神奇的转基因动物（精选10篇）
神奇的转基因动物 第1篇
自1982年转基因鼠问世以来, 转基因动物研究在许多领域都取得了令人瞩目的成就。一般来讲, 根据不同的目的, 转基因动物操作可以简单地划分为四种类型:疾病型转基因动物;利用转基因动物制药;动物改良型;基础生物学研究。
1. 疾病型转基因动物
用基因转移技术, 增强动物抗病力的研究, 也很鼓舞人心。导入抗病或抗寄生虫的外源基因, 牛便不怕“疯牛病”, 猪便不怕瘟从而使畜牧业“旱涝保收”, 成为“黄金”产业。
美国研究人员通过一项新技术, 使得老鼠具有了抵抗各种癌症的能力, 而这个科学突破将使癌症患者有望接受无副作用的治疗。这些老鼠体内产生的一种蛋白质是未来疗法的关键, 它能消灭肿瘤细胞, 却不会伤害体内的健康组织。通常情况下, 一般的癌症治疗会使患者出现疼痛、恶心和掉头发等情况。科学家们希望有朝一日把这种蛋白质用于癌症患者身上, 使他们摆脱这些痛苦。
2. 利用转基因动物制药
你听说过6000美元1磅的羊奶吗?听说过身价30万美元的羊吗?听说过每年产奶价值数十亿美元的奶牛吗?这不是天方夜谭, 而将变成活生生的事实。
身价百倍的奥秘何在呢?是在于它们是转基因动物, 它们的乳汁中含有“药”, 它们是天然的、无公害的“动物药厂”。利用转基因动物生产蛋白质, 造药, 是全新的生产模式。与细菌、细胞等生物工程制药相比, 它有明显优势:转基因动物的乳汁, 可以方便收集且不损伤动物;目的蛋白质, 已经过动物体内加工和修饰, 不必再进行后加工。有人算过帐, 用传统生物技术生产的产品, 成本需8005000美元的, 利用转基因动物只需0.5美元。美国每年要有600万人输血, 才够本国血友病人所需的凝血因子, 而以后只要2头转基因牛就可代劳。如果有300万头转基因猪, 就可让全人类用血再无后顾之忧再不用人输出血液, 也不用担心输了血后感染上艾滋病等传染病。
3. 动物改良型
转基因动物在农业领域的应用主要表现在提高动物生长率方面。1985年, 中国科学院水生生物所的朱作言等首次用人类生长素 (hGH) 构建了转基因鱼。F1代转基因鱼类的生长速度为转基因鱼的2倍。1990年, 中国农业大学培育的转基因猪, 生长速度超出对照组40%。1998年, 美国培育出IGFl转基因猪群, 其脂肪减少10%, 瘦肉率增加6%8%。转基因技术不仅可以培育出体积大、生长快的动物, 还可以培育出微型动物。2000年, Uchidal等研制出微型猪, 生长快、易处理、饲料成本低, 使其更加适用于药物筛选和疾病研究。
携带细菌基因的转基因猪可产生更清洁、污染更少的绿肥。这些基因, 可帮助猪除去食物中的磷酸盐, 从而有助减少猪畜牧业中产生的对农业有害的废物。
在加拿大圭尔夫大学的猪研究小组成员Serge Golovan说:“植物含有许多有机磷, 而普通猪不能使用它。”没吸收的磷流散在环境中, 危害溪流中的生物, 产生温室气体。
转基因猪经过遗传修饰, 在唾液中产生肌醇六磷酸酶, 从而可以吸收植物中的磷, 而普通猪是不能消化磷的。对转基因猪产生的肥料进行分析发现, 它们比普通猪的排磷量减少了75%。
4. 生物材料上的应用
我们所有人都听说过蜘蛛侠, 但是你听过蜘蛛山羊吗?这种转基因山羊是独一无二的, 因为它们能产生普通的蜘蛛丝。这种构成蜘蛛网的同样物质由它们的乳腺产生。
很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢”, 有着超强的抗张强度。研究人员称, 如果把很多蜘蛛丝拧成一股绳的话, 它足够强韧, 可制成防弹背心、降落伞绳, 或者从飞机到航母等设备。蜘蛛丝还可被制成人造韧带和人造腱, 支撑组织、骨骼和神经细胞, 让它们在生长期间保持稳定。随着细胞的逐渐生长, 这些人造丝部分会逐渐分解。但蜘蛛与蚕不同, 把很多蜘蛛放在一起它们会彼此蚕食。因此, 科学家始终致力于想出集中生产蜘蛛丝的方法。
