组织中有不同的功能,但是其共同机制是nephrin可以调控肌动蛋白细胞骨架重塑[5,8]。这种功能在胰腺β细胞、足细胞和骨骼肌细胞中十分重要。胰岛nephrin的表达在不同的实验室中有不同的阐述,这些促使我们证实在人类胰腺中nephrin的表达究竟如何[18]。本研究证实,nephrin存在于人类胰腺中,尤其在胰腺β细胞中优势表达。特别令人感兴趣的是,在β细胞中,nephrin主要表达于含有胰岛素的小囊泡表面,这提示nephrin在胰岛素的分泌过程中可以调控囊泡的的转运。Nephrin定位于细胞内囊泡表面出乎我们预料,因为在足细胞中,nephrin被认为是一种细胞膜蛋白,它主要参与同种和异种细胞之间的黏附[19]。尽管没有发现在nephrin NPHS1基因突变的患者中有内分泌功能混乱的报道,这些患者的糖耐量试验也是正常的[18]。我们依然不能排除β细胞功能与nephrin有关,因为截断的nephrin亚型在胰腺中仍然可能有功能。足细胞中nephrin可以与其他蛋白如podocin和Neph1相互作用从而促进nephrin介导的信号转导,这些蛋白在胰腺中却检测不到[20]。综合这些因素,我们推测胰腺中nephrin的功能可能与肾脏中nephrin的作用不同。
为了研究nephrin在胰腺中的功能,我们改变胰岛素瘤MIN- 6细胞和人类胰岛细胞nephrin的表达,建立起研究nephrin在GSIR和总胰岛素产量中所起功能的模型。尽管nephrin可以直接引起胰岛素转录从而增加胰岛素的含量,但是,也有可能是在胰岛素分泌时通过反馈机制从而增加胰岛素含量和囊泡形成,这种情况在电子显微镜量化nephrin转染细胞的分泌囊泡中已经发现。还有一种可能性,即nephrin参与了促进葡萄糖进入并参与代谢的过程,这种情况可以解释为什么nephrin下调没有引起显著的氯化钾响应。与MIN-6-B1亚细胞系比较,MIN-6-C3亚细胞系nephrin表达下调,但是这不是降低葡萄糖反应的原因。在本研究中,值得关注的是,在葡萄糖诱导的actin重塑过程中起着重要作用的另外一种actin调节剂gelsolin是否是在MIN-6-C3亚细胞系中表达降低所致[15]。
由于nephrin可以调节足细胞actin细胞骨架重塑和介导内吞作用,分布于细胞膜和胰岛素囊泡表面的nephrin促使我们思考,nephrin内吞是否是葡萄糖诱导的结果,nephrin的内吞是否可以促进胰岛素的释放。我们研究发现葡萄糖诱导后内吞的nephrin与我们的假说一致,即细胞膜到细胞质中的nephrin重新分布并促进胰岛素的释放,可能是细胞表层actin密度增加而致骨架网络破裂的结果,而细胞表层actin可以防止胰岛素囊泡与细胞膜融合[21]。事实上,鬼笔环肽和jasplakinolide维持的actin稳态可以防止nephrin内吞并停止增加胰岛素分泌的nephrin效应。我们应用一个可以确定致actin稳态的jasplakinolide剂量,jasplakinolide对actin聚集化的效应动力学是高度的时间和剂量依赖性的。胰岛素分泌和葡萄糖反应的相反效应也在胰岛和胰岛素瘤细胞中做了大量研究,实验进行了胰岛和胰岛素瘤细胞暴露于最高10倍于这次jasplakinolide浓度,这些结果提示,GSIR调节的actin细胞骨架具有多种功能。我们还需要进一步研究nephrin促进胰岛素分泌的确切机制。
该研究还发现与年龄相配对的非糖尿病对照组相比,糖尿病患者胰岛nephrin表达下降,这与以前在肾脏中的报道类似。胰岛中,BMI与nephrin mRNA呈负相关,此观点支持在GSIR中nephrin的作用。与该结果一致的是,延长MIN-6细胞在高浓度葡萄糖中的暴露时间可以下调nephrin的表达,而急性暴露于高浓度葡萄糖中可以上调nephrin的表达。尽管胰岛素瘤细胞在急性和慢性葡萄糖暴露体外模型的效应已经知道,但是急性和慢性葡萄糖暴露对nephrin表达的相反效应与之前在肾脏细胞中的研究一致。一个比较好的解释是nephrin允许囊泡有更大的移动性并增加胰岛素的分泌,而糖尿病患者胰腺β细胞nephrin表达下调可以影响该结果。
总之,我们的结果证实neprin是胰腺β细胞中葡萄糖诱导的胰岛素分泌的重要调节剂,同时也证实nephrin是囊泡的一个有机组成部分也是有效活性成分,可以促进胰岛素囊泡与细胞骨架actin相互作用进而促进囊泡向细胞膜移动。因此,针对导致nephrin表达增加或功能增强的环节进行干预,可以延迟2型糖尿病胰岛素治疗的需求。nephrin在足细胞囊泡出胞中的活化作用是否有利于裂孔隔膜形成一个整体也值得进一步研究。
