体外培养范文（精选12篇）

体外培养 第1篇

1 毛囊体外培养的主要模型

1.1 离体有毛皮片的培养

Li L等报道, 离体有毛皮片的培养是将有毛皮片置于气液界进行三维培养。结果只有14%～25%的毛囊可以生长, 生长率仅达0.170±0.036 mm/d。一般5 d即可出现由生长期向退行期的改变。缺点:由于皮片整体细胞的大量增殖对单个毛囊的培养结果进行详细分析存在一定困难。

1.2 毛囊培养

毛囊培养是一种较为简捷的器官培养模型。该方法是在真皮与皮下组织交界处切开皮肤, 在解剖显微镜下轻轻剔除皮下脂肪, 拉出完整无损的带有毛球的毛囊。该方法可在1～2 h内、4 cm2 cm大小的皮肤上分离出100根以上的生长期毛囊, 但偶尔也可见到退行期毛囊。将此毛囊置于Williams E培养基中培养, 毛发在前4 d的平均增长速度为0.3 mm/d, 这接近于体内毛发的生长速度。可用该培养模型研究毛囊的体外生长规律, 还可分析试验条件下相关因子对其生长及代谢的影响。

1.3 器官型培养

器官型培养即毛囊重建。该方法是模仿体内生理条件进行组织重建, 即在生物活性基质上或基质中接种上皮细胞, 使之向器官型发展, 将游离毛囊或培养后毛囊建于生物活性基质上或基质中, 进而重建毛囊或有毛的皮肤。这种培养模型是研究毛囊各种细胞群之间相互作用、组织发生、细胞相关因子及药物作用等方面的理想模型。

以上培养模型在毛囊研究工作中发挥了重要作用, 虽然毛囊是控制毛生长周期的皮肤附属器, 但由于多种生长因子、细胞因子、皮质激素、表皮-真皮间的相互作用等, 均可对毛囊生长周期产生促进或抑制作用。在取样后的毛囊组织内常可检测到多种生长因子及细胞因子的受体, 在毛囊培养试验中添加上述因子可延缓毛囊的生长。很多因子在毛生长中的作用机理还有待于进一步研究, 主要是因为:①体外缺乏良好的培养模型。虽然发展到了离体有毛皮片培养、毛囊培养及器官型培养等技术, 但分离和培养真正具有生发作用的毛母质细胞还是很困难的, 因而试验研究难以精确到位。②缺乏针对毛囊的特异性分子。到目前为止除了已知的几种与毛根鞘有关的中间丝相关蛋白外, 其他分子在毛囊中的真正作用并不清楚。20世纪60年代, 毛囊培养及重建均取自动物胚胎期皮肤或整片胚胎皮肤, 但这些皮肤维持毛发生长的能力随培养时间及胎龄的增加而减弱, 到培养后期未见有毛发生长, 毛囊呈现退化及死亡迹象。

2 毛囊培养条件的选择

有学者对毛囊的培养条件进行了反复研究, 较为公认的方案是:无血清培养基, 温度偏低 (31 ℃和25 ℃) 、95%空气及5%CO2。但有些学者在培养鼠毛囊、人头皮毛囊时都是在37 ℃条件下进行的。汪长寿[1]选择的培养条件是31 ℃、饱和湿度、5%CO2, 并每隔3 d换1次培养液。但每种培养液是否必须要有相应的温度才能培养相应的毛囊还有待探讨。

关于培养液的使用, 不同学者运用了不同的培养液。唐建兵等[2]研究了不同条件对人游离毛囊培养的影响, 采用了3种培养液:含血清的DMFM培养基、无血清的DMFM培养基、William E培养基并进行了对照。结果发现:用William E培养基培养的毛囊不仅生长速度快, 而且毛囊的存活时间明显比其他两组长, 并且含血清的DMFM培养基最差。在含血清的DMFM培养基和无血清的DMFM培养基中, 前3 d毛囊的生长速度无明显差异;此后在含血清的DMFM培养基中, 毛囊的生长速度明显下降, 形态学和组织学切片结果证明毛囊已经进入衰退期, 认为血清可诱导毛囊进入衰退期。唐建兵等[2]研究发现, 毛囊贴壁将不在生长。汪长寿[1]研究了不同培养基 (DMEM+血清培养基、DMEM+血清+胰岛素、Williams E无血清培养基+胰岛素) 对蒙古绵羊皮肤毛囊培养的影响。结果发现:DMEM+血清培养基的培养效果最差, DMEM+血清+胰岛素的培养效果较好, Williams E无血清培养基+胰岛素的培养效果最好, 绵羊毛囊培养时间在35 d以上, 最长时间达到60 d。这可能是Williams E培养基中含有氨基酸、维生素、微量元素等有助于毛囊生长的营养物质。

在毛囊器官培养中应注意以下几点:样本的消毒要充分;应选取外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润和光滑的生长期毛囊, 有些毛囊形态完整但生长缓慢可能存在内损伤;培养箱内应保持一定湿度;培养液应每隔3 d更换1次。

3 展望

目前, 利用干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的研究方向。毛囊干细胞的研究不仅对了解皮肤组织器官发育、肿瘤疾病发生有重要意义, 还将成为转基因和组织工程技术中重要的靶细胞。 有学者已发现, 在头发根部的毛囊中可能存在皮肤干细胞。干细胞是能发育成组织器官的“母细胞”, 位于表皮下毛囊侧部的一个凸起处, 能够向下转移至毛囊根部, 使毛发再生。这些皮肤干细胞还能够向上迁移, 到达周围的皮肤, 解剖发现人类毛囊也有类似的凸起, 认为是人类皮肤干细胞的源头。

虽然国内外的大量研究表明, 毛囊密度、S/P值等与产绒量成正相关, 而光泽度、柔软度、颜色、细度、长度和拉力强度等羊绒品质指标与毛囊的结构特征密切相关, 但关于羊毛的毛囊培养未见相关报道。研究绵羊和山羊皮肤毛囊的体外培养成活率、生长情况及从生长到退化时细胞的变化对于填补国内外空白, 揭示羊绒毛生长退化机理和自然情况下毛发脱落, 以及抗癌药物引起毛发脱落机制等都具有重要的理论价值。同时该研究还可能为进一步开发治疗脱发或促进毛发脱落等相关药物, 人为调控绵山羊绒毛生长与退化有关技术的开发、应用奠定基础。对动物育种也会产生积极影响。此外, 对提高绵羊和山羊毛、绒、皮产品的产量和质量等都具有特殊意义。

摘要：文章综述了毛囊体外培养的主要模型及体外培养所需的条件和注意事项, 以及毛囊体外培养在脱发、痤疮治疗中的应用状况, 同时还对毛囊体外培养的研究价值和前景进行了展望。

关键词：毛囊,体外培养,现状,展望

参考文献

[1]汪长寿.蒙古绵羊皮肤毛囊培养的研究[D].内蒙古:内蒙古农业大学, 2005.

体外受精与早期胚胎培养教学设计 第2篇

1.简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。

2.简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。

3.认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。

二、教学建议

1.课时数:本节教学建议用2课时。

2.课时侧重点:

(1)体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。

(2)哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。

3.教学策略

教学过程一定要根据学生的具体情况、教材的内容、教学的条件综合考虑进行。本节教材是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上,着重简述哺乳动物体外受精和胚胎早期培养的技术方法。本节内容简单,学生通过阅读基本能明白。另外,由于所讲内容技术性较强,与学生的生活相距较远,不易引起学习兴趣,所以教师可采用探究式的学习方法,以“试管牛”为例,创设出一种新的学习情景,在教师的带领下,让学生以胚胎工程学家的身份出现,亲历其境地去思考和探究“体外受精和早期胚胎培养”的过程,领悟其探究的方法,以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。对具体的教学方法建议如下。

教师课前搜集有关“试管牛”技术及其发展的资料,并制作“利用屠宰厂牛卵巢收集卵母细胞,并工厂化生产试管胚胎”的计算机辅助教学软件(或投影片)。同时,教师布置学生搜集有关“试管牛”的资料。

体外培养 第3篇

摘 要：针对中医专业八年制高层次、高素质综合医学人才的培养需要，我室在医学生物学实验的基础上，开设了现代生物学实验技术教学。在进行现代生物学实验技术教学过程中，我们就观察体外培养细胞的基本形态这一实验，在实验内容设计和实验具体操作等方法进行了改革，获得了较好的实验教学效果。

关键词：生物学实验；方法改进；中西医结合

医学生物学是中医院校的基础课程，是一门实践性很强的学科。实验教学是医学生物学教学过程中重要的组成部分，实验教学效果的好坏直接影响课堂教学的效果和学生对医学生物学的兴趣。高年制的医学生是各医学院校重点培养的高层次医学人才，因此，对他们的要求远远高于五年制学生，除了要求他们掌握全面扎实的专业知识外，还要求他们具有较高的科研素质、创新能力和实践能力，进而全面提高高年制学生的综合素质，培养学生分析问题、解决问题的能力。基于此，实验教学改革成为我们教学的重点。笔者综合分析目前我室的生物学实验教学过程，除了基本的医学生物学实验外，还开设了现代生物学实验技术课，这门实验课主要包括细胞培养、细胞传代和染色体显带等实验；在进行观察体外培养细胞的基本形态这个实验时，对该实验进行几个方面的改革，主要包括对实验教学方法、实验内容设计和实验具体操作进行改进，经调查，改革后实验教学效果较好。