帮助“生产”这些山羊的怀俄明大学分子生物学家兰迪-刘易斯说:“从概念上讲, 这个过程非常简单。用于丝蛋白的蜘蛛丝基因与控制蛋白质构成组织的山羊的DNA有关。在这种情况下, 它是乳腺, 只形成于哺乳期。然后, 细胞与卵结合生成胚胎, 胚胎有着合成其DNA的基因。当母羊开始分泌乳汁时丝蛋白就产生了。”
转基因动物还将是人类最好的“器官库”, 提供从皮肤、角膜, 到心、肝、肾等几乎所有的“零件”, 让器官移植专家有充分施展才华的用武之地, 让体内部分“零部件”出了故障的病人重获生的希望。
由于前景莫测, 转基因物种培植被各国法规严格控制, 要求研究者制作出的动物必须具有可证实的科研和医学价值。动物研究本身就充满争议, 2009年5月份的美国民意测验显示, 有43%的民众认为在动物身上进行医学研究“在道义上是不可接受的”。尽管如此, 转基因动物涵盖了来自各个动物种群的物种, 它们在对抗疾病和改善环境方面表现出更强的适应性。
摘要：转基因动物研究作为一个崭新的学科, 已经成为生命科学研究和讨论的热点, 本文对转基因动物的几种研究方向进行了介绍, 使人们更好地了解转基因动物的发展。
神奇的动物乐园日记 第2篇
树林是小动物们的世界。你瞧！刚走进树木的我就看见了一只可爱的小松鼠正在抱着一只松果开心地啃着，它一身桔红色的毛，一条长长的大尾巴，只有脸是黄色的，真可爱！
我走着走着，突然觉得脚有点疼，往下一看，原来是只一身棕色毛的.小刺猬在我脚边滚来滚去。好像一个长满刺的棕色球，身上还有几个果子。我继续往前走，时不时听到几声鸟叫，只见几个动物爱好者债券照相机不停地拍照，把小动物们的皮毛照得亮闪闪的。
其中有几个小动物还以为那些动物爱好者是来抓它们的呢，吓得苍惶而逃，跑得太快都摔倒了。
几只小兔子从洞里跑出来，看看怎么回事，它们一身雪白雪白的毛在阳光下一闪一闪的，像冬天下的一堆雪还没有融化。。。。。。
瞧！树木里的小动物还真不少，有狡猾的小狐狸、笨笨的小熊、动作灵活的小猴子等等。
适应高海拔的神奇基因 第3篇
数千年前，一个罕见的基因变异（该基因主要用于身体血红蛋白的制造，而血红蛋白会携带血液中的氧气），在迁移到高原的藏族人身上普遍出现。这一变异使他们在海拔15000英尺甚至更高的地方也能生存下来，而普通人在高海拔地区血液会变得粘稠而导致心血管疾病。
“我们有非常明确的证据表明，这种基因来自丹尼索瓦人。”丹尼索瓦人是一个神秘的人类种族，大约在40000?50000年前已灭绝，大约在同一时间，更为知名的尼安德特人正承受着来自现代智人的压力。伯克利大学综合生物学教授拉斯木斯·尼尔森说：“这非常明确且直接表明了，人类通过获取其他种族的基因进化从而适应一个新的环境。”
这个基因被称为EPAS1，在血液含氧量下降时会被激活，从而生成更多的血红蛋白。这一基因有“超级运动员”的美誉，因为在低海拔地区它能帮助运动员迅速提高血液中血红蛋白的携氧能力，增加他们的耐力。那些携带EPAS1正常基因的人，在进入高原地区后，血液会因过多的红血球而变得黏稠，并引发高血压和心脏病。这类孕妇在高原地区也容易产下体重偏轻、发育不全的婴儿，而且初生婴儿的死亡率特别高。相反，那些生活在高原地区并拥有EPAS1变异基因的人，血液中的红血球仅有轻微升高，不会出现普通人在超过13000英尺海拔时会发生的不良反应。
“我们发现藏族人拥有的部分EPAS1基因几乎与丹尼索瓦人一致，而完全不同于其他的人种。”尼尔森说，“我们能够做一个统计分析来证明这基因一定是来自丹尼索瓦人，没有其他的可能性能够解释这数据。”
基于众多的汉族人和藏族人的基因组测序，研究人员第一次提及高海拔地区的藏民普遍拥有EPAS1变异基因是在2010年。尼尔森和他的同事认为，能够适应含氧量低于40%的青藏高原是大自然的选择。因为那些没有变异基因的人将会被自然淘汰而死去。研究表明，高达87%的藏民拥有变异基因，相比之下祖先相同的汉族人中只有9%拥有变异基因。
