水产品免疫组化研究（精选7篇）
水产品免疫组化研究 第1篇
1 免疫组化的原理与临床应用
1.1 免疫组化的原理
免疫组化染色是应用抗体结合组织中特异性抗原的特殊染色。这种抗体抗原的结合通过应用与抗体结合的各种酶来显示, 酶起着产色物质的作用, 有色物质沉积在抗体-抗原结合的部位, 这种物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等) 通过光学显微镜可以观察到。甲醛在固定组织时使蛋白发生凝固、交联, 改变了蛋白质空间结构, 但这不影响抗原决定簇的苯环结构。通过蛋白酶消化, 去除覆盖与抗原决定簇的杂蛋白打开交联, 利用微波和高压锅作为常规热抗原修复工具结合使用, 最大限度暴露抗原决定簇, 提高免疫组化染色的敏感性。现在多应用于甲醛常规固定, 石蜡包埋组织切片病理诊断当中。
1.2 临床应用
目前多应用于肿瘤的病理诊断, 提高恶性肿瘤诊断和鉴别诊断准确性。如未分化恶性肿瘤 (癌或肉瘤) 性质的判断, 我们用非特异性抗体, 就有可能初步区分组织学类型, 在其基础上再选用特异性抗体做进一步鉴定。临床未发现原发瘤的转移瘤, 用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源。如颈部淋巴结转移性肿瘤, 标记CK阳性, 可以确定癌的诊断, 进一步标记TG阳性, 可考虑甲状腺转移, 若PAS阳性可考虑前列腺转移, S-100阳性可考虑恶性黑色素瘤转移可能。淋巴系统、髓系统的细胞在分化成熟的不同阶段及外周淋巴细胞活化的过程中细胞表达的抗原有所不同, 因此各种恶性淋巴瘤和白血病也可通过免疫组化技术检测肿瘤细胞所表达的抗原来进行区分类型。检测肿瘤细胞表达的激素及相关蛋白用以诊断和分类内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤, 或确定非内分泌系统肿瘤的异常分泌功能。例如用免疫球蛋白的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别是肿瘤性增生还是反应性增生等。Ki-67, cycling, PCNA可以对肿瘤细胞增生的程度作出评价, 提示增生细胞的良恶性或估计肿瘤的生物学行为。c-myc、ras和p53癌基因蛋白临床应用在肿瘤生物学中的价值已有大量的研究, c-myc的过度表达则促进肿瘤的生长和发展, 因而肿瘤的侵袭性增强:目前发现p53基因突变是人体癌症中最常见的, 可见于70%的大肠癌, 30%~50%的乳腺癌、50%的肺癌, 其中小细胞癌达100%。对一组常规病理切片证实为阴性的乳腺淋巴结, 采用免疫组化方法则十分有助于微小转移灶的发现。通过免疫组化可以进行病原微生物的检查如HPV、EBV等。
2 免疫组化技术存在的问题
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提, 免疫组化切片的质量直接影响着诊断结果的判断。因此制作良好的免疫组化切片至关重要。病理技术员和病理医生应当密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。由于免疫组织化学切片制作过程存在很多步骤和环节, 每一个步骤和环节都可能影响最终检测结果[1], 故制作一张高质量的免疫组织化学切片并不是一件容易的事。真阳性染色结果应表达在预期对应的组织细胞中, 定位清晰准确, 间质清楚, 无背景着色。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节;每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果, 因而我们根据多年的实践经验, 针对免疫组织化学制片过程中出现的常见问题进行了分析, 并提出了切实可行的对策。
2.1 脱片
脱片是免疫组织化学检测中最常遇到的现象之一, 主要是由于玻片处理不当、切片太厚、组织处理欠佳或组织的特殊特性所致。针对这些问题, 应该将玻片彻底清洗干净, 即将新购买的载玻片一片一片地放入洗衣粉水中浸泡10h左右;自来水冲洗干净;蒸馏水冲洗2遍, 烤干;浸泡防脱片剂多聚赖氨酸, 烤干备用。切片以2~3μm为宜, 漂片要平整, 不能有皱褶、气泡, 并需60℃烤15h以上。固定脱水欠佳的组织如需进行微波修复亦易导致脱片。因此, 组织应及时固定, 脱水充分, 透明浸蜡适度。应尽量切薄, 延长烤片时间, 缩短抗原微波修复时间和选用适当的抗原修复液[2]。对于骨组织和纤维成分较多的乳腺、皮肤等组织应将切片最好不超过2μm厚, 必要时切片后先微波1~2min, 再烤片, 使组织粘贴牢固。
2.2 假阴性
免疫组织化学染色切片中无阳性信号, 有两种可能, 一种是组织或细胞确实不表达待检抗原, 即真阴性结果;另一种为假阴性。
导致假阴性结果的原因有: (1) 组织未进行抗原修复或修复方法不当, 不同的组织其抗原修复方法不同, 选择适当的修复方法:热修复或酶消化。 (2) 一抗效价降低或失效, 二抗、三抗选用不当以及DAB配制错误。解决的有效方法是设立“阳性对照”, 如果阳性对照有表达, 说明染色过程和试剂无问题。反之, 表明检测过程中某个环节或试剂出了问题, 应逐一查找原因。此外, 为保证获得良好的阳性对照切片, 工作中收集抗原表达好的阳性蜡块, 建立阳性对照蜡块库。
2.3 假阳性
假阳性即阳性信号定位不正确, 包括背景着色、边缘效应、着色不匀及组织的某些特定成分所致等。
2.3.1 切片背景着色
即切片全部着色, 无法分辨真正的阳性信号, 其可能的原因有: (1) 一抗体浓度过高或失效, 故在每次使用新的浓缩型抗体之前做预实验, 确定一个最佳浓度, 同时注意抗体的有效期。 (2) 抗体孵育时间过长, 或者温度过高, 应严格按操作程序执行。 (3) DAB显色时间太长, DAB临用时配制, 溶解后必须过滤, 配制好的DAB不应存放时间太长, 因为在没有酶的情况下, 过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力, DAB显色应在显微镜下监控, 达到理想的染色程度时立即终止反应。 (4) 操作过程中如修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要仔细, 采用免疫组化笔在组织周围画圈, 可以有效的避免液体流失, 也能提高操作速度。
2.3.2 切片着色不均匀
是指切片边缘着色或呈灶片状着色。也是一种常见的现象, 产生的原因包括: (1) 组织边缘与玻片粘贴不牢, 边缘组织松脱漂浮在液体中, 每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。故应制备优质的多聚赖氨酸玻片, 组织的前期处理应规范。 (2) 试剂未充分覆盖组织, 组织边缘的试剂易干致深染。一定要将试剂充分覆盖组织, 应超出组织边缘2mm。用免疫组化笔画圈时, 为了避免油剂的影响, 画圈应距组织边缘3~4mm[3]。 (3) 孵育湿盒不平, 切片倾斜, 部分组织未被试剂覆盖。 (4) 裱片时局部形成气泡使组织突起, 滴加试剂时有气泡形成, 影响着色, 故应避免产生气泡。 (5) 坏死组织, 因组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解, 复杂的肽链残段 (如Fc段) 可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。因此应避免选择坏死组织较多的蜡块。