一、实验教学方法改革

观察体外培养细胞的基本形态这个生物学实验的目的有两个：一是掌握倒置显微镜的使用方法；二是让学生了解细胞的基本形态结构和体外培养细胞的生长状况。这样，有助于学生理解细胞是生命有机体的基本结构单位。针对这个实验目的，我们采用多媒体教学和国内外文献教学相结合，从体外培养细胞的形态特征类型开始讲解，结合不同细胞的图片，逐步讲解。同时，结合实物演示（培养瓶中装有不同时间的培养细胞）给学生讲解体外培养细胞的生长状况和细胞培养中的污染情况，使学生对这个实验先有感官认识，然后让学生自己设计实验。

二、实验内容设计

在实验内容设计过程中，我们首先对实验室的实验条件和经费进行考虑，然后结合高年制学生的实际条件进行实验设计。我校高年制的学生在进行现代生物学实验技术学习时，已经完成了基本的医学生物学实验，如显微镜的观察、蟾蜍的解剖等基本实验，所以，在进行现代生物学实验技术时已经具备了一定的知识水平。高年制的学生分两组进行这个实验，每组为21人，结合我室的实验条件，倒置显微镜只有一台，要完成这个实验而且效果要好必须进行以下的实验设计：（1）细胞的准备：培养瓶细胞的准备和24孔板细胞的准备。（2）盖玻片的无菌准备。（3）细胞固定试剂的选择。（4）显微互动实验室进行固定细胞的观察；倒置显微镜进行培养瓶细胞的观察。（5）进行实验结果的分析、讨论。

三、具体操作步骤的改进

实验内容设计好以后，进行具体的操作步骤：（1）将21个学生分为7组，每3人1组。（2）以往实验是利用培养瓶培养细胞，但是只有一台倒置显微镜，所以改为24孔板内放置盖玻片培养细胞。（3）每组进行培养细胞前准备。首先各组进行盖玻片的无菌处理，然后将无菌的盖玻片放入24孔板内。（4）各组进行24孔板内细胞接种培养，即爬片。（5）将有细胞的盖玻片取出，各组进行固定。（6）第一组、第二组采用丙酮固定；第三组、第四组采用95%乙醇固定；第五组、第六组采用甲醛固定；第七组采用甲醇冰醋酸固定。（7）在显微互动实验室进行细胞形态的观察。（8）交叉进行倒置显微镜下观察培养瓶内的细胞。实验完成后进行实验报告的书写，内容包括实验原理、实验目的、实验设计及实验结果的讨论等。学生将固定的细胞和未固定细胞的形态观察进行讨论分析，讨论的过程较热烈，有的学生提出的问题特别有意义，这样既可以让每个学生参与实验，同时，又增强了同学提出问题、解决问题的能力。

针对观察体外培养细胞的基本形态这个实验，我们进行了以上这几个方面的改进，使学生在教学过程中的各个环节都主动参与并不断地提出新的问题。在这个过程中，学生得到锻炼的同时，教师也在教学中得到了学习，扩展了知识面。实验教学是树立学生实践观念，培养分析、解决实际问题能力， 启迪学生创新思维，提高学生综合素质的重要环节。所以，在实验教学过程中，我们要不断地进行探索和改革，这样更有利于培养学生的創新能力和科研素质。

参考文献：

[1]李健，苗绪红，李光.七年制医学生细胞生物学实验双语教学的实践与思考[J].山西医科大学学报：基础医学教育版，2007，9（4）：465-466.

[2]倪秀珍，莫金钢.普通生物学实验课程教学改革尝试[J].长春师范学院学报（自然科学版），2008，27（3）：136-137.

基金项目：北京中医药大学教育科研课题（项目编号：XJY14019）。

人脐血内皮祖细胞的体外培养 第4篇

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hv-qapue,密度1.077 g/mL,天津市灏洋生物制品有限公司);EGM-2培养基(Lonza,美国);胎牛血清(Hyclone,美国);血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)均为美国Peprotech公司产品;纤维连接蛋白(FN,Sigma,美国);兔抗人CD133单克隆抗体(Santacruz,美国);鼠抗人CD34(epitomics,美国);FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133(Becman Coulter,美国)。X-60倒置相差显微镜(Nikon,日本);AX70荧光显微镜及图像采集仪(Olympus,日本);流式细胞仪(Becman Coulter,美国)。

1.2 方法

1.2.1 脐血内皮祖细胞的分离无菌条件下取正常剖宫产胎盘

中的脐带血50 mL(均签署知情同意书并获我院伦理委员会同意)。脐血中加入肝素(20 U/mL)抗凝,室温静置30～60 min。尽量吸取上清液到含有5 mL PBS缓冲液的试管中混匀;每个10 mL管中加入淋巴细胞分离液2 mL,然后加入混匀的脐血上清液4 mL;将试管放入水平离心机,2 000 r/min离心20 min;吸取呈乳白色的第2层细胞(单核细胞层)加入到含4 mL PBS液中混匀,1 200 r/min离心10 min;弃上清液,加入3 mL PBS液,混匀沉淀,1 000 r/min离心5 min;弃上清液,加入适量的培养基(EGM-2+20%胎牛血清+50 ng/mL VEGF+20 ng/mL bFG F+20 ng/mL IGF-1)吹打混匀。

1.2.2 脐血内皮祖细胞的培养

分离的单核细胞以1×105/cm2接种于纤维连接蛋白包被的12.5 mL培养瓶中;37℃、5%CO2、饱和湿度中培养;第3天半量换液,此后每2～3 d全量换液1次。

1.2.3 血管内皮祖细胞的鉴定

(1)形态学观察:前2 d静置培养细胞,从第3天开始观察。(2)免疫细胞化学染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,采用SABC法,对细胞涂片的CD34进行免疫细胞化学染色,DAB显色,PBS液代替一抗作阴性对照,以细胞质出现棕黄色颗粒为CD34阳性细胞。(3)免疫荧光染色:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成细胞涂片,细胞经4%多聚甲醛固定,10%BSA封闭后,加入兔抗人CD133单克隆抗体(1∶100),阴性对照只加血清,37℃孵育60 min,PBS洗涤,加入FITC标记的荧光素二抗(1∶50),37℃孵育30 min,PBS洗涤,干燥,封片,荧光显微镜观察,显示绿色荧光的细胞为CD133阳性细胞。(4)流式细胞检测:用0.02%EDTA消化培养7 d细胞,制成1×106/L细胞悬液,分别加入FITC标记鼠抗人单克隆血管内皮因子受体-2(VEGFR-2)(KDR)抗体,PCY标记鼠抗人CD133抗体各20μL避光室温反应30 min,然后上机检测,分析KDR和CD133共表达情况。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

在培养第3天可见约40%贴壁细胞为梭型;第4～5天贴壁细胞出现细胞集落,周围细胞以集落为中心,呈发芽式向外生长,周围为呈放射状分布的梭形细胞(图1);8～10 d出现“铺路石样”形似鹅卵石的单层细胞(图2)。

2.2 免疫细胞化学染色

CD34免疫组化染色显示(89.67±2.05)%培养7 d细胞为阳性。

2.3 免疫荧光染色

CD133免疫荧光染色显示(67.2±2.12)%培养7 d细胞为阳性。

2.4 流式细胞检测

流式细胞分析培养7 d细胞KDR和CD133的表达率共达87.8%。

3 讨论

有研究认为血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)对内皮祖细胞有调控作用,能促进内皮祖细胞的体外生长[8,9]。这些生长因子用于培养内皮祖细胞的使用剂量和使用的种类,各个实验室各不相同,本实验采用3种生长因子进行体外内皮祖细胞的培养:VEGF使用浓度为50 ng/mL,bFGF为20 ng/mL,IGF-1为20 ng/mL。

体外分离内皮祖细胞的方法主要有免疫磁珠、流式细胞术和密度梯度离心法,前两种虽然可获得高纯度的细胞,但其回收内皮祖细胞的量少且操作复杂,费用昂贵。通过预试验我们对采取经过静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)和采用抗凝脐血与PBS缓冲液1∶1稀释后的血液分别用密度梯度离心法获得的单个核细胞通过显微镜观察比较,发现用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞中的红细胞含量远远少于用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞中的红细胞含量,且用静置脐血血浆分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养发现细胞贴壁情况比用PBS缓冲液与脐血1∶1稀释后的血液分离获得的单个核细胞进行内皮祖细胞培养的贴壁情况要好。因此,本实验采用密度梯度离心法从静置30～60 min的抗凝脐血上清液(血浆)中获得单个核细胞用于内皮祖细胞的体外培养。

内皮祖细胞的培养方法主要有:一种方法是将获得的单个核细胞接种到预先铺有纤维连接蛋白的培养板中,24 h后将未贴壁的细胞重新接种到新的铺有纤维连接蛋白的培养板中继续培养[1];另一种方法是将单个核细胞接种到培养板中,培养4 d后弃掉未贴壁的细胞,留下的贴壁细胞继续培养[10];还有一种是把单个核细胞接种到铺有Ⅰ型胶原的培养板中,然后弃掉未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养[11]。纤维连接蛋白可促进细胞的黏附,并且与VEGF协同可提高内皮祖细胞的迁移和分化[12],因此本实验采用的内皮祖细胞培养方法是将获得的单个核细胞接种到铺有纤维连接蛋白的培养瓶中,静置培养3 d后弃去未贴壁的细胞,贴壁细胞继续培养。

内皮祖细胞的的鉴定观点不一。有人把表达CD34和KDR的认为EPCs[1];有些学者认为CD34、CD133、KDR是EPCs特征性标志[13];也有学者把EPCs分为两类,早期EPCs(CD34+、CD133+、KDR+),晚期EPCs(CD34+、CD133-、KDR+)[14,15,16]。

体外培养 第5篇

昆明白小鼠胚胎干细胞分离与体外培养

为探索昆明白小鼠胚胎干细胞建系方法,将受孕4.5天的`昆明白小鼠囊胚用免疫手术法去除滋胚层,然后将内细胞团(ICM)接种于胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,形成的胚胎干细胞样集落用胰蛋白酶-EDTA消化法传代,培养后进行相差显微镜观察及碱性磷酸酶染色.结果饲养层上生长的ICM细胞呈典型的ES样细胞集落,传至第8代碱性磷酸酶染色呈强阳性.实验表明免疫手术法适用于昆明白小鼠ES细胞建系,获得的细胞集落具有ES细胞的主要生物学性状.