摘要：目的 研究在人类胰岛nephrin的表达及糖尿病是否调控nephrin的表达,同时初步探索nephrin在β细胞中的功能。方法 试验分糖尿病患者(n=5)和非糖尿病患者(n=7)组。采用western blot、PCR、共聚焦显微镜、亚细胞分离和免疫金标等方法研究人类胰岛和MIN6胰岛素瘤细胞中nephrin的表达。在MIN-6细胞或人类胰岛细胞中稳定转染nephrin和以siRNA技术沉默nephrin,然后研究体外nephrin的功能。采用GFP-nephrin转染细胞活动图像来研究nephrin的胞吞作用。结果 nephrin表达于细胞膜和胰岛素小囊泡中。糖尿病患者胰岛中nephrin表达低于非糖尿病患者组。转染nephrin的MIN-6细胞/假胰岛细胞进行体外实验,在葡萄糖刺激下胰岛素分泌更多,而基因沉默组不能引起胰岛素分泌。激光共聚焦图像显示GFP-nephrin转染细胞在葡萄糖刺激下,nephrin内吞。如果稳定肌动蛋白,可以防止nephrin迁移也可以防止nephrin对胰岛素释放中的正向效应。结论 nephrin是胰岛素囊泡中的一个重要活性组分,可以影响囊泡和肌动蛋白的相互作用从而促使囊泡迁移至细胞膜。以nephrin作为靶目标可以作为治疗糖尿病的一种新策略。
胰岛分泌细胞 第8篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
于2010年1月-2011年1月云南省红河州第一人民医院内分泌科住院的2型糖尿病患者188例,符合1999年WHO糖尿病诊断标准。排除泌尿系感染、糖尿病酮症酸中毒、高血压等因素。根据尿白蛋白排泄率(UAER)分为2组:DN组(UAER≥30mg)96例,男55例,女41例;对照组(UAER<30mg)92例,男,41例,女,47例。病程5～10年。
1.2 观测方法
1.2.1 动态血糖监测
采用雷兰TA型皮下动态血糖监测系统(CGMS)进行连续3d的监测。计算平均血糖的标准差(SDBG)、平均血糖水平(MBG)、最大血糖波动幅度(LAGE)。
1.2.2 所有患者入院时测量身高、体质量、血压,计算体质量指数(BMI)。
受检者禁食12h,次晨行空腹血糖(FPG)、餐后2h血糖(2hPBG)、空腹胰岛素(FIns)、糖化血红蛋白(HbAlc)、胰岛素释放试验及C肽释放试验。血糖测定采用葡萄糖氧化酶法,胰岛素测定采用发光免疫法,HbAlc采用免疫比浊法;所有患者用免疫比浊法测量24hUAER 3次。HOMA-β模型β细胞功能指数(HOMA-β)=20FIns/(FPG-3.5),反映胰岛素分泌功能。
1.3 统计学方法
采用雷兰TA-AS分析软件对CGMS的数据进行统计分析。采用SPSS11.5软件进行数据处理。正态分布的计量资料以undefined表示,组间比较采用t检验;HOMA-β、UAER呈非正态分布的数据采用M(四分位数间距)表示。两变量相关分析采用非参数Spearman相关分析,相关分析采用多元线性逐步回归法。
2 结果
2.1 一般资料
DN组与T2DM组的HbAlc、FINS、、UAER、均明显高于T2DM组,(P<0.05或P<0.01);HOMA-β明显低于对照组(P<0.01)差异有统计学意义。年龄、病程、BMI、FBG、2hPBG、两组比较差异无统计学意义(P﹥0.05),见表1。
2.2 动态血糖监测结果分析
DN组SDBG、LAGE、MBG均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),其中以SDBG<1.4作为判断血糖波动的标准,见表1。
2.3 Spearman相关分析显示,HOMA-β与病程、SDBG、FINS、24hUAER呈正相关,相关系数分别为:
0.240、0.410、0.784 、0.231(P<0.01或P<0.05)。
2.4 DN影响因素分析
以DN为因变量,以性别、年龄、病程、BMI、FBG、2hPBG、HbAlc、FINS、HOMA-β、UAER、SDBG为自变量进行多元回归分析显示,病程、SDBG、UAER均为独立影响因素,而年龄、性别、BMI无独立影响作用,见表2。
注:与对照组比较,*P<0.05,#P <0.01。