2.3.3 组织中特定成分所致的假阳性
胞浆里含有较多的蛋白质, 因此, 很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色, 可以通过血清封闭解决。因内源性酶造成的着色, 如血红蛋白 (红细胞) 、肌红蛋白 (肌细胞) 、细胞色素 (粒细胞、单核细胞) 、过氧化氢酶 (肝!肾) , 可用过氧化氢进行封闭。内源性生物素广泛存在于组织细胞中, 加热抗原修复后造成内源性生物素暴露, 主要以颗粒状形式存在于胞浆中, 与胞浆阳性非常相似[4、5]。可用鸡蛋清封闭或采用非生物素检测系统Polymer两步法 (Eli Vision、En Vision) 避免生物素干扰;此外, 胞浆内含有色素的组织, 如含胆色素、含铁黄色或福尔马林色素的组织, 这些色素可以与DAB结合形成假阳性, 故要求在结果判断时注意辨别。
3 免疫组化技术标准化问题
国内部分病理科技术室对免疫组化标准化的认识不足, 不同技术室采用的组织处理与染色方法、抗体克隆号和来源有所不同, 其染色结果可能会出现较大差异。免疫组化染色至今只能作为一个定性指标, 而不能作为定量指标应用于病理诊断, 其根本原因是没有一个公正准确的测评标准, 中国病理学工作者委员会免疫组化研究中心在借鉴国外先进经验的基础上, 在全国选择20家有代表性的单位连续进行四期免疫组化质控评估活动, 评委均由免疫组化技术专家组成;经过公正的评价, 发现国内各大技术室免疫组化质控存在明显差异。绝大多数的实验室使用中性福尔马林固定、固定引起的交联、延迟固定和固定时间导致的影响等这些问题得到解决, 提出组织固定应在手术切除后的30min内进行, 同时避免过度固定 (时间超过24~48h) 。组织处理过程的问题主要是在石蜡包埋以前的组织脱水问题, 预防措施就是每周更换新鲜的脱水液, 消除脱水不足造成的影响[6]。
在此我们就日常染色工作中存在的标准化问题提出几点体会和建议: (1) 规范行为技术标准:推荐使用中性福尔马林, 固定时间不宜超过一周。组织制备的标准化流程使组织保持最佳状态, 烤片及埋蜡温度过高或时间过长均会影响抗原的活性。 (2) 阳性及阴性对照片使用的必要性:其中阴性对照片的使用尤为重要, 它可以减少内源性过氧化物酶的干扰。 (3) 抗原修复的一致性:利用微波和高压锅作为常规热抗原修复工具, 精确的修复温度以及准确的修复时间。 (4) 染色的定位 (免疫组织化学结果判断必须要达到一定范围内室间判断标准化) :染色之前应确定该抗体阳性位置 (胞浆!胞膜或胞核) 。 (5) 技术设备、仪器和器具的质量管理标准化。只有真正认识到免疫组化标准化的意义, 并努力实现规范化的操作、过程化的质控及标准化的质量, 才能充分发挥免疫组化在病理的辅助诊断、预后判断及指导临床治疗中的作用[7,8]。
摘要：在临床病理诊断和形态学研究中, 免疫组化染色是应用抗体结合组织中特异性抗原的特殊染色。目前其多应用于肿瘤的病理诊断, 提高恶性肿瘤诊断和鉴别诊断准确性。但是, 随着免疫组化的广泛应用, 发现免疫组化染色过程中存在一些问题, 分析问题的原因, 找到解决问题的办法。本文就此问题作如下综述。
关键词：病理诊断,免疫组化技术
参考文献
[1]郑晖, 冯德云, 颜亚晖.不同抗原修复液对抗原微波修复的影响[J].临床与实验病理学杂志, 2000, 16 (6) :521-522.
[2]郑晖, 蒋海鹰, 颜亚晖.浅谈常规病理制片及免疫组化染色的质控问题[J].诊断病理学杂志, 2003, 10 (2) :119-120.
[3]魏兵, 步宏, Rhodes A, 等.英国国家免疫细胞化学外部质量评估方案及其乳腺病理应用模式[J].中华病理学杂志, 2004, 33 (1) :394-395.
[4]李雯, 梁颜笑, 刘国荣, 等.不同抗原修复方法对肝癌组织中内源性生物素的影响及对策[J].中国组织化学与细胞化学杂志, 2005, 14 (1) :190-192.
[5]王群姬.SP法免疫组化染色探讨[J].临床与实验病理学杂志, 2005, 21 (4) :94-95.
[6]郑杰, 邹万忠, 吴秉铨.成功开展免疫组织化学的关键是标准化[J].中华病理学杂志, 1996, 25 (1) :323-325.
[7]李向红.医学实验室标准化的方向[J].中华病理学杂志, 2004, 33 (1) :591-592.
一种新的免疫组化图像分割算法研究 第2篇
免疫组织化学(简称免疫组化)技术自20世纪70年代中期试验成功以来,在短短三十几年内以其强大的生命力在全球病理学界普及开来。其基理是通过对所观察的组织注入标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素等),使组织显色来确定细胞内抗原,对其进行定位、定性和定量的研究。应用该技术有助于提高病理诊断的准确性,发现微小病灶的转移,指导肿瘤的治疗,目前已成为判断肿瘤细胞生长程度的重要评价标准
免疫组化图像就是将标准医学显微镜下的免疫染色切片图像,通过拍照等手段采集到计算机中,并转换成指定的文件格式而得到的。为了准确分析图像中不同的区域,图像分割是关键的一步,其结果影响后续定量检测的精度。在20世纪80年代中期,国内外一些学者将计算机图像分析技术应用于病理学组织结构的测量,研制出一些专用医学图像分析软件,如Image pro plus、ACAS 570、CAS 200等,目前,借助已有的图像分析软件对免疫组化图像进行人机交互分割[1,2,3]仍是医生采用的主要手段。但这种分割结果与操作者的经验很有关系,不具有可重用性,应用受到一定限制。从20世纪90年代中期开始,一些学者尝试将图像自动分割技术用于免疫组化图像分割[4,5,6,7,8,9],如最大类间方差法。
本文研究的图像是大鼠肝脏免疫组化真彩色图像,其中,阳性产物常常代表癌变的组织,其在图像中所占的比例是定量分析的重要指标,对某些重大疾病如肝炎和癌症的早期诊断和预后判定有非常重要的价值。计算阳性产物比例,首先需要准确分割阳性产物。基于新的图像特征,本文提出一种新的阳性产物自动分割方法。
1 免疫组化图像组织特征分析
大鼠肝脏免疫组化图像的形态结构比较复杂,大致可分为:阳性产物、阴性区域和管腔三个部分,如图1所示。其中要分割的目标是染色的阳性产物,呈棕黄色;阴性区域呈蓝色;管腔纹理均匀,呈浅蓝色。
特征提取的目的是获取一组少而精的分类特征。对于彩色图像分割问题,色彩信息即每一像素点的红(r)、绿(g)、蓝(b)值是该像素的重要特征。为了分析阳性像素的色彩信息,本文在3幅图像中随机抽取了100个阳性像素点进行分析,各像素的r、g、b值关系如图2所示。由图2可知,阳性像素在RGB空间满足r> g> b,但其它组织的像素也有很多满足这种关系,还需寻找其它的特征量。
对阳性区域的像素值进行分析后发现,每个阳性像素在(r-g)、(g-b)、(r-b)三个分量上的均值和方差偏大,我们称像素的这种色板差量上的均值和方差为色差均值和色差方差。设色差均值为RGB_junzhi,色差方差为RGB_fangcha,则每个像素在三色板间差量上的均值和方差为:
经分析,阳性与非阳性像素在色差均值RGB_junzhi和色差方差RGB_fangcha上的差异较为明显,为了得到精确的分割阈值,我们同样在上述3幅图像中随机抽取100个像素点,分析其色差均值和色差方差,如图3所示。
在上述分析基础上, 对其色差均值和色差方差设定阈值:认为阳性像素样本点色差均值的下限为5,色差方差的下限为3,可以假设RGB_junzhi>5且RGB_fangcha>3为阳性像素的另外两种特征。
但是还有少数非阳性像素也满足这一特征,可视之为脉冲噪声。由于中值滤波能够较好的去除噪声并保持图像的边缘特征,经过对图像和噪声大小的分析,我们选用9邻域中值滤波模板去噪。
2 阳性产物自动分割算法
以上述特征为依据,免疫组化图像的阳性产物自动分割算法如下:
1) 将所有满足r>g>b的像素值设为白色,其余像素设为黑色。
2) 对1)得到的像素,计算每个像素的RGB_junzhi和RGB_fangcha值。
3) 提取满足RGB_junzhi>5且RGB_fangcha>3的像素,设为白色,其余像素设为黑色。
4) 对3)得到的图像进行9邻域中值滤波,得到要提取的阳性区域。
3 实验分析
3.1 算法各步处理结果
本文研究的图像均摄于相同的染色和拍摄条件,图像大小均为13601024,放大倍数为400。我们在Matlab7.0环境下,对上述算法进行实验。图1是原图,图4是本文算法的一系列处理结果,其中黑色代表背景,白色代表提取像素。图4(a)是提取所有满足r>g>b的像素得到的图像,图4(b)是在图4(a)的基础上,所有满足色差均值和色差方差阈值设定条件的像素组成的图像,由图4(b)可以看出,多数阳性产物已被提取出来,但还有少量非阳性像素也被误分为阳性产物,可将这部分非阳性像素视为脉冲噪声,用9邻域中值滤波模板去噪的结果如图4(c)所示。由图4(c)可知本文算法的分割结果比较准确。
3.2 与其它方法的比较
为了更方便地看出本文算法的优点,与基于最大类间方差法(简称ostu法)的免疫组化图像分割算法[4,5]放在一起进行比较。ostu对图1的分割结果如图5所示。从图5可以看出,ostu法的误分和漏分现象严重,不太适合本文图像的分割。
4 结 果
对82幅图像进行了处理,由病理专家对本文算法的分割效果进行评价,医生对分割结果比较满意的图像约占80% , 不太满意的约占20%。对于分割效果不太理想的图像,究其原因,是由于对阳性像素的判断还依赖于与周围像素的比较,如果图像整体偏黄色,那么颜色较浅的棕黄色像素可能是假阳性像素,颜色较深的棕黄色像素是阳性像素,医生对于假阳性像素的判断也比较模糊。今后还需进一步与医生沟通,研究假阳性像素的特征,提高分割正确率。
5 结 语
彩色图像的自动分割一般都要用到图像某方面的信息,如颜色、纹理等,它们在同一区域具有相似性。实际的图像处理和分析都是面向某种具体应用的,免疫组化图像复杂多变,目前还没有一种通用的方法可以完成不同的分割任务,只能根据实验结果定量评价已有算法的好坏。
本文利用大鼠肝脏免疫组化彩色图像在RGB空间的颜色信息,提取出几种新的图像特征,以此为依据提出的图像自动分割算法可有效分割阳性产物。实验结果表明,本文算法更适合大鼠肝脏免疫组化图像的自动分割,在免疫组化彩色图像的自动分析方面,做了一次有益的探索和尝试。
摘要：免疫组化图像自动分割在病理切片染色分析中有重要的应用价值。对大鼠肝脏免疫组化彩色图像进行深入研究,提取出新的阳性产物图像特征:所有阳性像素满足r>g>b;每个阳性像素在(r-g)、(g-b)、(r-b)三个色差分量上的均值和方差较大。以这些特征为基础,结合中值滤波,提出一种新的阳性产物自动分割算法。利用82幅图像对算法进行验证,与医生目视鉴别结果一致的约占80%。与现有算法的比较结果表明,该算法更适合低放大倍数的大鼠肝脏免疫组化彩色图像的分割,在免疫组化彩色图像的自动分析方面,做了一次有益的探索和尝试。今后还需进一步与病理专家沟通,提高识别率。
关键词：图像处理,免疫组化图像分割,特征提取,数学期望,方差
参考文献
[1]Zafirellis K,Agrogiannis G,Zachaki A.Prognostic value of COX-2 im-munohistochemical expression evaluated by quantitative image analysisin colorectal cancer[J].Acta pathologica,microbiologica et immuno-logica Scandinavica.2008,116(10):912-922.
[2]Lejune M,Jaén J,Pons L,et al.Quantification of diverse subcellularimmunohistochemical markers with clinicobiological relevancies:valida-tion of a new computer-assisted image analysis procedure[J].Journalof Anatomy,2008,212(6):868-878.
[3]Hatanaka Y,Hashizume K,Kamihara Y,et al.Quantitative immunohis-tochemical evaluation of HER2/neu expression with HercepTestTM inbreast carcinoma by image analysis[J].Pathology International,2008,51(1):33-36.
[4]林嘉雯,刘勇,刘秉瀚.肿瘤细胞膜免疫组化病理图像的自动分割[J].莆田学院学报,2007,14(5):45-50.
[5]刘秉瀚,郑智勇,王伟智.肝组织免疫组化病理图像的自动分析[J].中国体视学与图像分析,2000,5(4):226-229.
[6]傅蓉,申洪.基于色度学准则分析的免疫组化彩色图像C-均值聚类分割技术研究[J].中国体视学与图像分析,2007,12(1):6-10.
[7]Pham N A,Morrison A,Schwock J,et al.Quantitative image analysis ofimmunohistochemical stains using a CMYK color model[J].DiagnosticPathology 2007,2:8.
[8]Liu B H,Wang W Z,Fang X D.Automatic Extraction of Positive Cellsin Tumor Immunohistochemical Pathology Image Based on YCbCr[C]//The Sixth World Congress on Intelligent Control and Automa-tion.2006.
水产品免疫组化研究 第3篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组32例鼻腔恶黑均来源于我院和中南大学缃雅三医院病理科收治病例。包括男20例、女12例,男女之比为1.67:1,年龄范围为24-78岁,中位年龄57岁。