作 者：李煜 梁琳 王振飞 贾瑞贞 戴宝贞 李瑶 Yu Li Lin Liang Zhen-Fei Wang Rui-Zhen Jia Bao-Zhen Dai Yao Li  作者单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特,010021 刊 名：细胞生物学杂志  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELL BIOLOGY 年，卷(期)： 29(6) 分类号：Q2 关键词：小鼠   胚胎干细胞   免疫手术   内细胞团  

“体外碎石”纵横谈 第6篇

创新成果

周教授介绍说：结石症是严重危害人类健康的疾病之一；据资料统计，我国目前尿石症的发病率为1％左右，尽管有地区差别，如南方诸省略高，北方各地稍低，但总的说来是常见病、多发病，且呈上升趋势；而胆石症的发病率则明显高于尿石症，达2～5％。以前，临床上对付结石症的办法主要是手术摘除。由于手术终究是一种侵入性措施，损伤大，并发症多，恢复慢，还有一定的危险性，故往往不易被病人接受。就在几年前，因为害怕手术，或不能耐受手术而延误治疗、失去康复机会的还不乏其例。为了解决这一难题，为了寻找一种既安全又有效的非手术疗法，全世界的医学工作者都在孜孜地探索……本世纪五十年代，苏联科学家运用电火花原理进行了体外震波碎石试验，取得初步成功，显示了强大的生命力。到了七十年代末，随着科学的发展，这一技术逐步走向成熟，1980年，世界上第一台体外震波碎石机在联邦德国诞生，并运用于临床，从而使结石症的外科治疗有了突破性进展，成为八十年代医学界的一项创新成果。周教授告诉我，目前，采用压电晶体原理的第二代体外震波碎石机已经问世，它的性能优于电火花型碎石机，碎石时，结石呈粉末样剥脱，故有利于碎结石排出体外，大大减少了阻塞及绞痛等并发症。记者了解到，南京鼓楼医院运用的便是第二代碎石机，系法国引进。自1987年12月至今，已成功地治疗了尿石症和胆石症病人合计2774例。

发展迅速

问及我国体外震波碎石工作的现状，周教授说，1982年，联邦德国专家首次报道了体外震波碎石机粉碎肾结石的情况，引起各国学者的广泛重视，从此，这一技术迅速推广，临床疗效日益显著；1985年以后，我国科技人员自力更生，相继研制出类似机器，因此，近年来尤其是1989年，碎石技术发展很快，据初步统计，我国已有300台碎石机投入临床使用，仅江苏省就有20台之多。全国治疗病人已达50000例以上。据周教授介绍，国内开展碎石技术较早、治疗病例较多的地区是上海、北京、广州和南京。

任何事物都有两面性，碎石新技术的推广也不例外。周教授指出，体外震波碎石并非绝对安全，如果适应证掌握不好或操作不当也会出现一些严重的合并症，甚至可以导致死亡，因此，碎石工作要在有相当条件的医院进行，并采取多种方法配合之，以争取最佳效果，盲目地开展此项新技术是不妥当，也是有危险的。

掌握适应证

碎石的适应证是读者最关心的问题之一。周教授说，总的来看，适应证是越来越宽，尤其对于尿石症患者。目前已包括：(1)肾和输尿管内单个或多个结石；(2)部分性或完全性的鹿角形结石；(3)感染性结石；(4)孤立肾中的结石；(5)危重病人；(6)儿童患者；(7)X线可透过的结石等。对患有严重内科疾病，如心血管疾病、呼吸系统疾病(肺功能差)、糖尿病等合并有上尿路结石而不能耐受手术的患者以及儿童患者，体外震波碎石确是一种既安全又有效的治疗方法。周教授称，若能较好地结合运用内腔泌尿外科技术，则可使尿石症患者的开放性手术减少至1％以下。周教授接着说，胆石症的碎石效果是肯定的，但它的适应证范围要窄得多，可以碎石的大约只占20％，原因是，不少胆石症患者的删囊已丧失收缩功能或已被结石充满，因此，被击碎的结石片根本无法排出。现在，有人拟采用删囊造口的方法来解决这一难题，尚处试验阶段。

周教授还谈到了禁忌症，他说，没有经过治疗或者无法治愈的出血性疾病患者，以及严重的心律失常、失代偿的心力衰竭患者，胆石症。伴胰腺炎的患者不宜接受碎石治疗；上尿路解剖异常的患者、妊娠妇女属禁忌对象；此外，过度肥胖者、儿童患者可使结石定位遇到困难。但该院已治愈3岁以下儿童5例。

从临床资料看，南京鼓楼医院的碎石工作是比较成功的：尿石症碎石率99％，3天内排尽率35％以上，3个月排尽率88％左右；胆石症碎石率99％，3个月排尽率30％，6个月排尽率60％以上。

治疗无痛苦

真是百闻不如一见。在体外震波碎石治疗室里，记者亲眼见到一位被尿路结石折磨了近2年的小伙子，仅仅接受治疗18分钟便驱走了病魔。经x线查实后，病人轻松地离开了治疗床。我上前查看他背部的皮肤：完好无损；问及治疗时的感觉，答曰：稍稍感到有点酸，有点胀；说完，便更衣步回病房。周教授说，压电晶体型碎石机的脉冲很窄，故可减少对组织的冲击创伤反应，一般情况下，病人没有痛苦。而电火花型碎石机，虽然单个震波引起的疼痛可以耐受，但连续震波引起的疼痛却不能耐受，因此需要辅以镇痛和麻醉。周教授指出，不论为何种机型，术前都应给予适量的镇静剂。

周教授告诉我，体外震波碎石对肾脏、肝脏等实质性脏器几无损害和不良影响，但若操作不当，则可对空腔性脏器，如胃、肺脏等形成损伤，有资料表明，碎石后出现消化道出血的占17％左右；此外，排出道梗阻，肾周血肿、急性肾衰、心律紊乱、尿蛋白增加等亦偶有发生，当引起警惕和重视。

周教授又说，在决定作体外震波碎石治疗前，必须先行明确诊断，特别要了解清楚结石排出道情况。治疗前1～2天内应少吃粗糙食物，同时还要服用缓泻剂，使肠道内的粪便和气体得以清除，以便治疗时的精确定位。治疗过程中，病人不要过度呼吸，要保持稳定的情绪；碎石以后，宜多活动，多饮水，或每天经静脉输液2000～3000毫升，其目的是促进结石的碎片尽快排出体外。治疗后3天常规进行X线照片或B超检查，观察结石粉碎和排出情况，而后每周随访一次，一般需达3个月。

前景灿烂

听说，接受一次体外震波碎石治疗需千元以上。对此，周教授说，这样的收费主要是基于机器的成本较高，尤其是进口机器的价格十分昂贵，需要国家的大量外汇。不过，周教授认为；如果将新、旧疗法进行一番比较，全面地衡量一下两种疗法对患者生理、心理诸方面的近，远期影响，应当说还是值得的。当然，目前的收费确实高了些。据周教授介绍，我国体外震波碎石的一次碎石率远高于国外同行，2厘米以下结石，平均只需1.3次即可解决问题，2厘米以上结石，才需多次治疗。

人表皮干细胞的体外培养与鉴定 第7篇

1 材料和方法

1.1 主要试剂

小鼠抗人角蛋白19(Cytokeratin,CK19)、CK10、二步法免疫组织化学检测试剂盒(均为福州迈新),小鼠抗人β1整合素(武汉博士德),中性蛋白水解酶(美国Gibco公司),胰蛋白酶(Sigma),DMEM培养基、低糖DMEM/F12培养基(均为Gibco),胎牛血清(Hyclone),人胶原Ⅳ(Sigma),表皮生长因子(EGF,Promega)。

1.2 中性蛋白水解酶的配制

中性蛋白水解酶25 mg,用D-Hanks溶解定容至100 m L,过滤除菌,4℃保存备用。

1.3 Ⅳ型胶原包被

Ⅳ型胶原溶于0.1%的醋酸溶液至终浓度为100 mg/L,滤过除菌,4℃保存备用。用配制好的Ⅳ型胶原溶液2 m L平铺于培养瓶中,取30μL涂满6孔板,置4℃冰箱过夜,弃上清液,然后以0.01 mol/L PBS漂洗3次,洗去未贴壁的胶原,4℃干燥箱烘干,紫外线照射2 h消毒,得到预铺IV型胶原的培养瓶和6孔培养板。

1.4 表皮干细胞的分离与培养

整形手术的正常人头皮、包皮的皮片来自本院2～40岁行整形手术的患者(均无感染等相关疾病),所取皮片均得到患者知情同意。取手术刚切下的新鲜的标本,用含有青霉素、链霉素PBS液冲洗8～10次,无菌条件下剔除皮下组织。将标本剪成0.5 cm0.5 cm的皮片,中性蛋白水解酶4℃消化14～16 h,吸弃上清液,分离表皮和真皮层。剪碎表皮,0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min,加入含有10%小牛血清的DMEM终止消化,吹打,200目筛网研磨滤过。滤液经离心(1 000 r/min)5 min后收集细胞。弃上清液,加入皮表皮干细胞培养基并轻柔吹打制成单细胞悬液,接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶及6孔板内作为实验组,37℃孵育15 min。倒置显微镜下观察,实验组黏附在Ⅳ型胶原包被板上的细胞则主要为表皮干细胞,吸出未黏附细胞悬液,直接接种于未铺IV型胶原的培养瓶内,作为对照组;实验组加入皮表皮干细胞培养基,两组均置于37℃、5%二氧化碳孵箱培养。次日,吸出培养液,PBS冲洗1次,加入皮表皮干细胞培养基,置于37℃、5%二氧化碳孵箱中继续培养。每2天换液1次,光镜下观察细胞生长情况。