3 讨论
异常的血糖波动及持续高血糖对机体造成损害。UAER增加是DN公认早期诊断指标之一,是肾脏疾病进展标志,UAER排泄增加受多种因素影响,高血糖是其重要因素。CGMS有许多参数可以用来评估血糖波动,SDBG计算简单,与反映血糖波动的金标准平均血糖波动幅度(MAGE)有良好相关性可作为血糖波动的简易评估参数。SDBG正常糖调节者<1.4mmol/L[1]。本文发现在控制病程、BMI、血脂、FPG、HbAlc等因素,DN组和对照组SDBG平均值分别为2.60mmol/L和2.40mmol/L,两组间比较差异有统计学意义。多元回归分析显示SDBG、UAER是DN的影响因素,提示DN与血糖波动密切相关,其发生的机制为:血糖波动可更强烈激活蛋白激酶C和增强核因子κB活性,产生氧化应激反应。间歇性高浓度葡萄糖培养可引起肾小球系膜细胞胶原合成增加[2],同时还影响小管间质细胞的生长、细胞因子的产生及胶原合成[3],加速肾小管上皮细胞凋亡[4]。RISSO等[5]研究表明间歇性高糖较恒定高血糖更易促使内皮细胞凋亡。故血糖波动在糖代谢失调的后果中起着重要的作用。
血糖波动较持续性高血糖对胰岛β细胞功能的损害更明显。本研究显示DN组SDBG高于对照组,HOMA-β降低,HOMA-β与SDBG呈正相关,回归分析显示SDBG、病程为独立影响因素,进一步证实了血糖波动与DN及胰岛分泌功能存在相关性,其原因:慢性高血糖引起β细胞凋亡,使β细胞分泌胰岛素减少,即葡萄糖毒性作用。波动性高血糖可以加重氧化应激和内质网应激,进一步加重β细胞损伤。故血糖波动可能是胰岛β细胞功能损害的最主要因素。随着糖尿病病程延长,胰岛素分泌功能的减退在DN的发生发展上起着重要作用。DN由于血糖波动,胰岛β细胞功能严重受损,胰岛素分泌减少,使血糖增高,促进微血管的损害,导致DN发生。
因此血糖的控制不仅要HbAlc达标,同时减少血糖的波动,将DN的发生风险降到最低。随着病程的进展,长期严格控制血糖,阻断“葡萄糖毒性作用”的恶性循环,保护胰岛细胞功能有着积极的意义。
摘要：目的 探讨2型糖尿病(T2DM)肾病及胰岛素分泌功能与血糖波动的关系。方法 选取住院的T2DM患者188例,根据24h尿白蛋白排泄率(24hUAER)分为糖尿病肾病(DN)组96例,单纯2型糖尿病(T2DM,对照组)92例。动态血糖监测系统(CGMS)监测2组72h血糖变化,计算平均血糖的标准差(SDBG),比较2组的血糖波动。采用HOMA-β评价β细胞分泌功能。结果 (1)DN组SDBG明显高于对照组(P<0.05或P<0.01),HOMA-β明显降低(P<0.01)。(2)HOMA-β与病程、SDBG、FINS、24hUAER呈正相关(P<0.01或P<0.05);DN影响因素回归分析显示SDBG、病程、UAER为独立影响因素。结论 血糖波动对2型糖尿病肾病发生发展有促进作用,对胰岛β细胞功能损害较持续性的高血糖更严重。
关键词：糖尿病肾病,2型,血糖波动,尿白蛋白排泄率,胰岛β细胞分泌功能
参考文献
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胰岛分泌细胞 第9篇
1 对象及方法
1.1 对象
选取我院2012年9月~2013年9月期间内分泌门诊新诊断的T2DM患者共110例为研究对象, 其中男67例, 女43例;年龄38~76岁, 平均 (53.2±3.4) 岁。110例病例均符合1999年WHO诊断标准[5], 按照Hb A1c划分为3组, A组 (6.5%
1.2 方法
所有入组对象行口服葡萄糖耐受试验 (OGTT) 及胰岛素释放试验, 取空腹及负荷后120min静脉血, 测定指标有Hb A1c、空腹血糖 (FPG) 、负荷后120min血糖 (2h PG) 、空腹C肽 (FCP) 、负荷后120min C肽 (2h CP) 、空腹胰岛素 (FIns) 、负荷后120min胰岛素 (2h Ins) 。采用稳态模型评价胰岛素抵抗 (IR) 指数 (HOMA-IR) 和胰岛细胞功能指数 (HOMA-β) 。HOMA-IR=FInsFPG/22.5;HOMA-β=FIns20/ (FPG-3.5) 。
1.3 统计学方法
采用单因素方差分析进行组间比较, 两两比较采用q检验, 计量资料以均数±标准差表示, 采用Spearman分析进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有数据采用统计软件SPSS18.0处理。