1.2 病程与临床表现
就诊时患者病程为个1月至1.5年,平均5个月。临床症状方面32例(100.0%)有不同程度的进行性鼻腔阻塞,27例(84.4%)鼻出血,17例(53.1%)鼻腔分泌物增多,其中4例分泌物带黑色,8例(25.0%)鼻外表肿胀变形;少数病例还有肿瘤局部浸润或转移的症状,如头痛(6例),颈部淋巴结肿大(5例),耳鸣及听力减退(3例),视力减退(2例)等。
1.3 临床检查
32例中18例肿瘤累及一侧鼻腔,7例肿瘤破坏鼻中隔累及双侧鼻腔;7例病变较为广泛,累及到副鼻窦、鼻咽及眼眶等处。肿块外观大多数呈菜花状或结节状,少数呈周边隆起的溃疡状,另有2例呈有蒂的息肉状。14例肿块明显黑色或黑褐色外观,8例呈不同程度灰黑或褐色,10例无可见的色素沉着,呈灰白色;2例病变周围可见粘膜呈黑斑样改变。肿块质地通常细嫩、脆,触之易出血。全部病例经临床体格检查及影象学检查未发现皮肤和粘膜其它部位恶黑。
1.4 临床诊断
4例临床诊断为恶黑,16例诊断为其他鼻腔恶性肿瘤,大多数为鼻腔癌,12例诊断为鼻息肉、鼻窦炎。全部患者均接受了手术治疗,部分患者术后补充了放疗或化疗。随访15例,2例存活3个月,3例存活5年以上,五年生存率为20.0%;17例失访。
1.5 方法
32例患者的标本均用10%福尔马林固定,石蜡包埋。常规切片,HE染色。4例新鲜标本经戊二醛-饿酸双重固定,常规脱水,包埋,超薄切片染色,日本电子Cx-100型电子显微镜观察。全部病例均用SLAB方法作了免疫组化染色,染色过程中常规设立阳性和阴性对照。所用抗体包括黑色素细胞标记HMB45、S-100蛋白及其它与鉴别诊断有关的肿瘤标记如波纹蛋白(Vim)、细胞角蛋白(CK)、上皮膜抗原(EMA)、白细胞共同抗原(LCA)、肌动蛋白(Actin)等,所用的抗体为Dako公司产品。
2 结果
2.1 病理学观察
光镜下组织结构及细胞形态与其它部位恶黑相似,形态多样,既有象癌的组织像,又有似肉瘤的组织像。除少数病例大上皮样细胞为主或以梭形细胞与上皮细胞混合存在外,余皆以小上皮样细胞为主要类型。其细胞小,核小但有异型,核浆比例增大,染色质颗粒增粗而深染,核仁多不清楚,核分裂相多,瘤细胞聚集成巢状,似痣细胞巢,常可误诊为低分化腺癌,弥漫分布者可误诊为未分化癌或淋巴肉瘤。其次为气球样细胞,常与小上皮样细胞以不同比例混合存在。瘤细胞稍大,胞浆透明、核较小或稍大有异型,核多位于中心,亦可位于一侧呈印戒状。部分病例瘤细胞黑色素较多。32例中上皮样细胞为主型12例,梭形细胞为主型8例,其它12例为混合型。本组32例中26例瘤细胞含有黑色素,其中18例含量较多,8例少量;6例切片中未发现黑色素。
2.2 超微结构观察
分化好的瘤细胞呈圆形或椭圆形,核体大,常染色质丰富,异染色质较小而边集。核仁明显而较大,胞浆丰富可见较多的核糖体、线粒体、粗面内质网。高尔基器可见。部分线粒体肿胀,嵴紊乱、消失。胞浆内可见微丝,未见张力纤维和桥粒等细胞连接。本组多数病例瘤细胞分化较低,胞浆少而核体增加,异染色质增多,核仁清楚,胞浆内细胞器较少,部分瘤细胞胞浆内含大小不同的无单位膜包绕的空泡,少数瘤细胞呈梭形,核呈长圆形。各种瘤细胞胞浆内均可见数量不等的圆形或椭圆形黑色素小体。
2.3 免疫组化染色结果
见表1。
3 讨论
本瘤组织起源于外胚层的神经嵴。就鼻腔而言,可能源自胚胎早期外胚层凹陷形成鼻腔时,残留的黑色素细胞恶变而成,也有人认为来自鼻腔粘膜的斑痣。研究结果表明鼻腔粘膜内存在黑色素细胞,可发生恶黑[1]。粘膜恶黑的部分患者在肿瘤发生前,粘膜内有色素沉着斑块,一般认为与肿瘤的发生有关。本组病例中2例肿块周边粘膜色素沉着,推测这些色素沉着先于恶黑存在,在该基础上细胞发生恶性转化形成性肿瘤。目前尚无特异方法鉴别鼻腔恶黑是原发抑或继发,一般的标准是若既往无恶黑病变史和全身其他部位的皮肤、粘膜没有恶黑病变,即可考虑为原发。
该瘤的发病率低,发病年龄较高,性别无多大差异。鼻腔原发性恶性黑色素瘤常呈息肉状[2]。鼻腔阻塞、鼻出血、分泌物增多以及鼻腔内肿块等症状和体征并无特异性,较为特异的是部分肿块呈黑色或黑褐色,有助于本病的诊断。若病变含极少或不含色素,则很难考虑到本病,需活检经病理学确诊。由于该瘤的恶性程度高,转移能力强,若临床能作出诊断时,最好能避免活检,将肿块全部切除后作病理检查,可能有助于改善患者的预后。
在该瘤病理诊断方面,应充分注意到该瘤极易与其他恶性肿瘤,如低分化和未分化癌、软组织肉瘤、大细胞淋巴瘤等相混淆。观察细胞内是否有黑色素对确立诊断有很大帮助,必要时可多切片寻找黑色素,应注意的是黑色素颗粒与含铁血黄素的区别,前者Fontana黑色素染色阳性,后者普鲁士蓝反应阳性。电镜检查可在瘤细胞内发现黑色素颗粒,有助于确诊本病。免疫组化染色检查由于其敏感性高、特异性强,对确诊本病有极大的帮助。S-100蛋白和HMB45为诊断恶黑很好的标记物。前者的特点是敏感性高,本组病例阳性率达100%。。S-100阳性对恶黑缺少特异性[3]。其他很多肿瘤如神经源性、肌上皮源性、脂肪组织源性等肿瘤亦可能阳性,需结合肿瘤形态综合考虑;HMB45敏感性虽稍低,本组中阳性率为90.6%,但特异性强,其他肿瘤很少有阳性表达,与S-100联用对恶黑的诊断更可靠[4]。波纹蛋白在本组中的表达率虽达70%左右,但由于其在软组织肿瘤中广泛的表达,难以成为诊断恶黑的确切证据。此外,本组中少数肿瘤同时表达上皮标记CK和EMA,提示上皮标记阳性并不能排除恶黑诊断。
本病的治疗目前仍以手术切除为主,大多数学者认为在可能时应对本病进行广泛性根治手术治疗。一般认为恶黑对放疗不敏感,但有些学者在应用放疗亦取得较好的疗效,可使大多数病例得到局部控制。化疗目前尚无较为理想的药物。本病预后极差,多数病人因转移而在5年内死亡[5]。比皮肤恶黑预后要差,其原因可能是鼻腔恶黑发生部位较皮肤恶黑隐蔽,难以早期发现。
参考文献
[1]Wanebo HJ,woodruff JM,Farr GH,et al.Anorectal melaoma.Cancer,1981,47(7):1891.
[2]Berthelsen A.Andersen AP,Jensens,Hansen HS:Melanomas of the mocosa in the oral cavity and the upper respiratory passages.Cancer54:907-912,1984.
[3]Fitzgibbons PL,Chaurushiya PS,Nichols PW,et al.Primary mucosal malignant melanoma:an immunohisochemical study of12cases with comparison curtaheous and metastatic melanoma.Humpathol,1989,20(3):269.
[4]Ordonez NG,Ji XL,Hickey RC.Comparison of HMB-45monoclonal unti-body and S-100protein in the immunohistochemical diagnosis of melanoma.Am J clim pathol,1988,90(4):385.