随后尼尔森和他的同事对另外40个藏族人和40个汉族人进行基因测序。数据表明，EPAS1变异基因是如此地特殊只可能来自于丹尼索瓦人。除了在汉族中有较低的出现频率，在其他人群中应该也不会有，甚至含有5%丹尼索瓦人基因组的美拉尼西亚人体内也没有这种基因。一份高质量的丹尼索瓦人基因组序列在2012年发表了。
动物转基因技术的研究现状与应用 第4篇
关键词：转基因技术,方法,研究现状
转基因动物 (transgenic animal) 指通过基因工程技术将目的基因导入生殖细胞、早期胚胎干细胞和早期胚胎, 并整合到受体细胞的基因组中, 它们经过各种发育途径形成所有细胞都包含目的基因的个体, 称转基因动物 (也称个体表达系统) 。导入的基因称为转入基因 (transgene) , 而整个技术则称为转基因技术 (transgenic technology或transgenesis) [1]。现代转基因动物 (txansgenic animal) 研究始于20世纪80年代以后, 1980年, Gordon等首次获得转基因小鼠目前除转基因小鼠外, 转基因兔、绵羊、猪、牛及转基因山羊、转基因鸡、转基因大鼠、转基因猴等陆续育成[2,3]。本文将从转基因动物的原理、主要方法和应用等方面作一综述。
1 转基因技术的一般方法
能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递, 主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。迄今为止, 能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几种[4]:
1.1 原核期胚胎的显微注射法 (Mi-crojection)
该法由美国人Gordon发明, 其主要步骤包括: (1) 分离、克隆和重组外源基因, 构建载体; (2) 将融合基因注入受精卵的原核 (一般是雄原核) ; (3) 将微注射后的受精卵移入假孕母畜的输卵管继续发育。Palmiter等 (1982) 将带有小鼠金属硫蛋白I基因启动子的大鼠生长激素基因导入小鼠的受精卵, 获得“巨型小鼠”, 在生命科学领域引起了不小的轰动。按照转基因小鼠的思路, 转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。显微注射方法相对简单, 整合率高, 是目前应用比较广泛, 效果比较稳定的制作转基因动物的方法之一。但该方法的整合位点随机, 整合一般是多拷贝首尾串联相接, 不利于研究基因的结构、功能及表达调控。
1.2 逆转录病毒载体法
1.2.1 逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎:
该方法主要利用逆转录病毒的长末端重复序列 (long terminal repeats, LTRs) 区域具有转录启动子活性以及逆转录病毒可以直接整合到宿主染色体上的特点, 将外源基因连接到LTRs下部, 构建重组载体, 直接感染受精卵或微注入囊胚腔中。达到外源基因在宿主染色体上的整合、表达。Salter和Haskell等分别用此方法作出了转基因鸡和牛[5]。
1.2.2 逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞:
Anthony等[6] (1998) 对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎的方法进行了改进。他认为逆转录病毒载体介导的基因整合的关键在于细胞分裂时出现核膜分解。有丝分裂时核膜降解的时间很短。细胞分裂完成后, 核膜很快重新形成。而处于减数分裂中期 (MⅡ) 的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞。这为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了更大的可能性。研究者利用该方法生产出了4头转乙肝表面抗原基因牛, 外源基因在宿主基因组中整合的成功率为100%。逆转录病毒载体法导入外源基因的感染率高, 宿主范围广, 而且最重要的是外源基因在宿主染色体上以单拷贝整合, 有利于研究基因的结构、功能及表达调控。目前, 这一特性已被广泛应用于基因定位整合等方面的研究中。