1.5 表皮干细胞的传代

当细胞接近70%～80%融合时,用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞,按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预先铺的6孔培养板或培养瓶中。

1.6 细胞鉴定

1.6.1 细胞克隆形成率测定

取第2代表皮干细胞(实验组)及对照组细胞,制备单细胞悬液,按200个/孔的密度接种至IV型胶原包被的培养板中,行平板克隆形成实验。培养2周后,计数克隆数并计算克隆形成率,观察克隆维持时间。其公式为克隆形成率=细胞克隆数/接种细胞数100%。以对照组细胞作对照。

1.6.2 细胞表面标志物的鉴定

运用免疫组织化学染色法检测,取第2代表皮干细胞爬片,4%多聚甲醛室温下固定10 min,采用两步法进行免疫组织化学染色。以对照组细胞作为对照。具体步骤:滴加3%H2O2,37℃孵育10 min,以消除内源性过氧化物酶活性。用非免疫性动物血清封闭后分别滴加一抗(K19、β1整合素、CK10);同时设空白对照,以PBS代替一抗,4℃过夜。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃孵育20 min(以上各步骤间均以PBS充分振洗),DAB显色。

1.6.3 统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS10.0统计软件行t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 养细胞的生长状况

分离的细胞贴壁后于显微镜下观察,细胞分散较均匀,圆形,细胞体积较小,细胞折光性较强(图1);孵育3 d后,实验组个别细胞形成较小克隆,贴壁牢固(图2);培养第8天,细胞连接成片,细胞间紧密相靠、互相衔接,呈铺路石状;继续培养至第13天形成圆形、椭圆形或不规则形大克隆,大部分融合(图3)。

2.2 表皮干细胞的克隆形成率

表皮干细胞与对照组细胞相比,增殖速度相对较慢。原代表皮干细胞融合时间约13～18 d,同代对照组细胞在7～9 d即可融合。

2.3 免疫细胞化学染色结果

β1整合素、K19免疫细胞化学染色显示实验组培养细胞的胞浆内出现棕黄色的阳性表达(图4、5),CK10免疫细胞化学染色显示为阴性;对照组β1整合素、K19免疫细胞化学染色细胞的胞浆内未出现棕黄色,而CK10免疫细胞化学染色显示胞浆内出现棕黄色(图6)。

3 讨论

皮肤作为人体最大的器官,外层的表皮终身不断自我更新。这种更新由表皮基底层具有再生能力的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质形成细胞主要包括表皮干细胞、短暂扩增细胞及终末分化细胞。其中,位于基底部的表皮干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞。不仅如此,表皮干细胞还积极参与皮肤损伤后的修复,是皮肤发生、修复和重塑的关键性细胞[2,3]。表皮干细胞具有慢周期性,体外培养时有较高的克隆形成率,自我更新能力强,与皮肤基底膜黏附紧密等特点。表皮组织间质较少,用消化作用较强的胰酶来消化分离细胞,对细胞的损伤较大。本研究采用两步酶消化法,即中性蛋白水解酶4℃消化过夜(14～16 h),再用胰酶37℃消化表皮15 min,中性蛋白水解酶消化作用温和,主要破坏真皮与表皮间的连接,对细胞损伤作用较小,采用浓度较小的胰酶短时间来消化表皮获得基底层细胞,细胞活性较好。

目前,表皮干细胞的分选有两种方法,利用公认的细胞表面标志物制备单克隆抗体,应用流式细胞仪或免疫磁珠进行筛选[4];另一种方法为利用表皮干细胞对Ⅳ型胶原的快速黏附能力进行筛选。前者分选的精度较高,阳性细胞率高,但分选后细胞活性会受影响,且实验成本较高;后者分选的精度较低,但细胞生长良好,方法简单易行。许多学者[5,6,7]报道表皮干细胞在Ⅳ型胶原上生长良好,利用其他基底层细胞黏附慢的特性可将表皮干细胞初步分离并进行培养。本试验即选用细胞外基质成分Ⅳ型胶原分选表皮干细胞,观察到表皮细胞接种15 min后,实验组细胞贴壁较为分散,数目较多。孵育3 d后,实验组个别细胞形成较小克隆,贴壁牢固,换液后细胞脱落不明显。表皮干细胞这种对Ⅳ型胶原依赖性,可以较好地解释细胞外基质成分对细胞的黏附、生长、移行等方面起着重要作用。

鉴定表皮干细胞的关键是要找到特异的细胞表面标志物。迄今为止,还未发现表皮干细胞的特异性的标记物。表皮干细胞的主要标记物K19被发现表达于毛囊隆突区和表皮的基底层[6,8],该部位都是公认的表皮干细胞分布区域;且具有干细胞的慢周期性和强大的增殖特性。而终末分化细胞则表达K10。所以K19被认为是表皮干细胞的表面标志[6,8],COTSARELIS[9]认为CD34可能是毛囊隆突区干细胞最好的标记物。表皮细胞能够表达多种黏附分子,介导着细胞与细胞外基质的结合,同时也调控着细胞的分化程度。β1整合素不仅介导表皮干细胞与细胞外基质的黏附,也调控终末分化启动。β1整合素表达的降低会刺激角质干细胞离开干细胞池,向上迁移成为终末分化细胞,因而认为β1整合素高表达可以是表皮干细胞的标志物之一[5,10]。

本实验中采用快速贴壁的方法从表皮细胞中分离表皮干细胞,富集后继续培养,再通过免疫组织化学研究,结果显示培养细胞β1整合素、K19呈阳性表达,K10呈阴性,克隆形成率高。同时也验证了β1整合素、K19呈阳性表达对于表皮干细胞快速鉴定具有重要意义。

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山羊体外受精胚胎序贯培养的研究 第8篇

近年来,序贯培养的方法有取代共同培养的趋势。序贯培养即是根据胚胎不同发育阶段的营养需求对胚胎进行分阶段培养。由于序贯培养满足了胚胎的生理需求和营养物质的供应,因此序贯培养的胚胎更有活力,种植的潜能更高。文献报道将表皮生长因子(EGF)等细胞因子及BSA、FCS等血清成分用于牛、猪、小鼠等物种的IVEP体系中取得了显著的成效。本研究通过在基础培养体系中添加不同的胚胎发育影响因子以比较其对胚胎发育的影响,探讨建立适于山羊体外受精胚胎发育的序贯培养方法,以提高山羊IVEP的桑葚胚及囊胚生产效率,为山羊体外受精胚胎的工厂化及商品化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与材料:

实验用山羊卵巢采自屠宰场;实验用公羊和移植用母羊均为2～3岁、健康、有正常繁殖能力的南疆黄羊,其中母羊作为受体前用左炔诺孕酮阴道栓进行同期化处理。

1.1.2 试剂

M199、E2、FSH、LH、IA 23187、EGF、BSA、HTAU及丙酮酸钠均购于美国Sigma公司;左炔诺孕酮购于南京动物激素厂;846麻醉剂购于解放军农牧大学;山羊卵泡液(GFF)、发情山羊血清(EGS)自制;其他常规普通试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

体视显微镜(日本Nikon SMZ45);CO2培养箱(德国HERAEUS B5060);DF-200A型电子分析天平(常熟市衡器厂DF200A)。

1.1.4 培养基

卵母细胞成熟培养液为M199培养液+1μg/ml E2+10 μg/ml FSH+10μg/ml LH+20%EGS+20ng/ml EGF+10%GFF;精子获能液为自制改进DM液(mDM,参见文献[2])加0.2μmol/L IA 23187;受精液为mDM液加10%EGS;胚胎发育培养体系:以自制改良的合成输卵管液(mSOF,参见文献[3])与卵丘细胞单层饲养层(CC)为基础培养体系(BCS,作为对照组)分别添加牛血清白蛋白(BSA)、EGS及表皮生长因子(EGF)、亚硫磺酸钠(HTAU)和β-巯基乙醇(β-Me)等胚胎发育影响因子。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞采集、体外成熟培养及丘细胞单层饲养层的制备

屠宰场采集山羊卵巢后放入含双抗的灭菌生理盐水(20℃～25℃)中,在实验室用37℃含双抗灭菌生理盐水洗3次,用注射器吸取卵巢表面直径为2～6mm的卵泡卵母细胞,将吸取的卵泡液倒入平皿内,显微镜下选择A、B级卵丘卵母细胞复合体(COCS)在卵母细胞成熟培养液中于38.5℃、5% CO2、饱和湿度下体外培养24～27h后,观察并选择成熟卵母细胞进行体外受精。取卵母细胞成熟培养后贴附于培养皿底壁的卵丘细胞,继续培养2～3d,形成卵丘细胞单层备用。

1.2.2 山羊精子获能及体外受精(IVF)

采集公羊鲜精液,用不含葡萄糖的mDM液1500r/min5min离心洗涤3次,上游法收集高活力精子于获能液中38.5℃作用5～8min进行获能处理,获能精子经离心去除IA 23187,调整精子浓度至2～4106/ml,等量加入预平衡1～3h的50μl mDM受精液,再加入培养成熟的20～25枚卵母细胞,共同作用16～20h。