水产品免疫组化研究 第4篇
检查外周血细胞异型、穿刺液用于肿瘤检测或分类的方法非常方便易行,如需更准确地评估犬乳腺肿瘤的发展和预后情况,使用流式细胞仪结合乳腺肿物针穿刺在临床上仍有特别高的诊断价值[6,7]。本试验将细胞检测可疑病例结合穿刺组织免疫组化分析,经流式细胞仪筛查后对犬乳腺肿瘤的预后提供诊断参考,在转化医学中值得推广和应用。
1 材料
光学显微镜( BX - 21型) ,日本OLympus公司生产; 流式细胞仪,美国BD公司生产; 石蜡切片机( RM2165) ,德国Leica公司生产; F50 - 100Ⅱ50 mA X射线机,上海华线医用核子仪器有限公司生产; 鼠抗人细胞角蛋白( CK19) 单克隆抗体,购于上海欣亿生物有限公司; 异硫氰酸荧光素( Fluorescein isothiocynate,FITC) 标记的细胞角蛋白8,18,19抗体、胎牛血清( FBS) ,GIBCO公司生产; 伊红染液、苏木精染液、淋巴细胞分离液( Ficoll - Hypaque) ,美国Sigma公司生产; 破膜剂,购于美国BECTON DICKINSON公司。
从最近3年的病例中先筛查出36例,然后选出可疑病例乳腺肿瘤犬15例,分别是蝴蝶犬2例、京巴杂3例、可卡犬2例、巴哥2例、贵宾犬2例、西德犬2例、吉娃娃2例,均为母犬,年龄为7 ~ 14岁。动物在接受采血和取样之前没有经过任何化学疗法和放射疗法( 所有病例全部来自于康祥伴侣宠物医院) 。临床症状: 患犬乳房及周围皮下有若干局限性肿胀物,有的肩前、腹股沟、腋下出现淋巴结,触之较硬,无热无痛。部分肿胀物游离感不强,肿块大小不一,直径为1. 2 ~ 18 cm,质量为0. 30 ~ 1 400 g,且肿瘤直径与质量越大,侵袭部位范围越广。部分犬出现行走障碍,甚至气喘急促,呻吟。
2 方法
采集血样,涂片和局部穿刺,固定于10% 甲醛溶液中待做病理切片和免疫组化; 流式细胞仪检测外周血CK19阳性率,检查细胞异型性判断犬肿瘤的性质( 良性与恶性) ,追踪随访预后情况。
2. 1 可疑病例的检查
采血,制作血涂片,观察,如为可疑病例预约抽取外周血以供检查。
15例犬预约同一天进行采血,均为空腹采桡静脉血2 ~ 5 mL ,用乙二氨四乙酸( EDTA) 抗凝,用真空采血管保存( 8℃以下) ,2 h内进行检测。为避免外周血被毛皮上的细菌污染均将第1管血留作生化或血液涂片检查。细胞有异型进一步穿刺做组织免疫组化检查。
2. 2 穿刺标本的制备
应用20 mL注射器吸取生理盐水5 mL ,接上15 cm乳胶管,再接上7#静脉注射针头( 或用20#穿刺针头,目的是取到的组织多) ,穿刺乳房肌膜,缓慢抽吸数次,把住吸管负压取出吹于玻片,同时制作细胞涂片,自然风干后姬姆萨染色,油镜观察细胞大小及形态。如用20#穿刺针取出组织放入10% 福尔马林固定液中,再制作病理切片。用免疫组化分析法观察CK19抗体在犬乳腺肿瘤中的表达,以阳性、阴性和可疑表示结果[2]。
2. 3 流式细胞技术方法和步骤
2. 3. 1单个核细胞悬液的制备采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞,用EDTA抗凝管取所有检测犬外周静脉血5 mL ,等量分装于2个EDTA抗凝管,分别加入等量PBS液稀释[8]。
2. 3. 2单个核细胞的分离取抽得的外周血5 mL ,弃去最初的1 mL ,使离心管稍倾斜,将剩余的4 mL沿管壁加至淋巴细胞分离液面上 ( 淋巴细胞分离液∶血液 = 1∶1) ,勿用力过大,以免造成血液与分离液混合,18 ~ 20℃水平2 000 r/min离心20 min; 静置3 min,此时离心管中形成5层: 最上层是血浆,血浆层和淋巴细胞分离液之间是单核细胞( 淋巴细胞为主的白色云雾层狭窄带) ,淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层,又称为棕黄层。吸去最上层的血浆,收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞( 尽量全部吸出单个核细胞) ,置于一个流式管中,用PBS缓冲液洗两次后重悬。收获待测细胞于离心管中。分成两管,其中一管为试验管,另一管为阴性对照管[8]。
2. 3. 3单个核细胞悬液流式细胞仪计数方法和步骤1) 向单个核细胞悬液中再加入已配好的破膜剂,混匀,室温下孵育10 min; 加PBS,3 000 r/min离心5 min; 取沉淀,振荡细胞悬液至液体变为清亮色,加入PBS稀释至3 mL ,1 500 r/min离心10 min; 洗涤细胞,弃上清液。2) 向细胞悬 液中加入Cytokeratin8,- 18,19 - FITC 20μL,稀释浓度为1∶50振荡细胞悬液混匀,振荡,室温孵育1 h; 3 000 r/min离心5 min后弃去上清液( 可离心洗涤2次,洗去未结合的一抗) 。3) 配二抗( 即FITC标记的羊抗鼠Ig G) ,稀释浓度为1∶50,暗室下,试验管和对照管分别加入FITC标记的荧光二抗,混匀,室温下避光30 min; 加入PBS液2 mL ,3 000 r/min离心5 min后弃去上清液,以备上机检测。
3 结果判定方法与统计分析
3. 1 流式细胞仪检测 CK19 阳性细胞的原理和结果判定
FITC标记的荧光二抗和鼠抗人CK19单克隆抗体与犬体循环外周血中的CK19阳性细胞特异性结合后,经激光照射后激发波长更长的荧光,其激发荧光强度与犬循环外周血中的CK19阳性细胞数呈正相关,由此可以得到被测循环外周血中CK19阳性细胞表达量和阳性细胞百分率。通过流式细胞仪得到试验管和对照管的单参数直方图,见图1、图2( SSC是侧向角散射检测的细胞颗粒物质的大小和多少,FSC是向角散射的光检测细胞的大小和尺寸,二维点示每个细胞) 。由此可以得出犬循环外周血中的CK19阳性细胞百分率,见图3。未检测到肿瘤细胞的为阴性,反之则为阳性。
用20#穿刺针取到的组织制作成包蜡切片和免疫组化图片,检测是否有CK19在上皮细胞上表达( 判断标准: CK19阳性表达于细胞质,胞质出现棕黄色颗粒沉着的细胞为阳性细胞,见214页彩图4 ~6) 。
3. 2 统计学分析
应用SPSS13. 0软件建立数据库,统计学处理采用t检验及χ2检验进行统计分析,所有统计均为P <0. 05有统计学意义。
4 结果
由犬肿瘤外观( 见214页彩图7) ,结合X光检测结果( 见214页彩图8) 和针吸穿刺检测结果( 见214页彩图9) ,进一步对犬的乳腺瘤进行分类,结果见214 ~ 215页彩图10 ~ 18和表1。
15例患犬中,导管腺瘤2例 ( 占13% ) ,导管内乳头状瘤1例( 占7% ) ,其他12例都是恶性肿瘤( 占80% ) 。
4. 1 外周血涂片检出结果( 见表 2)
15 例患犬中,外周血细胞异型性阳性检出率为73% ,阴性 20% ,可疑 7% 。
4. 2针吸细胞学和乳腺常规病理学诊断比较结果( 见214 ~ 215页彩图9 ~ 18)
乳腺针吸细胞学诊断确诊为恶性肿瘤11例( 占73% ) ,可疑癌细胞1例 ( 占7% ) ,总阳性率80% ; 病理诊断确诊恶性肿瘤14例( 占93% ) ,另外有1例病理学诊断为良性,针吸细胞学与之比较出现假阳性1例( 占7% ) 。
4. 3免疫组化检测结果
恶性肿瘤13例( 占87% ) ,良性2例( 占13% ) 。
4. 4流式细胞仪检出结果( 见表2,3)
%
注: 配对比较差异不显著( P≥0. 05) 。
注: * 表示患犬的存活时间与循环肿瘤细胞的数量、肿瘤是否发生远处转移这三个变量高度相关( P < 0. 05) ,有统计学意义。
外周血涂片细胞异型检查准确率很高,CTS细胞数在5 ~ 10个时都检查到。犬外周血CK19的表达特征是: 乳腺肿瘤患犬外周血CK19的表达与患犬的年龄、绝育手术状态表达无明显相关( P > 0. 05) ; 而与肿瘤的大小、腋窝淋巴结转移相关( P≤0. 05) 。