2 结果
从表1可以看出: (1) Hb A1c胰岛素分泌功能指标:FPG、2h PG随Hb A1c的升高而升高。T2DM患者与健康人相比, 2h CP、2h Ins呈现先升高后降低的趋势, 具体表现为Hb A1c10%时, 2h CP、2h Ins升高, Hb A1c>10%时, 2h CP、2h Ins降低。与健康人相比, T2DM患者HOMA-IR显著增高, 不同水平Hb A1c HOMA-IR无明显差异。 (2) 相关性分析:行多元逐步回归分析, T2DM患者Hb A1c与FPG、2h PG呈显著正相关, 与CP、2h CP、FIns、2h Ins、HOMA-β呈显著负相关, 2h PG呈现出与Hb A1c较FPG更高的相关性。
与D组比较, *P<0.05, 与A组比较△P<0.05, 与B组比较▲P<0.05
3 讨论
目前, T2DM公认的发病机制为IR或 (和) 胰岛素分泌不足[6,7]。本研究发现: (1) 初发T2DM患者Hb A1c水平与患者HOMA-β关系密切, Hb A1c与HOMA-β成反比, Hb A1c升高, 患者HOMA-β下降, 提示这些患者胰岛β细胞功能已受损。 (2) 不同水平Hb A1c的患者HOMA-IR无明显差异, 提示IR和胰岛素分泌不足是同时存在的, 二者贯穿T2DM始终。其机制[8,9]可能在于高血糖通过线粒体电子传递链、葡萄糖自氧化、多元醇通路等途径, 使体内活性氧和活性氮产生过多, 诱导氧化应激, 致使胰岛β细胞功能损伤及IR。在本研究中, 当Hb A1c10%时, 晚期时相胰岛素代偿性高分泌, 表现为2h CP、2h Ins较对照组升高, 当Hb A1c>10%时, 胰岛细胞功能加速衰退, 晚期时相胰岛素分泌失代偿, 表现为2h CP、2h Ins较对照组降低, 因此, 临床上可考虑早期胰岛素补充治疗, 以保护胰岛β细胞, 胰岛素促泌剂可加重残存胰岛β细胞负荷加速其衰竭, 不能一味使用。徐国玲等学者[3]也提出, 不同程度糖代谢紊乱的糖尿病患者治疗策略要有所偏重以实现血糖控制达标。
在我们的相关性研究中, 2h PG呈现出与Hb A1c较FPG更高的相关性, 提示2h PG对Hb A1c贡献不可低估, 潘晓洁等学者的研究[10]也发现此点, 建议定期检测2h PG和Hb A1c便于糖尿病的早期诊断和预防。因此, 我们在临床过程中, 应根据Hb A1c水平制定合理降糖方案, 同时关注餐后血糖达标情况, 设法恢复早期相胰岛素分泌, 有效合理控制血糖。
摘要：目的:比较初发2型糖尿病 (T2DM) 不同糖化血红蛋白 (HbA1c) 水平与血糖、C肽、胰岛素分泌功能等的关系。方法:选取我院2012年9月2013年9月期间内分泌门诊新诊断的T2DM患者110例, 男67例, 女43例;年龄38~76岁, 平均 (53.2±3.4) 岁。按HbA1c水平分为三组, 同时选取健康人30例 (男17例, 女13例;年龄36~73岁, 平均 (46.2±3.4) 岁) 作为对照。所有入组对象行口服葡萄糖耐受试验 (OGTT) 试验及胰岛素释放试验, 取空腹及负荷后120min静脉血, 测定HbA1c、空腹血糖 (FPG) 、负荷后120min血糖 (2hPG) 、空腹C肽 (FCP) 、负荷后120minC肽 (2hCP) 、空腹胰岛素 (FIns) 、负荷后120min胰岛素 (2hIns) 。计算HOMA-IR及HOMA-β。结果: (1) FPG、2hPG随HbA1c的升高而升高。 (2) T2DM患者与健康人相比, 2hCP、2hIns呈现先升高后降低的趋势, 具体表现为HbA1c≤10%时, 2hCP、2hIns升高, HbA1c>10%时, 2hCP、2hIns降低。 (3) 与健康人相比, T2DM患者HOMA-IR显著增高, 不同水平HbA1c、HOMA-IR无明显差异。 (4) T2DM患者HbA1c与FPG、2hPG呈显著正相关, 与CP、2hCP、FIns、2hIns、HOMA-β呈显著负相关。结论:初发T2DM患者进行OGTT试验及胰岛素释放试验, 可反映HbA1c水平与胰岛分泌功能的相关性, 可为临床用药提供参考。
关键词：2型糖尿病,糖化血红蛋白,胰岛素分泌
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