1.3 精子载体法
该方法由Brackett最早提出, 其要点是精子直接与外源DNA混合培养, 外源基因可以进入精子头部, 受精后能发育成转基因动物[7]。该方法简单, 但其整合率低, 已采用脂质体包埋法对其进行了改进。其改进方法是将外源DNA在与精子共同孵育之前用脂质体包埋, 脂质体与DNA相互作用形成脂质体-DNA复合体。这种复合体借静电作用吸附于精子表面, 与细胞膜融合, 将外源基因导入细胞并获得表达[8]。这二种方法都是通过人工授精将外源DNA导入卵母细胞, 产生转基因动物。Anthony等[9]尝试了一种新方法:预先将小鼠精子进行破膜处理, 再与外源基因共孵育1 min, 然后将精子的头部显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞, 在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上。该项研究揭示, 精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜, 更有益于转基因动物的获得。
1.4 体细胞核移植技术
世界首例体细胞核移植哺乳动物克隆羊Dolly的诞生, 是转基因动物研究史上的又一重大突破。1997年英国PPI公司与罗丝林研究所的科学家联手通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊[10]。研究者们用人凝血因子IX基因和新霉素抗性基因共同转导绵羊胎儿成纤维细胞, 然后用G4l8筛选和DNA杂交的方法鉴定其中同时整合了上述两个基因的细胞, 以同时整合了两个基因的绵羊胎儿成纤维细胞作核供体, 获得了3只转基因绵羊。Alexander等[11]用非转基因母羊与转基因公羊精子人工授精后怀孕40 d的胎儿成纤维细胞作核供体, 获得了3只转人抗胰蛋白酶基因的奶山羊。毫无疑问体细胞核移植技术可以实现转基因的目的, 并且出生的后代个体100%为转基因个体。这是因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基因的细胞。一旦核移植成功, 就意味着得到了转基因动物。
1.5 胚胎干细胞介导的基因转移
胚胎干细胞 (Embryonic Stem Cells, ES细胞) 是动物早期胚胎 (桑葚胚或囊胚) 或原始生殖细胞 (Primordial Germ Cells, PC-Cs) 在体外经分化抑制培养并传代而筛选出来的具有发育全能性的细胞[12]。ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的高度分化潜能, 当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。将目的基因转移入ES细胞重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ES细胞进行克隆, 可培育转基因个体。目前, 胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟, 在大动物上应用较晚。
2 转基因技术的应用
2.1 在基础理论方面的应用
由于外源动物基因可在转基因动物细胞中整合、表达, 并制约于受体基因背景的调控, 因此, 可把转基因本身当作一个理想的功能标记, 进而在理论实践方面得到应用:可以对基因的结构和功能进行研究, 可以进行组织表达特异性研究, 还可以研究发育过程的特异性表达并进行了有意义的探讨。
2.2 动物抗病育种