5讨论
犬自发性乳腺肿瘤多发于老年雌犬,与年龄、品种、激素、绝育、营养肥胖度有关,肿瘤的分型与细胞转移有关[9,10,11]。随着生活水平的提高,肉类食品主食链的改变,添加剂的滥用、环境污染等导致犬乳腺肿瘤的发生率逐步上升。肿瘤转移是预后不良的重要标志[12,13,14,15]。用外周血细胞异型开辟新的犬乳腺癌诊断方法的优势是早发现、早治疗。外周血液涂片简单、便捷,先筛查,有可疑再进一步做标志性物质的检测[11]。15例犬中,外周血检查检出73% 属于阳性,流式细胞仪筛查检出87% 呈阳性,免疫组化中犬乳腺肿瘤CK19抗体表达阳性与肿瘤大小相关。CK19在临床研究中的使用如生物标志物一样有非常重要的作用[9],主要与肿瘤的大小、转移的淋巴结部位相关。外周血细胞异型数量在5% 以上,犬的预后不良; 流式细胞仪检查阳性CTC数≥5,通过电话回访犬的存活时间与细胞异型数量呈负相关,肿瘤质量大CK19表达强,与人类的资料有相似情况[9]。基因测序结果表明,犬与人有96% 的相似性,犬的自发性乳腺癌模型有望 成为在人 乳腺癌研 究中的替 代模式[10]。通过检测细胞异型数量监测犬乳腺肿瘤细胞预后将避免不必要的手术和风险。在宠物犬的治疗中及医学实验动物研究领域有重要的作用。
6小结
通过临床检查犬乳腺肿瘤的部位、大小及肿块的数量,采取外周血涂片细胞异型检查,筛选15例可疑病例进一步做穿刺术、免疫组化、流式细胞仪检测。外周血检查阳性率为73% ,流式细胞仪检测阳性率为87% ,细胞异型数量最多的犬只存活40周( 未手术) ,当CTC数≥5时,乳腺肿瘤开始转移,预后不良,是犬乳腺肿瘤预后发展的一个重要指标。
摘要：为了探讨犬的乳腺肿瘤预后情况,试验结合犬自发性乳腺肿瘤临床症状进行细胞异型筛查、穿刺切片免疫组化或流式细胞仪细胞免疫分析检测犬外周血细胞异型后乳腺肿瘤的预后情况,对可疑病例犬采血、涂片、穿刺,用流式细胞仪进行检测。结果表明:犬的外周血中循环细胞异型数量超过5%;CK19阳性;流式细胞仪检测循环肿瘤细胞数(CTC)≥5,犬的肿瘤即有预后不良;细胞异型检查数量与肿瘤的预后不良有一定相关性;CK19阳性与肿瘤的大小相关;流式细胞仪检测的阳性率与预后不良相关。
水产品免疫组化研究 第5篇
关键词：免疫组化特征,小儿神经母细胞瘤,CT
神经母细胞瘤（Neuro Blastoma, NB）是儿科最常见的腹膜后肿瘤之一，发病人群多为5岁以下的儿童，通常男孩高于女孩，NB具有进展快以及预后差等特点，若得不到有效的诊断，可能加重患儿病情，严重时可致死[1,2]。为了更科学有效的诊断NB，提高对NB的认识，减少漏诊率[3]。本文选取2008年1月至2012年12月经我院病理证实的NB56例患儿为本次研究对象，进行CT扫描，研究结果现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2008年1月至2012年12月经我院病理证实的NB56例患儿为本次研究对象，其中男36例，女20例，年龄1岁～6岁，平均年龄3.5岁。
1.2 方法
本组56例小儿NB患儿均使用SOMATOM Emotion6螺旋CT机进行常规扫描，扫描参数：5mm层间距，5mm层厚；CT扩大扫描使用高压力注射器对NB患儿肘静脉以0.6～1.8m L/s流速注入碘海醇，剂量大小根据NB患儿体质量1.5m L/kg体质量注射，并于注射后动脉期（25s）、静脉期（65～70s）、延迟期（2～3min）分别扫描。设定螺距为1，准直纵度为5mm，静脉期扫描层纵度为5mm，延迟、动脉平扫期扫描纵度为10mm，初始图像在ADW4.4Workstaion工作点进行重组。
1.3 免疫组化及病例分析
本组56例NB患儿均经过甲醛（10%）固定，HE染色，石蜡包埋制片[4]。随后应用SP法为患儿进行免疫组化分析，试剂选取S-100蛋白、突触素（Syn）、嗜铬素（Cg A）、神经特异性烯醇化酶（NSE）等[5]。
2 结果
2.1 实验室检查以及患儿临床表现
本组56例NB患儿都有不同程度的腹部或其他部位包块、腹痛、腹胀、无力、尿急、尿频、持续发热、关节肿痛、面色苍白、淋巴结肿胀等。其中30例（53.5%，30/56）全天尿中代谢产物香草基扁桃酸（Vanillyl Manolelic Acid, VMA）、香草酸（Homo VaniLLic Acid, HVA）增高。
2.2 CT影响特征
本组56例NB患儿通过CT影响特征显示为：44例单发和12例多发患儿，其中右肾上腺16例，单发于左肾上腺22例。38例患儿肿瘤直径>5cm, 24例跨越中线，肿瘤体积最大为10cm×11cm×18cm。通过CT平扫显示56例NB患儿的肿瘤密度不均衡，其内部呈现无序列型低密集区（图1a）, 46例NB患儿的肿瘤出现钙化现象，一般呈现斑片、团状以及沙砾状（图1a、b）, 4例NB患儿的肿瘤内出血量过多，其余10例密度较为平衡，CT值为24～31HU, 56例NB患儿肿块周围均有不规律结节样增强，但中心区域并没有明显增强趋势，局部表现为环状增强；56例NB患儿通过CT增强扫描显示，8例增强不明显，CT值与平扫相比仅上升了8～10HU。而2例位于胸椎椎旁的NB患儿在通过平扫后，显现出无规律软组织肿块或为脊柱胸椎旁类柱形，密度不对称，其内部呈现坏死的囊变以及钙化的斑片，其中1例位于纵隔内的NB患儿，其内部显示肿大的淋巴结趋于融合。颈部6例NB患儿有2例为多发NB，患儿肿瘤病灶内呈现钙化的斑片；2例单发的NB患儿，其肿瘤大小为8.2cm×4.8cm，并伴有钙化；2例NB患儿经CT增强扫描，发现其肿瘤密度相对均衡，无显明钙灶化，但其软组织肿块却呈现无规律的显著增强。有较大的腹膜后肿块，占位效应显著（图1d、e），其肾脏由于受压力影响，开始向下、后位移，前后径均有不同程度的变窄，其中16例NB患儿发生肾轴旋转，8例NB患儿的肾盂肾盏开始扩张，10例NB患儿的肝脏及肝门结构上扬，10例NB患儿胰腺开始位移，其位移方向为向前或向上，此外还发现其血管、膀胱以及胃肠道都受到压力影响被迫位移。36例腹膜后淋巴结位移NB患儿，其表现为腹主动脉、膈角旁及肾门附近软组织肿大，并伴有融合趋势，增强则呈现平衡那个增强或不平衡圆状增强（图1c）。30例NB患儿的腹腔干、下腔静脉、腹主动脉及肾静、动脉被位移或环绕（图1b、d、e）。8例NB患儿右侧肾上腺NB直接浸润肝脏，4例NB患儿直接浸润肾脏，4例NB患儿骨转移，6例NB患儿髂腰肌腰大肌以及血管被浸润。
2.3 免疫组化、病理结果
本组56例NB患儿镜下病理学相同点为：NB患儿的肿瘤通常呈现卵圆形，核大，核色过深，脑浆偏少，呈瓣样组合，并伴有坏死、钙化以及出血。本组56例NB患儿免疫组化标记如表1所示。
3 讨论
NB在CT平扫下一般表现为无规律且组织肿块偏大，边界划分不明显亦无显著包膜，同时呈现生长浸润，易导致出现坏死或囊变[6]。本组56例NB患儿，其中46例（82.1%）出现了肿瘤钙化，其肿块偏大且超越中线延伸至对侧，并围绕腹膜后的大血管。本组56例NB患儿，其中26例（46.4%）的肿瘤有征象，侵入患儿肝脏或椎管，在增强扫描后，NB患儿肿块呈现不规则轻度或中度增强，但NB患儿坏死区却并无增强，因此，增强扫描能证实NB患儿的肿瘤对血管的围绕程度以及患儿的脏器轮廓是否健全，如肾脏被浸润就会导致小儿肾积水，并使NB患儿引发腹膜后淋巴结肿大。综上所述，NB在CT表现特性明显，因此，使用CT检测能科学有效的定位和定性NB的病理学临床特性，为掌握和诊断NB提供了重要依据，值得临床推广应用。
参考文献
[1]林岚, 王纾宜, 王坚.儿童头面部胚胎性横纹肌肉瘤的临床病理特点及预后分析[J].中国循证儿科杂志, 2008, 3 (5) :278-280.
[2]雷延成, 王娅宁, 段顺生, 等.小儿腹膜后神经母细胞瘤的CT特征及鉴别诊断[J].实用医学杂志, 2010, 26 (1) :71-73.