1.2.3 受精卵体外培养(IVC)及其移植

精卵共培养后移入添加不同胚胎发育影响因子的BCS(作为对照组,n=3)中进行以下培养实验,显微镜观察并统计各阶段早期胚胎发育情况。实验1,BCS中添加6mg/ml BSA(培养体系记为CS1,n=4)或10%EGS(记为CS2,n=3),比较发育培养体系中血清成分对体外受精胚胎的培养效果;实验2,在实验1的基础上选择卵裂率较高的血清培养体系(作为对照组)添加50ng/ml EGF(记为CS3,n=4)、5mmol/L HTAU(记为CS4,n=4)或20.0μmol/L β-Me(记为CS5,n=3),比较各细胞因子对山羊体外受精胚胎的培养效果。实验3,针对以上实验结果在BCS中加入适于各阶段早期胚胎发育的血清及细胞因子进行分阶段序贯培养(记为CS6,n=6),比较分阶段培养与其他相应组间的培养效果。每隔12h观察统计卵裂及受精卵发育情况,对序贯培养后发育良好的桑葚胚手术移植给同期发情受体母羊,待其产仔。

1.2.4 统计方法

用SPSS软件for Windows (11.0)软件中One-way Anova对实验结果进行统计分析,并用LSD方法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 血清成分对山羊体外受精胚胎体外培养的结果(见表1)

统计结果显示,含BSA培养系统的卵裂率明显高于对照组(P<0.05)和含EGS的培养系统(P>0.05),但含EGS培养系统可获得更高的≥8-cell胚胎率(与对照组及BSA组相比,P<0.05)及桑胚率(与对照组比较,P<0.05;与BSA组相比,P>0.05)。提示受精后胚胎体外发育培养体系宜选用BSA作为血清成分,而从4～8-cell胚胎期时宜选用EGS作为体外发育培养体系中的血清成分。

注:同列肩注字母a与b间表示差异显著(P<0.05)。

考虑需要更多的卵裂胚用于后期实验,选用BSA作为血清成分进行下一步实验。

2.2 发育影响因子对山羊体外受精胚胎体外培养的结果(见表2)

统计结果显示,含EGF培养体系的卵裂率显著高于其它各组(P<0.05);含EGF、HTAU和β-Me组的≥8-细胞率均显著高于对照组(EGF、HTAU和β-Me与对照组间,P<0.01;各实验组间,P>0.05),桑葚胚发育率均高于对照组(其中β-Me与对照组间,P<0.05;其他各组间,P>0.05)。提示宜在受精后胚胎体外发育培养体系中加入EGF以促进更多的受精卵卵裂,但在8-cell前期胚胎的体外发育培养体系中则宜添加EGF、HTAU或(和)β-Me以促进8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率。

注:同列肩注字母不同者表示差异显著,其中a与b间表示差异显著(P<0.05),a与c间表示差异极显著(P<0.01)。

2.3 分阶段培养对山羊体外受精胚胎体外培养的结果

根据以上结果,受精后卵子在BCS添加BSA和EGF中培养72h后再移入BCS添加EGS、EGF、HTAU和β-Me中继续培养至第7d,培养结果见表3。

注:同列肩注字母a与b间表示差异极显著(P<0.01)。

统计结果显示:分阶段培养组的卵裂率、≥8-细胞率和桑葚胚发育率均高于其它各组(其中,卵裂率与两对照组、EGS组、HTAU组和β-Me组间差异极显著,P<0.01;与EGF组间差异不显著,P>0.05。≥8-细胞发育率与两对照组间差异极显著,P<0.01;与EGF组间差异显著,P<0.05;与其他各组间差异不显著,P>0.05。桑葚胚发育率与EGS组间差异显著,P<0.05;与其他各组间差异极显著,P<0.01)。提示适于各阶段胚胎发育的影响因子间具有一定的协同作用,宜对山羊体外受精卵进行分阶段培养,其中在卵子受精后胚胎发育培养体系中加入BSA和EGF以获得更多的卵裂受精卵,而在受精卵发育至4～8-细胞期胚胎时,体外发育培养体系中添加EGS、EGF、HTAU和β-Me可增强胚胎克服发育阻滞的能力以获得培养效果最佳的桑葚胚发育率。

2.4 体外受精胚的移植结果

对序贯培养的18枚体外受精桑葚胚手术移植给6只同期发情受体母羊的黄体侧子宫,结果2只母羊妊娠,产出2只“试管"羔羊,产羔率为11.1%,表明序贯培养法获得的胚胎具有正常的发育潜能。

3 讨论

3.1 合适的IVC系统是早期胚胎正常发育的前提

选择合适的胚胎体外培养系统是优化山羊胚胎体外生产技术体系的重要环节之一。体外研究证明,胚胎在致密化以前,其能量来源主要为丙酮酸和谷氨酰胺,不能利用葡萄糖,而且葡萄糖对小鼠和牛胚胎的早期发育有抑制作用。因此,本实验是利用mSOF+6mg/mL BSA+CC(卵丘细胞单层,cumulus cell monolayer)作为胚胎发育基础培养系统,将SOF中的葡萄糖去出,加入谷氨酰胺、丙酮酸、必需氨基酸和非必需氨基酸,既保证胚胎能量供应,又解除葡萄糖的抑制作用,使山羊受精卵的卵裂率和8-cell前的胚胎发育率得到了保证。

Lee Y L等研究发现,共培养细胞通过旁分泌产生促进胚胎发育的活性物质,同时消化吸收胚胎排除的代谢产物,维持培养环境的稳定性,增强胚胎基因表达[4]。目前,已从卵丘细胞和输卵管上皮细胞培养液中分出14种蛋白分子,且一般认为,卵丘细胞与输卵管上皮细胞均可作为共培养细胞对动物早期胚胎进行体外培养。本实验结果表明,以山羊卵母细胞成熟培养后形成的卵丘细胞为共培养细胞能有效保证胚胎体外发育。但也有研究表明,输卵管上皮细胞比颗粒细胞更有利于提高山羊体外受精胚胎的发育进程[5]。

3.2 培养系统中血清成分对山羊胚胎体外发育的影响

胚胎发育阻断与胚胎基因组转录都与胚胎内蛋白质合成缺失有关。合子基因组转录前,胚胎发育主要依赖于母源性物质的支持和调控,此时用简单培养基添加BSA完全能满足发育阻断期前早期胚胎的发育需要。本试验结果表明,8-细胞前早期胚胎的培养用简单培养基与细胞共培养体系添加BSA可较好地促进受精胚胎的卵裂,但对8-细胞后胚胎克服发育阻断无显著促进作用。

同种动物的发情血清多半是由实验室自己制备,所以不同的报道结果有较大差异, 这可能是由于同种动物发情血清的效果常因采集个体及采集时间不同所致。同种发情动物的血清成分复杂,其对胚胎的影响是多元化和不稳定的。本实验结果显示,在细胞共培养系统中使用自制EGS尽管对受精胚胎没有显著的促卵裂作用,但可有效支持8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率。一般认为,血清有利于增加体外培养胚胎的卵裂球数目而提高桑葚胚和囊胚的发育率及其质量。

3.3 培养系统中细胞分裂因子对山羊胚胎体外发育的影响

胚胎着床前,母体和胚胎可产生EGF,EGF通过自分泌和旁分泌的形式调节早期胚胎的发育。本实验结果表明,在培养体系中添加适量的EGF可显著促进山羊受精卵的卵裂及8-细胞胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率。有人认为,8-细胞以后发育阶段的小鼠胚胎细胞上存在有较高的EGF受体,使加有EGF培养基培养的胚胎能获得更高的囊胚孵化率及派移植后着床率[6]。一般认为,培养液中加入细胞生长因子,可使培养胚胎在细胞数量、卵裂速度、各种生化指标和胚胎移植存活率等方面显著提高。

由于胚胎在体外培养时自身代谢产生过剩的氧自由基(ROS)对胚胎的发育有阻滞或延迟作用,而在自然怀孕情况下,动物生殖道内存在的牛磺酸、次牛磺酸以及维生素C等非酶性物质对胚胎发挥抗氧化效应,因此在胚胎的体外培养液中添加一定量的抗氧化物可促进胚胎的发育。作者前期研究表明,HTAU在克服昆明白小鼠的2-细胞阻滞中起重要作用[7]。袁水桥等研究认为,体外发育培养液中添加HTAU可显著提高牛体外受精后早期胚胎的桑椹胚率和囊胚率,并且在4～8细胞期添加最为合适[8],与本实验结果相似。从本实验可以看出,卵裂后IVF山羊胚胎在培养体系中添加HTAU可有效支持8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率,这可能与卵裂后胚胎自身日趋旺盛的新陈代谢开始产生较多的ROS有关。

有关β-Me对胚胎发育影响的研究报道不多。有研究显示,β-Me是一种强还原剂,能使培养基中的含硫化合物还原成谷胱甘肽,防止氧化物对培养细胞的损害,因此对胚胎干细胞(ES)的分裂增殖有促进作用,还可促进DNA合成及细胞增殖和贴壁的作用[9]。有研究者在牛基础培养液中,添加50μmol/L β-Me可显著提高牛IVF后胚胎的桑椹胚、囊胚率及囊胚内细胞团数,并且以受精卵发育至4～8-细胞时期的添加效果为最佳[10]。本实验结果也表明,在山羊体外早期胚胎的培养体系中添加20μmol/L β-Me对卵裂没有明显的影响,但可有效支持8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率。

根据不同代谢特点实行分阶段培养已成为目前早期胚胎研究的热点之一。本研究结果表明,对山羊胚胎进行体外培养时,在共培养系统中添加BSA和EGF中培养72h后再移入共培养体系添加EGS、EGF、HTAU和β-Me中继续培养至第7d的卵裂率、≥8-细胞率和桑葚胚率均明显高于其它各对照组和实验组,且序贯培养的胚胎经移植后获得了正常的“试管”羔羊。