利用转基因技术有可能在较短时间内培育出常规方法不能或需长期培育才能育成的品种或种群Rosengard等 (1995) 将人的补体抑制因子-衰退加速因子 (hDAF) 转移至猪胚中, 有27头转基因猪表达hDAF。我国湖北畜牧所与同济医科大学合作。已经获得表达外源hDAF的猪7头使用转基因技术不仅可以加快动物改良进程, 使选择效率提高[13]。1986年, 中国科学家第一次把生长澈素基因成功地转移到金鱼体内, 以后又成功地把人类、小鼠和其他鱼类的基因转移到多种鱼体内[14]。美国科学家也成功地把某种生长基因转移到另一种鱼体内, 转基因鱼生长速度加快了, 体型也变大了, 这就是人们称谓的了“兰色革命”[15]。
2.3 在医学领域中的应用
2.3.1 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型:
在动物转基因技术问世以前, 发现自然突变体几乎是遗传学家获得遗传疾病模型的唯一途径。目前, 遗传学家可以通过精确地失活某些基因或增强某些基因的表达来制作各种各样的研究人类疾病的动物模型, 也可以为研究诸如AIDS这样的疾病提供合适的动物模型。
2.3.2 利用转基因动物生产药用蛋白质:
利用动物反应器进行生产的研究是当前转基因动物研究的热点。作为生物反应器的转基因动物, 主要是将某些对人类医药价值高的蛋白质编码导入动物机体, 使这些转基因动物成为生物反应器, 从这些组织、血、尿中提取表达的产物 (蛋白质) , 用它治疗人的疾病。比如说, 将人凝血因子基因与牛奶蛋白基因结合, 就能在牛乳中提取这种药用蛋白;类似的还有在猪血中产生人的血红素, 而通常产生这类蛋白仅限于人血, 来源有限, 成本昂贵。
美国Genzyml transgenics公司, 利用转基因小鼠、转基因牛、转基因兔和转基因山羊来生产一些医用蛋白质药品已经商品化, 其产率可高达10 g/L乳汁, 个别达35 g/L, 且成本低于细胞培养的产品[16]。
3 小结和展望
神奇的动物们心情随笔 第5篇
幽静的山林里，路边时不时出现不知名花树香气馥郁与清新的森林空气都令我们神清气爽。晨雾刚刚消散，我们行走在林间，两边都是粗壮繁茂的根系与遒劲弯曲的枝桠，让人恍惚间仿佛正身处丛林中探险。
沿途见到了不少珍贵的动物，如白犀牛，它们体型巨大，或卧或躺或站立，嘴巴又宽又平，鼻子上方一前一后长着两只角，眼睛特别小，显得非常威武。犀角是珍贵中药，具有清热、解毒、止血的作用，药用价值极高。
蜂猴，个头很小，长年生长在树上，很少下地，行动缓慢，所以也叫“懒猴”。棕灰色的皮毛正中有一棕褐色脊纹自顶部延伸至尾基部，两只小耳朵隐藏于毛茸茸的圆脑袋中。大大的眼睛圆溜溜的，衬着熊猫般的眼圈，萌萌的，让人好感顿生。手趾肚圆圆的肉肉的`，非常可爱。我们都向它们靠近，迫不及待地想把这些小家伙摄入镜头，管理人员再三告之我们一定要小心，因为懒猴具有毒性，这是极少数哺乳动物才具有的能力。为了获得毒液，懒猴会用手摩擦腋窝附近的腺体，之后将毒液涂在牙齿上。人若被懒猴咬伤，将导致致命的过敏性休克。所以虽然很惹人怜爱，但还是尽量少接触它们，就象越是可爱或是鲜艳的蘑菇越有毒。
远处有几只黑黑的动物在绿色的枝叶间上跳跃腾挪，它们轻握树枝将身体抛出，左右交换，腾空悠荡着前进。由于较远，我们的镜头捕捉不到细致的面部特征。大家正唏嘘不已时，有两只居然看到我们跳过来乞食。它们通体漆黑，只有两颊各有一块白毛，就象两片的络腮胡子，簇状的冠毛显得头顶部尖尖的。两只胳膊特别长，手显得很大，导游告诉我们这就是长臂猿。
神奇的转基因动物 第6篇
关键词：动物转基因技术,转基因牛,新品种培育,生物制药