[3]沈桂萍, 曾晓华, 阳昱恒, 等.小脑髓母细胞瘤的MRI影像特征表现及鉴别诊断[J].中国中西医结合影像学杂志, 2012, 10 (2) :412-414.
[4]仲卿雯, 邵虹, 杜隽, 等.CT、超声和骨显像的联合应用对儿童神经母细胞瘤临床分期的研究[J].中国医学计算机成像杂志, 2008, 14 (2) :919-921.
[5]吕宽, 刘春雨, 吴志兴, 等.放射性核素骨显像在神经母细胞瘤中的研究价值[J].医学影像学杂志, 2008, 18 (5) :429-431.
水产品免疫组化研究 第6篇
1 资料与方法
1.1一般资料:选取我院2012年1月至2013年12月120例胃肠道间叶源性肿瘤患者, 其中出现在食道处12例、胃部72例、小肠28例、结肠6例及肠系膜21例;年龄25~73岁, 平均年龄 (53.6±3.8) 岁。
1.2方法:实施免疫组化标记时采取SP法, 6种抗体分别为CD117、CD34、Vimetin、SMA、S-100、Bcl-2, 而其克隆号分别为1DC3、QBEnd/10、V9、S1、1A4、100/D5。6种抗体直接性予以工作液, 选取的阴性对照均为PBS, 其阳性对照则为CD34, Vimentin、Bcl-2均属于扁桃体, CD117将小细胞肺癌用作阳性对照, S-100将神经纤维瘤用作阳性对照, SMA将子宫平滑肌瘤用作阳性对照。免疫组化判定指标[2]:将>5%瘤细胞的胞质表达定为阳性, 其中CD117、CD34均能够一起产生胞膜表达性质。
2 结 果
在所选取的120例GIMT患者肿瘤直径0.5~15 cm, 呈现结节状或分叶状, 颜色分为灰白灰红, 包膜无完整性或完全无包膜, 大部分具有清晰界限, 切面呈现灰白色, 其中有些存在出血, 坏死或囊性病变及黏液病变现象。肿瘤大部分出现在黏膜下层、肌层位置。观察组织学形态发现, 胃肠道间叶源性肿瘤细胞存在两种基本细胞状态, 梭形细胞和上皮样细胞, 本文选取的120例GIMT患者中, 96例主要是梭形细胞, 6例主要是上皮样细胞, 18例梭形细胞及上皮样细胞均可见, GIMT间质发生黏液变式玻璃样病变, 有的存在出血、坏死现象。
对患者原病理诊断与病变位置进行分析, 食管12例, 其中诊断为平滑肌肿瘤10例, GIST为2例;胃部72例, 平滑肌肿瘤60例, GIST为12例;小肠28例, 其中平滑肌肿瘤20例, GIST为8例;结肠6例, 其中平滑肌肿瘤4例, GIST为2例;肠系膜2例, 均为神经源肿瘤;120例GIMT中, 诊断为平滑肌肿瘤者94例, 神经源肿瘤2例, GIST为24例。
120例GIMT经免疫组化后诊断病变位置, 食道12例, 其中平滑肌肿瘤10例, GIST为2例;胃部72例, 其中平滑肌肿瘤4例, GIST为68例;胃部72例, 平滑肌肿瘤4例, GIST为68例;小肠28例, 其中平滑肌肿瘤2例, 神经源肿瘤2例, GIST为24例;结肠6例, 均为GIST;肠系膜2例, 均为GIST。总之120例GIMT中平滑肌肿瘤16例, GIST为102例。
在102例GIST中, 检测其不同位置GIST免疫组化结果:食管2例, Vimetin2例, SMA2例;胃部68例, CD117有66例, CD34为66例, Vimetin为58例, SMA为18例, S-100为8例, Bcl-2为48例;小肠24例, CD117有18例, CD34为12例, Vimetin为22例, SMA为8例, S-100为2例, Bcl-2为20例;大肠6例, CD117有6例, CD34为4例, Vimetin为6例, SMA为2例, Bcl-2为6例;肠系膜2例, CD117有2例, Vimetin为2例, S-100为2例, Bcl-2为2例。总之, CD117有92例, CD34为82例, Vimetin为88例, SMA为30例, S-100为12例, Bcl-2为76例。CD117阳性率90.2%, CD34阳性率80.4%, Vimetin阳性率86.3%, Bcl-2阳性率74.5%, SMA阳性率29.4%, S-100阳性率11.7%, CD117与CD34具有最高表达率, 然后为Vimetin、Bcl-2, 76例Bcl-2阳性患者中, 60例属于交界性和恶性GIST, 16例则是良性GIST。
3 讨 论
有资料显示, GIST为GIMT的76%, 本文研究结果为85%。因为GIST并无较特异组织学形态, 且存在不固定形态改变情况, 通过光镜HE染色并未发现具有独特性质的形态学[2], 因此过去其诊断成GIMT或直接按照平滑肌肿瘤、神经鞘瘤类型处理, 随着临床研究发现, 真正出现在胃肠道部位平滑肌源性或神经源性肿瘤概率极低, 进行GIST临床诊断时应用CD117和 (或) CD34呈现阳性, SMA、S-100大多数呈现阴性作为指标, CD117和CD34呈现阴性而SMA呈现阳性则属于平滑肌源性肿瘤, 当CD117和CD34均呈现阴性时属于神经源性肿瘤。因为GIST存在多类型形态结构, 与其余消化道肿瘤比较具有较高相似性, 极易发生误诊现象。胃肠道间质瘤属于间叶源性肿瘤的一种类型, 在临床中主要表达为CD117、CD34等在排除其他间叶源性肿瘤, 每年发病率达到1~2例/10万, 而且有越来越高的趋势, 导致此结果主要因素为疾病的误诊于漏诊[4]。若使得胃肠道间质瘤区别与其他类型间叶来源肿瘤, 需将术后病理检查与免疫组化结果相结合。一般肿瘤越大恶性越严重。CD117检测胃肠道间质瘤时具有高表达, 为诊断胃肠道间质瘤疾病的金标准。在CD34呈现阳性及阴性的GIST中均存在一定表达, 阳性率达到81%, 有的会出现100%表达。
总之, GIMT中GIST为绝大部分, 为确保GIST具有较高诊断率, 对胃肠道间质瘤进行良恶性诊断时不可只根据形态学判定, 光镜组织形态应用基础上需与免疫组化结果相结合, 联合一组抗体, 防止GIST诊断出现片面。
参考文献
[1]王春伟, 宁建文, 王子薇, 等.胃肠道间叶源性肿瘤的免疫组化特征分析[J].浙江医学, 2008, 30 (3) :267-269.
[2]王新云, 孙红, 邱菊, 等.胃肠道间质瘤51例临床病理及免疫组化研究[J].中华肿瘤防治杂志, 2010, 17 (1) :79-80.
[3]邓洪强, 何纯刚, 吴鸿根, 等.胃肠道间质瘤106例的临床病理分析[J].广西医学, 2013, 35 (7) :852-854.