以上结果表明,宜根据胚胎不同发育阶段的需求设计胚胎培养体系中营养物质的组成而对山羊体外受精卵进行分阶段培养,其中在受精后胚胎培养体系中宜加入BSA和EGF以获得更多的卵裂受精卵,而在受精卵发育至4～8-细胞期时,体外发育培养体系中宜添加EGS、EGF、HTAU和β-Me以有效克服8-细胞期胚胎发育阻滞而提高桑葚胚发育率。

摘要：目的:根据早期胚胎不同发育阶段的营养需求设计体外培养体系,以建立适于山羊早期胚胎体外发育的序贯培养方法。方法:对屠宰场来源山羊卵巢卵母细胞进行体外成熟和体外受精后移入添加不同胚胎发育影响因子的培养体系中进行体外培养,显微镜观察、统计各阶段胚胎发育情况,并对培养的胚胎进行移植。结果:BSA和EGF对山羊体外受精卵具有明显促卵裂作用,培养系统中添加EGS、EGF、HTAU或β-Me可有效支持8-细胞期山羊胚胎克服发育阻滞而提高桑葚胚发育率;在不同胚胎期添加各发育影响因子进行序贯培养的卵裂率、≥8-细胞率和桑葚胚发育率分别为45.2%、60.6%和23.4%,序贯培养的胚胎移植后产羔率为11.1%。结论:宜根据早期胚胎各时期代谢特点和营养需求对山羊胚胎进行序贯培养。

关键词：体外受精,序贯培养,山羊

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体外培养 第9篇

试验以CRIaa为培养液, 分别添加犊牛血清 (FBS) 和BSA, 比较培养效果并探讨2种培养液的组合效应, 旨在为延边黄牛胚胎的IVP确立一种高效稳定的培养体系。

1 材料

延边黄牛卵巢, 取自吉林省龙井市屠宰厂;冻存精子, 取自吉林省延边朝鲜族自治州畜牧站。

2 方法

2.1 卵巢的采集与保存

屠宰剖腹后无菌采集延边黄牛卵巢, 保存在37 ℃的无菌生理盐水中, 2 h内运到实验室。

2.2 卵母细胞及卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) 的收集

将采集的卵巢用灭菌生理盐水清洗3次, 除尽周围的脂肪和系膜, 用灭菌吸纸吸干后, 根据其质量分为A类、B类。A类:颜色鲜艳, 卵泡明显且大小均匀, 质地柔软。B类:卵巢表面有大黄体或大卵泡, 颜色暗红, 血体化, 脂肪化, 质地较硬。用带有18号针头的无菌注射器分别抽取卵巢表面直径为3～6 mm的卵泡, 放入5 mL的离心管中, 在水浴中静止沉淀5 min, 体视显微镜下捡卵。

2.3 卵母细胞体外成熟培养

将选取的卵母细胞用体外成熟培养液[TCM-199+10%FBS+10 μg/mL卵泡刺激素 (FSH) + 1 μg/mL 雌二醇 (E2) ]冲洗3次, 移入已预培养2 h以上的成熟培养液 (100 μL/滴) 中。每个液滴中放20～30枚卵母细胞。培养条件为95%空气、5%CO2、39 ℃及饱和湿度, 培养24 h。

2.4 卵母细胞成熟判定

主要通过观察卵母细胞形态, 成熟卵母细胞胞质均匀, 周围卵丘细胞呈放射状扩散;显微镜下, 以是否存在第一极体来判定卵母细胞是否成熟。

2.5 体外受精

取延边黄牛冻精细管 (解冻后活率达0.35以上) , 37 ℃解冻, 用精子洗涤液离心洗涤, 放入CO2培养箱中孵育15～30 min, 调整精子密度至5107/mL, 备用。用受精液将体外成熟培养后的卵母细胞洗3次, 移入已平衡2 h的50 μL受精液滴中, 每个液滴中放置20～30枚卵母细胞, 加入50 μL已备好的获能精子液, 置于CO2培养箱中, 精卵共培养24 h, 与IVM培养条件相同。

2.6 胚胎的体外培养

将受精的卵母细胞随机分为3组, Ⅰ组采用含0.3%BSA的IVC-Ⅰ培养液, 于IVF后第2, 3, 6, 7天统计卵裂率、8-细胞发育率、桑葚胚和囊胚发育率;Ⅱ组用0.3%FBS的IVC-Ⅱ培养液, 同样于IVF后第2, 3, 6, 7天统计卵裂率、8-细胞发育率、桑葚胚和囊胚发育率;Ⅲ组采用IVC-Ⅰ培养液+IVC-Ⅱ培养液, 将受精卵在IVC-Ⅰ培养液中培养48 h后, 再移入IVC-Ⅱ培养液中继续培养, 于IVF后第3, 6, 7天统计卵裂率、8-细胞发育率、桑葚胚和囊胚发育率。观察3种培养系统对体外受精胚胎发育的影响。

2.7 数据统计与处理

每组试验重复5次, 采用SPSS 13.0统计软件对试验数据进行分析, 数据用平均值±标准差表示。不同条件的差异使用方差分析和多重比较检验。所有百分比的数据经反正弦变换后分析, 当P<0.05时差异显著, P<0.01时差异极显著。

3 结果 (见表1) 与分析

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。

由表1可知:Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组间卵裂率无显著差异 (P>0.05) , 但Ⅱ组 (82.80%) 略高于Ⅰ组 (82.16%) 和Ⅲ组 (82.54%) 。Ⅱ组8-细胞发育率 (74.80%) 显著高于Ⅰ组 (71.21%) 和Ⅲ组 (70.87%) (P<0.05) , 而Ⅰ组与Ⅲ组之间差异不显著 (P>0.05) 。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组间桑葚胚和囊胚发育率存在极显著差异 (P<0.01) , 其中Ⅲ组 (53.03%) 最高, 分别比Ⅰ组、Ⅱ组高22.41%和7.62%。

4 讨论

牛IVC是相当困难的, 因为受精卵的发育要经过早期卵裂, 突破8～16-细胞期阻滞、桑葚胚、囊胚及孵化囊胚阶段。它不仅受到体外发育培养体系本身的影响和制约, 而且还受受精过程以及受精前卵母细胞成熟程度及培养体系的影响。IVF后的胚胎培养与体内的受精卵一样, 遇到的最大问题是体外发育阻断。哺乳动物早期胚胎发育阻滞的时间往往与发育调控过渡的时间相关联, 即胚胎发育阻滞与基因组激活关系密切, 多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性基因调控转化阶段, 即胚源性基因激活时期[6]。由于胚胎体外发育阻断的存在, 如何将体外受精卵培养成能进行非手术移植的桑葚胚或囊胚一直是胚胎体外培养的研究热点之一。目前, 体外培养受精卵通过发育阻断的途径大致有三条:一是临时中间受体培养, 二是与体细胞进行复合培养, 三是用简单合成液培养。

从目前的研究结果来看, TCM-199共培养系统、SOF非共培养系统或共培养系统均可以获得理想的培养效果[5,7,8]。试验中, 通过分析早期胚胎各细胞阶段的营养代谢和物质需要, 结合相应的研究结果, 用TCM-199基础培养液添加氨基酸、BSA、FBS和抗氧化剂, 比较3种培养系统对延边黄牛早期胚胎发育的影响。试验结果表明, 用不同的培养系统培养受精卵, 对卵母细胞受精后的卵裂率没有显著影响, 说明1～2-细胞期胚胎对外界培养条件要求苛刻, 对培养系统的选择不够严格。但2种培养系统对受精卵以后的发育产生了影响, 8-细胞发育率和桑葚胚和囊胚发育率在含有FBS的体外培养液中的发育率较高。针对哺乳动物早期胚胎各阶段的营养需要, BSA可平衡渗透压, 清除有害的分子和金属离子, 同时有利于类固醇、维生素、脂肪酸和胆固醇的结合, 而FBS可提供胚胎后期发育的营养物质。添加非必需氨基酸和必需氨基酸对延边黄牛早期胚胎的发育也有促进作用。

因此, 根据试验结构可建立一套系统的早期胚胎分段培养体系, 即在胚胎早期培养液中添加BSA代替血清, 胚胎后期添加FBS继续培养。试验结果表明:此种方法可有效提高囊胚率, 克服了一种培养液连续培养早期胚胎使其发育到晚期, 这很容易造成物质供应的失衡和胚胎在发育过程中自身代谢产物的增加和一些毒性物质的积累, 这些产物在不同程度上均不利于胚胎发育。

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体外培养 第10篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

新生1~2 d的SD大鼠, 由天津医科大学实验动物中心提供, 雌雄不限。

1.1.2 主要设备及试剂

CO2培养箱 (美国Thermo公司) , 200目滤网、DMEM/F12培养基 (美国Hy Clone公司) , 胎牛血清 (美国Gibco公司) , 青霉素-链霉素双抗, EDTA-0.25%胰酶, D-Hank’s液 (北京索莱宝公司) , 兔抗大鼠胶质细胞原纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 多克隆抗体, TRITC标记羊抗兔免疫球蛋白 (武汉博士德生物有限公司) , 倒置相差显微镜、共聚焦荧光显微镜 (日本Olympus公司) [2]。

1.2 实验方法

1.2.1 脊髓组织星形胶质细胞的原代培养

新生1~2 d的SD大鼠腹腔麻醉后, 用75%酒精浸泡消毒5~10 min, 眼科剪沿大鼠后背正中剪开, 眼科弯镊轻轻钝性分离脊柱两旁组织, 显露视野, 然后在超净台上取脊髓组织, 放入D-Hank’s液漂洗3次后剪碎, 置于0.25%的EDTA-胰蛋白酶中并用吹管轻轻吹打15~20次, 37℃消化10 min。立即用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中止消化[3,4]。再次用吸管轻轻吹打15~20次制成细胞悬液, 以200目不锈钢滤网过滤, 滤液转移至10 m L离心管, 1300 r/min离心5 min, 弃上清, 加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基, 吸管吹打重悬, 制成的细胞悬液接种于已包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中, 于37℃、5%CO2培养箱中培养30 min进行差速黏附处理[5]。取出培养瓶, 轻轻翻转, 吸取细胞悬液, 倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数, 按1×106/m L接种于另一已包被左旋多聚赖氨酸培养瓶中, 放入培养箱中继续培养1 d, 次日37℃恒温摇床280~300 r/min水平振荡16~18 h后, 倒掉培养基, 用新鲜培养基漂洗2次后, 加入含10%胎牛血清的培养基, 继续培养, 每隔3~4 d换液, 直到细胞即将铺满瓶底融合, 进行消化传代[6]。

1.2.2 脊髓组织星形胶质细胞的传代培养

原代培养的细胞即将融合铺满瓶底时, 吸去旧培养基, 用D-Hank’s液洗涤2次, 加入适量0.25%的EDTA-胰蛋白酶, 以覆盖细胞为准, 消化8~10 min, 待细胞回缩变圆并约有30%~50%悬浮在消化液时, 立即用含10%胎牛血清的培养基中止消化反应, 然后用吸管反复吹打培养瓶底部, 使细胞从瓶壁上脱落。然后将细胞悬浊液转移至10 m L离心管, 1300 r/min离心5 min, 弃上清液, 加入少量含10%胎牛血清的培养基重悬, 倒置相差显微镜下台盼蓝染色计数, 按2×104/m L密度接种在预先包被左旋多聚赖氨酸的培养瓶中。CO2培养箱培养2~3 d后换液, 继续培养3~4 d或细胞铺满瓶底将要融合时再进行传代。

1.2.3 脊髓星形胶质细胞的鉴定

细胞培养瓶每日置于倒置相差显微镜下, 观察细胞胞体、突起形态及生长情况。将每次传代的少量细胞以1×105/m L的密度接种于放入事先用左旋多聚赖氨酸包被的盖玻片的6孔板内, 培养2 d后, 吸去6孔板内的细胞培养液, 加入PBS漂洗5 min×3次;加入4%多聚甲醛固定细胞20 min, PBS漂洗5 min×3 min, 行GFAP免疫细胞化学显色。兔抗GFAP多克隆抗体 (1:50) 4℃冰箱过夜。第2天复温20 min, PBS漂洗5 min×3次, 避光, 加TRITC标记的羊抗兔Ig G (1:100) , 37℃孵育1 h。DAPI复染5 min, PBS漂洗5 min×3次, 荧光抗淬灭剂封片, 激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照计数。

2 结果

2.1 星形胶质细胞的原代培养结果

刚接种的细胞在倒置相差显微镜下观察, 呈圆形, 折光性强, 悬浮于培养基中;24 h后大部分细胞已贴壁, 但表面仍有少许细胞漂浮;经16~18 h的恒温摇床振荡, 换液后溶液中无漂浮细胞, 贴壁部分细胞伸出细小突起;培养3~4 d后, 细胞数量明显增多, 长出突起的细胞明显增多比例越来越大, 而神经元、少突胶质细胞等其他细胞所占比例越来越少。一般培养8~10 d细胞即将铺满瓶底融合成片。

2.2 星形胶质细胞的传代培养结果

所培养的细胞即将铺满瓶底达到完全融合时, 进行第1次传代培养, 传代后细胞生长活跃, 12 h即可贴壁, 3~5 d细胞就可铺满瓶底。倒置相差显微镜下观察, 细胞形态不规则, 突起较多较长, 细胞核多位于胞体的一侧, 以椭圆形较为常见;胞浆丰富, 密度较低, 核/浆比较小。

2.3 星形胶质细胞的鉴定

胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 是星形胶质细胞胞浆中的骨架蛋白, 为其特异性标志蛋白[7]。培养的细胞每次传代应用兔抗GFAP多克隆抗体免疫细胞化学染色法进行鉴定, 细胞核为蓝色荧光, 阳性细胞胞体为红色荧光。统计结果显示第3次传代阳性率分别达到95%以上, 绝大多数细胞为星形胶质细胞。

3 讨论

体外细胞培养是医学科学研究的一种重要方法, 被广泛应用于细胞分子及药物学研究。获得较纯的星形胶质细胞是进行其功能及其相关研究的基础[8]。目前, 有关脊髓星形胶质细胞培养资料较少。笔者通过参照国内外星形胶质细胞培养方法, 并加以改良, 获得脊髓星形胶质细胞传至第3代时纯度达到95%以上, 完全符合实验要求, 为损伤、缺氧及药物等因素对脊髓组织星形胶质细胞影响的研究提供了基本的实验模型。

此星形胶质细胞培养方法的特点: (1) 使用新生1~2 d SD大鼠, 一方面是因为早期发育过程中, 星形胶质细胞大量增殖发生在胚胎晚期和出生后[9];另一方面, 新生大鼠神经元不再分裂, 并且在体外不易存活, 经传代后可有效去除神经元。 (2) 无须在显微镜下操作, 减少细胞污染率, 手术技巧要求简单。 (3) 滤网的使用, 可以有效地去除被膜等组织, 有利于获得单细胞悬液。 (4) 体外细胞培养过程中, 成纤维细胞较其他细胞更易黏附, 与神经胶质细胞贴壁速度存在明显差异, 故采用差速黏附处理, 去除培养基中的成纤维细胞成分。 (5) 由于星形胶质细胞在底层生长, 且其黏附能力较强, 其他胶质细胞在其上层生长, 经原代和传代经恒温摇床震荡, 尽可能去除了小胶质细胞、少突胶质细胞等不易贴壁的杂细胞[10,11]。 (6) 用多聚赖氨酸包被培养瓶, 更有利于细胞贴壁。但实验中应该注意: (1) 每次胰酶消化传代时, 要在倒置相差显微镜下仔细观察细胞形态, 把握好消化程度, 既不消化过度, 又不消化不完全, 待细胞变圆并约30%~50%细胞悬浮在消化液时, 立即用含胎牛血清的培养基中止消化。避免消化过度而影响细胞活力。 (2) 用吸管吹打时要彻底, 但动作应轻柔, 避免气泡的产生, 否则, 产生的气泡表面张力损伤细胞膜, 导致死细胞增多。 (3) 每次换液及传代前应尽量摇晃培养瓶, 并用D-Hank’s液洗培养瓶, 可进一步去除贴壁较慢的其他细胞。 (4) 每天显微镜下对细胞生长情况进行观察, 同时注意培养基颜色的改变。

综上所述, 通过此方法本实验获得的脊髓源性星形胶质细胞纯度能够满足符合后续实验要求, 有利于探讨星形胶质细胞在脊髓神经组织的生物学功能, 为脊髓星形胶质细胞相关疾病及因素的研究奠定了实验基础。

摘要：目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织, 采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液, 通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞, 进行培养。用胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态, 传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法, 为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。

体外碎石“包打”的教训 第11篇

王阿姨今年50岁，平时上班比较忙，难得坐下来休息喝水，工作环境也较湿热。去年9月份开始，王阿姨常常出现腰痛，有时候走路多了之后，还有暗红色的血尿。到附近一家医院检查，做了B超和X光，诊断是右肾多发性结石并积水。王阿姨听人讲，某某医院有“体外碎石”，交两千块钱可以“包打”，不限次数直到结石打完……王阿姨满怀希望来到那家医院，开始了“体外碎石”。2个月里，王阿姨一共做了6次碎石，陆续排出了一些小的碎石头。腰部倒是不像以前那样绞痛了，但最近却持续发胀，比以前更难受。最后，王阿姨来到我院看病。

听了她的叙述后，我再次给她安排了B超和X光检查。检查发现为右肾多发性结石并积水、右输尿管下段多发结石。另外，肾功能检查发现血肌酐升高。安排住院后，我们采用输尿管硬镜取出了输尿管下段结石，随后使用软性输尿管镜击碎并取出了肾内的结石。这项操作不用开刀也不用打孔，她住院3天就出院了。1个月后，王阿姨来医院复查，尿路结石完全清除，血肌酐也恢复了正常。

医生的话

尿路结石是泌尿外科常见疾病，尤其是在南方地区。其主要症状有腰痛、血尿等。尿路结石发病原因较为复杂，可能与气候、环境、饮食、感染、代谢问题以及个人体质等相关。王阿姨上班的地方湿热，平时又少喝水，容易形成尿路结石。

王阿姨所提到的“体外碎石”，专业上叫做“体外冲击波碎石”，其治疗原理是冲击波源产生冲击波，透过身体在结石部位聚焦增强，将体内结石击碎，并通过尿路排出体外。由于体外冲击波碎石操作相对简单，设备价格较为低廉，进入门槛低，国内大大小小的医院纷纷“上马”。但是，由于经济利益驱使，有些单位对碎石指征掌握不严格、违规操作，并进行不当宣传，使得老百姓对这一技术有所误解。像王阿姨那样，一些患者错误地接受体外碎石，给治疗带来了麻烦。

冲击波碎石的宜忌

首先，并不是所有结石都适合体外冲击波碎石，其最佳适应证是直径2厘米以下的肾结石或1厘米以下的输尿管上段结石。之所以有这样的限制，主要是基于体外碎石的原理以及预期治疗效果：①由于体外冲击波碎石过程较慢，如果结石太大，则难以一次碎石成功，而且较多的碎石屑排出过程中可能引起尿路阻塞，需要分期碎石才较为安全;②较大的输尿管结石，可能形成嵌顿，难以被冲击波击碎并排出;③输尿管中下段结石则难以定位，冲击波聚焦受到影响，碎石效率低下;④胱胺酸及一水草酸钙结石较硬，冲击波难以击碎，等等。