水产品免疫组化研究 第7篇
1 乳腺X线摄影
乳腺X线摄影自20世纪60年代使用至今, 由于其方法简单、方便、费用较低已成为临床诊断和乳腺普查的首选方法, 乳腺癌诊断典型的X线征象包括直接征象和间接征象, 直接征象主要包括: (1) 肿瘤结节与局部致密:肿瘤结节病理基础为肿瘤细胞向周围浸润以及对肿瘤结缔组织的增殖性反应, 形成X线影像上可以见到的肿块影。有时影像所见不符合一肿块的标准, 表现为一局限性的不对称致密影, 但是边缘有向外侧浸润扩展的趋势, 容易漏诊或是误诊为良性。 (2) 钙化:关于乳腺癌钙化发生的机制, 尚无统一认识, 目前存在两种观点[1]:一种是坏死细胞矿化论, 认为是因为肿瘤组织缺乏血供坏死而形成的磷酸钙盐沉积。另一种观点是细胞活跃分泌学说, 认为癌细胞钙质新陈代谢增强, 不断分泌钙质, 形成钙质沉着, 渐渐堆成不同大小和密度的钙化点, 多数学者认为X线平片上钙化灶大于等于5枚/cm2就可定义为簇。钙化灶是早期乳腺癌极为重要的X线表现, 甚至是唯一的恶性征象, 也是钼靶X线最大的优势, 根据美国放射学院的Bl.RADS诊断标准[2], 良性钙化较大而粗糙且边界光滑, 高度恶性可能的钙化有多形性簇形钙化 (颗粒点状钙化) , 大小形态不一, 直径小于0.5 mm, 多发生于癌周或坏死区;线样或线样分支钙化 (分支铸型钙化) , 表现为细条样或是多形性钙化, 常见分支分叉、不连续、直径小于0.5 mm, 这类钙化多是在被癌侵犯的导管腔内形成。钙化和肿块是乳腺癌的最基本征象。 (3) 毛刺征:毛刺指以肿块为中心, 向周围呈放射状分布的条索状致密影或肿块不明显而表现为由一点发出的星芒状影, 通常见于恶性肿瘤或是浸润区的边缘。根据胡永升[3]的研究, 按毛刺形成的病理因素不同, 分为3种类型: (1) 淋巴管型毛刺, 从淋巴管向外侧浸润, 形成放射状的条状致密影; (2) 导管型毛刺, 导管受到癌细胞的浸润所致, 毛刺既粗且长; (3) 血管型毛刺, 由肿瘤供血血管、部分新生血管以及扩张的毛细血管组成的以肿瘤为中心向周围呈放射状分布的血管群。Alexander等[4]追踪201例乳腺癌患者7年, 结果显示当肿块直径小于1 cm并且伴毛刺征时, 患者生存率为100%, 肿块直径1~1.4 cm并伴有毛刺征患者生存率为98.1%, 较大肿块且边界光整者生存率最低, 病死率为55.6%。Lamb等[5]对120例乳腺导管浸润癌的钼靶X线平片进行分析, 结果显示Ⅲ级导管浸润癌组毛刺征的阳性率为27%, Ⅰ级导管浸润癌组阳性率为72%, 两者差异有统计学意义。所以当乳腺X线平片出现毛刺征时, 可以认为肿瘤有较好的分化以及预后。乳腺癌X线表现的间接征象包括: (1) 乳头内陷和皮肤增厚, 这两个征象常相伴出现, 是由于肿瘤累及悬韧带以及淋巴管回流障碍而导致; (2) 周围血运增加, 肿瘤血供增加, 一般出现在中晚期乳腺癌中; (3) 淋巴结肿大, 钼靶检查并不能完全显示腋窝各群淋巴结情况, 所以并不能将其作为排除乳腺癌淋巴结转移的手段。
2 乳腺癌X线表现与免疫组化标记物之间的关系
2.1 ER、PR表达与乳腺癌钼靶X线表现之间关系
1962年Jensen等[6]发现人类乳腺癌组织中含有雌激素受体和孕激素受体, 并证实PR是雌二醇E2和ER结合诱导下的产物。ER/PR的过高表达与肿瘤的发生有相关性, 在临床上ER/PR受体的表达率可以用来预测乳腺癌内分泌治疗效果, ER/PR阴性乳腺癌分化差, 侵袭性强, 恶性程度高[7]。Putti等[8]研究表明ER (-) 患者较ER (+) 肿瘤侵袭性高, 内分泌治疗效果以及预后差, Ali Pourzand等[9]研究105例乳腺癌患者, 提出不同年龄段的PR表达率有差别, 40岁以下的患者PR表达率较高, 孕激素受体阴性的患者更可能有Her-2的高表达, ER/PR与淋巴结的转移无明显相关。
Paradiso等[10]研究乳腺癌的X线形态学表现, 发现毛刺状肿瘤相较边缘规则的肿瘤中ER阳性率更高, 且与患者的绝经状态无关, 仅见微小钙化的肿瘤中PR阳性率较高 (83%) , 认为乳腺X线征象与乳腺癌的生物学特征间的关系有潜在的临床价值, 并可促进该方面更深入的研究。微小钙化较常发生于直径小于1 cm的肿瘤[4]。Jiang等[11]研究397例乳腺癌钼靶X线平片, 发现毛刺组的ER/PR阳性表达率 (73%/71%) 明显升高, 而ER/PR阳性表达率与钙化征的出现呈轻度负相关, 但差异无统计学意义。朱大玲等[12]认为毛刺征的出现与ER阳性表达率呈正相关, 与PR阳性表达率无相关性;ER/PR表达率与肿块征象之间的关系存在着争议。部分学者认为有无肿块与ER/PR表达率无关[13,14], 还有部分学者提出ER/PR与肿块的存在均呈负相关[15]。而对于肿块的大小与ER/PR表达率之间的关系, 一般均支持肿块的大小与ER/PR表达率无关[14]。
2.2 her-2表达强度与乳腺癌钼靶X线表现之间的关系
her-2是跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体, 约20%~35%的乳腺癌患者的her-2呈过度表达状态[16], 提示her-2可能在肿瘤的发生过程中起作用, her-2过度表达导致细胞恶性转化, 可能与诱导肿瘤坏死因子-α抗性即通过不同的传导通路最终导致细胞增殖有关。her-2与ER之间的关系存在争议, 大部分研究结果提示它们呈负相关关系[17,18], 也有部分研究提出her-2与ER表达无关[9,19]。乳腺癌组织中her-2的高水平表达预示了患者预后不佳, Jensen等[20]研究了100例转移性乳腺癌患者her-2血清水平与转移方式、化疗效果和总生存率的关系, 结果表明her-2高水平的表达与肿瘤的腋窝淋巴结转移以及脏器转移 (尤其是肝脏转移) 呈明显正相关, 较her-2阴性患者化疗效果差、平均生存时间短。Carey等[21]经过11年随访调查861例乳腺癌患者, ER (-) her-2 (+) 组生存率为52%为所有分组类型中最低 (P<0.05) 。Wang等[22]研究56例乳腺癌患者钼靶X线征象, 结果表明当ER表达阴性时, her (-) 较her (+) 患者毛刺以及钙化征象出现比例高 (P<0.05) , her-2表达率与肿块大小无关。
2.3 Ki-67表达与乳腺癌钼靶X线表现之间的关系
Ki-67是Gerde于1983年从霍奇金病细胞系L428的粗核成分免疫鼠制备而命名。它开始表达于细胞周期的G1期, S期及G2达增加, 至M期达高峰, 在细胞分裂晚期很快消失, 由于其半衰期短, Ki-67 (非组蛋白核蛋白) 成为可靠、全面反映细胞群体增殖活性的客观指标, 它的高表达是细胞增殖活跃的重要标记, 可反映肿瘤细胞的增殖活性, 是乳腺癌一项重要的预后指标。Wang等[23]对2118例浸润性乳腺癌患者进行回顾性研究, 结果证实Ki-67高表达是乳腺癌复发的高危因素, Kintman等[24]提出Ki-67的预后作用需要建立在雌激素受体阴性以及淋巴结转移阴性的基础上。李宝江等[25]研究显示Ki-67表达与乳腺癌肿瘤临床分期有关, 即分期越晚, Ki-67阳性率越高 (P<0.05) , 而与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移状况无显著性相关 (P>0.05) 。朴正日等[26]的研究结果也支持Ki-67与临床分期呈正相关。近年来, Ki-67与乳腺癌新辅助化疗间的关系成为研究热点, 国外一些研究提出Ki-67在新辅助化疗后表达强度的降低, 可以用来评估化疗疗效、预测无病生存率, 并且效果优于her-2的预测作用[27,28]。部分研究结果认为Ki-67的表达与ER/PR的表达呈负相关[28], 也有一些研究结果提出PR表达率与Ki-67表达率无关[17]。