其次，体外冲击波碎石并非像宣传的那样，“对人体没有任何损伤”。尽管研究显示，体外冲击波碎石术对人体损伤非常小。但是，如果操作不慎，可引起皮下出血及瘀斑形成、肾包膜下血肿、血尿。短期内多次冲击波碎石，远期可引起肾纤维化，影响肾功能。大量碎石屑排出可引起输尿管堵塞致腰痛、感染发热、肾积水及肾功能损害。

总之，对于1厘米左右的肾结石，体外冲击波碎石一次成功率也是较高的，门诊即可完成治疗。对于较大的结石，体外冲击波碎石术后需要密切复查，观察有无输尿管结石堵塞。另外，两次碎石间隔时间应在2周以上。王阿姨短时间内接受了多次碎石，不合规范，有可能损害肾功能。而且，碎石屑堵塞了输尿管，引起她的腰部胀痛，且肾功能受损，表现为血肌酐升高。

碎石的其他微创选择

像王阿姨这种碎石失败，而且输尿管结石堵塞且引起肾功能损害的病例，在现实生活中并不少。其实，找一家正规医院进行规范治疗，本可以避免发生这些意外。正规的医院会对不同的结石患者应该进行综合评估，然后根据结石大小、部位等选择合适的治疗方法。

上尿路结石的治疗，目前除了传统的切开取石术及体外冲击波碎石外，还有经皮肾镜取石术、输尿管镜取石术、输尿管软镜碎石术等方法。作为国内尿路结石治疗领先的单位，广州医科大学微创外科中心在使用经皮肾镜取石术、输尿管软镜碎石术等微创技术治疗上尿路结石方面，积累了丰富的经验。经皮肾镜取石术需要在腰背部建立6毫米左右的通道至肾内，镜下击碎结石并取出，可以治疗不同大小的肾结石，尤其是较大的肾结石、不适合体外冲击波碎石或软镜碎石的，都可以采用经皮肾镜取石术治疗。输尿管软镜碎石术使用细长的软的内镜，经过尿道至输尿管到肾内，将结石用激光击碎;无需打孔或切开，创伤更小，住院2～3天就可以出院。另外，如果是较大的结石，或者特殊病例，如孤立肾结石，经皮肾手术出血风险较大，也可以采用输尿管软镜碎石术分次治疗。

总的说来，对于不同的结石患者，应经过专业的评估，选择合适的治疗方案，才能得到有效的治疗，并避免不必要的身体损伤。

TIPS

我们微创外科中心在尿路结石的治疗上，除了使用外科技术，还通过对取出结石进行成分分析以及代谢评估，给患者提供饮食指导以防治建议，真正做到尿路结石的综合治疗。

体外培养 第12篇

1 材料与方法

1.1 试剂及药品

TCM-199, Gibco公司生产;犊牛血清 (FCS) , Hyclone公司生产;人绒毛膜促性腺激素 (hCG) , 宁波激素制品厂生产。除特别注明外, 其他所有无机盐和生物化学试剂均为Sigma公司生产。

卵巢保存及运输液:含有K+、Ca2+、Mg2+的生理盐水。洗卵液:TCM-199+2%发情牛血清 (OCS) 。成熟液:NCSU-23基础液+10%卵泡液 (PPF) +半胱胺酸+激素。胚胎培养液: NCSU-23基础液+0.5%牛血清白蛋白 (BSA) 。以上配制的所有试剂均用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤消毒。

1.2 卵母细胞的采集与成熟培养

从屠宰场收集青年母猪卵巢, 将其置于含有 30～35 ℃ 生理盐水的保温瓶内, 在短时间内送回实验室;然后用10 mL注射器和12号针头穿刺抽吸卵巢上面3～8 mm卵泡内的卵母细胞, 在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞的卵母细胞, 用洗卵液清洗2次, 放入已装有1.5 mL含有激素 (10 U/mL hCG, 0.1 μg/mL FSH) 的成熟培养液 (无血清的NCSU-23基础液+10% PFF+10 ng/mL EGF+0.1 mg/mL 半胱胺酸) 的玻璃培养皿 (每皿200～300枚) 中, 在38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中体外成熟培养20～22 h, 然后转移到不含激素的成熟液中再培养22～24 h。

1.3 血清的制备

用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血, 静置30 min;在4 ℃冰箱中放置24 h左右, 待血清全部析出后, 以3 500 r/min离心10 min;吸取血清, 再以同一转速离心10 min;弃去沉淀, 将血清在56 ℃水浴中灭活30 min;最后将灭活的血清过滤消毒, 分装, -20 ℃保存 (使用时取出解冻) 。

1.4 卵泡液的制备

从卵巢表面3～8 mm的卵泡中抽取卵泡液收集于离心管中, 3 500 r/min离心10 min;弃去沉淀, 直接用0.22 μm的滤器过滤灭菌, 然后小剂量分装, 于-20 ℃保存, 备用。

1.5 卵母细胞的激活处理

猪卵母细胞成熟培养42～46 h后, 用吸管反复抽打去掉周围的卵丘细胞, 然后在含有5 μmol/L离子霉素 (ionomycin) 的培养液中处理5 min (38.5 ℃) , 随即用胚胎培养液洗2次, 移入含有2 mmol/L 6-二甲氨基嘌呤 (6-DMAP) 的培养液中培养3～4 h (38.5 ℃) 。

1.6 卵母细胞体外培养 (IVC) 及早期胚胎发育潜力的评定

将经人工激活处理后的卵母细胞置于50 μL的培养液微滴中培养48 h, 检查分裂情况, 中间不换液, 第6～8天检查囊胚发育情况。

1.7 试验设计

将经激活处理的猪体外成熟卵母细胞随机分成5组, 分别用不同浓度 (0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 mmol/L) 的亚牛磺酸进行胚胎的体外培养, 试验各组分别按前述的方法进行胚胎发育能力评定。

1.8 数据的统计分析

所得数据均用卡方检验进行统计分析, 确定差异的显著性。

2 结果 (见表1)

注:同列数据肩标字母不同表示差异极显著 (P<0.01) , 相同表示差异不显著 (P>0.05) 。

从表1可以看出:不同亚牛磺酸浓度处理组的分裂率之间差异不显著 (P>0.05) ;不添加亚牛磺酸组的囊胚发育率 (1.4%) 极显著低于添加亚牛磺酸的各处理组 (26.5%、22.8%、27.6%、30.7%, P<0.01) , 但亚牛磺酸各处理组间的囊胚发育率差异不显著 (P>0.05) 。由此表明, 亚牛磺酸是猪胚胎体外培养液的关键成分, 但为了降低成本, 可以在NCSU-23培养液中添加0.5 mmol/L的亚牛磺酸。

3 分析与讨论

在体外培养过程中, 胚胎会受到氧自由基的损害, 这已经在多种动物中得到证实。有报道表明, 活性氧化基团会造成线粒体的功能紊乱, 使DNA、RNA和蛋白质受到损害。为防止胚胎在体外培养过程中因氧化压而受到的损害, 必须在培养液中添加各种抗氧化剂。有研究报道, 在小鼠胚胎的体内和体外发育过程中, 添加超氧化物歧化酶 (SOD) 能保护胚胎不受氧浓度因素的影响。在无蛋白添加物的培养液中添加超氧化物歧化酶能提高兔胚胎发育成囊胚的比率。亚牛磺酸和牛磺酸常被添加于培养液中进行胚胎的体外受精和体外培养, 与超氧化物歧化酶、半胱氨酸、胱氨酸等成分一起提高谷胱甘肽的水平, 保护胚胎不受外环境因素的损害。曾申明曾用NCSU-23、合成输卵管 (SOF) 等培养液对猪胚胎体外培养进行比较研究, NCSU-23培养液效果较其他培养液好, 其原因就是NCSU-23培养液中含有的牛磺酸和亚牛磺酸有利于猪胚胎发育。Long C R等[3]在BECM-7中添加了牛磺酸和亚牛磺酸后, 虽不能提高囊胚率, 但胚胎细胞数有所提高。在改良的鼠胚高钙培养液 (KSOM) 中添加牛磺酸对牛的早期胚胎发育有益。Petters R M等[4]认为牛磺酸或亚牛磺酸能显著提高猪胚胎的发育能力。Elhassan Y M等[5]发现牛输卵管液和子宫液中牛磺酸等几种氨基酸含量很高, 认为它们在胚胎发育中可能起重要作用。然而, 由于亚牛磺酸非常昂贵, 这无疑会增加猪胚胎体外培养的成本。为此, 研究对NCSU-23中亚牛磺酸的浓度进行了进一步试验, 结果发现, 将NCSU-23中的亚牛磺酸浓度降低到原来的1/10 (0.5 mmol/L) 对猪胚胎的囊胚发育率没有显著影响, 但不添加亚牛磺酸则使胚胎的囊胚发育率极显著下降。由此表明, 亚牛磺酸是猪胚胎培养液中的重要成分, 但其浓度可降低至目前常用的1/10 (0.5 mmol/L) 。

摘要：为了探讨亚牛磺酸的浓度对猪胚胎体外培养效果的影响, 试验以孤雌激活胚胎为研究对象, 将NCSU-23中的亚牛磺酸浓度从原来的5mmol/L降低到2.5, 1.0, 0.5mmol/L, 检测猪卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率。结果表明:各种浓度亚牛磺酸处理后的分裂率和囊胚发育率 (30.7%、27.6%、22.8%、26.5%) 差异不显著 (P>0.05) ;但不使用亚牛磺酸则导致囊胚发育率极显著下降 (30.7%vs1.4%, P<0.01) 。结果说明亚牛磺酸是猪胚胎培养液必不可少的重要成分, 但其浓度可下调至0.5mmol/L。

关键词：猪胚胎,体外培养,分裂率,囊胚率

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