动物转基因技术在牛生产中的研究应用较晚。1990年,美国Genzyme Transgene公司通过原核显微注射法获得世界上第1头转基因牛。由于牛本身具有生产性能高等优势,因而吸引了不少科学家对其进行研究。特别是在1997年,英国罗斯林研究所首次利用羊体细胞获得克隆羊多莉,表明高等动物可以由无性生殖来繁殖[1]。2005年,抗乳房炎转基因牛诞生[2]。2006年,多不饱和脂肪酸转基因克隆猪的培育成功,标志着转基因动物育种进入了新的发展阶段[3]。2009年,生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生[4],是转基因动物生产药用蛋白的有一个里程碑。
1 转基因牛的研究进展
1.1 国外研究进展
1990年,荷兰Pharming公司通过显微注射法获得世界上第1头转入有人乳铁蛋白基因的公牛。该公牛与非转基因母牛繁殖的转基因后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白。
1998年,日本科学家Cibelli等人以子宫内膜细胞为核供体获得了世界首例克隆牛。同年,他们以胎儿成纤维细胞为核供体,用同样的方法获得了携带半乳糖苷酶外源基因转基因牛。
2001年,Krimpenfort等人利用显微注射技术向牛体外受精早期胚胎注射外源基因,通过非外科手术法进行胚胎移植,在所生的19头牛中,经检测有2头为转基因牛。
2002年,Berkel等人利用牛的酪蛋白启动子与人乳铁蛋白基因组的6.2 kb片段构建转基因载体,通过显微注射技术获得转基因牛。
2003年,日本科学家Yutaka等人利用基因敲除的方法获得了α-1,3半乳糖苷转基因酶基因单等位基因灭活的转基因牛,首次在牛中实现了基因打靶[5]。
2005年,Donovan等人将编码溶葡萄球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛,证明在其乳腺中表达的溶葡萄球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎[6]。
1.2 国内研究进展
1999年,上海医学遗传研究所黄淑帧等人利用向体外受精的早期胚胎中注射外源基因的方法成功培育出了我国第1头转入有人血清白蛋白基因的转基因牛。
20022006年,中国农业大学李宁等人利用转基因体细胞克隆技术,获得了转基因克隆奶牛49头,存活29头,人乳铁蛋白、人α乳清蛋白和人溶菌酶在转基因牛乳中的平均表达量达到了国际上最好水平。
2003年,中国农业大学李宁课题组培育出10头体细胞克隆牛,其中包括“乐娃”和“岩娃”2头转基因牛。“乐娃”转入了绿色荧光蛋白基因,“岩娃”创造了2个世界首次[首次转有人岩藻糖转移酶基因;首次在同一头牛中转有3种外源基因(绿色荧光蛋白基因、人岩藻糖转移酶基因和新霉素抗性基因)]。这标志着我国转基因体细胞克隆牛的生产技术体系已趋于成熟。
2006年,中国工程院院士旭日干指导完成的体细胞克隆牛和转基因克隆牛技术通过了专家鉴定,该项目获得内蒙古首批3头体细胞克隆牛、首例胚胎冷冻保存的体细胞克隆牛和首例携带有人胰岛素基因的转基因克隆牛。同年,世界首例抗疯牛病转基因克隆牛在中国山东淄博诞生。
2010年,国家转基因肉牛育种课题组主要成员在国家肉牛改良中心良种牛繁育场,实施了首批转ω-6脂肪酸脱氢酶基因肉牛胚胎移植。同年,内蒙古大学动物研究中心与内蒙古科维尔有限公司合作培育出了产肉量高、肉质优良的转基因克隆肉牛。
2 转基因牛的应用
2.1 研究基因功能
通过转基因技术可以精确地失活或增强某些基因的表达,研究基因功能、制作各种研究人类疾病的动物模型。利用转基因技术建立人类疾病的动物模型比其他方法更有优势,可以在动物遗传背景的基础上,通过改变某些基因的表达水平而实现,用以研究外源基因在整个动物中的表达调控规律,从而对人类疾病的病因、发病机理和治疗产生极大的促进作用。
日本科学家Y.Kuroiwa等[7]将微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)与体细胞克隆技术结合起来,把含有整个人类免疫球蛋白重链基因IgH和轻链Igλ的染色体片段转入牛的原代胎儿成纤维细胞,获得了4只健康存活的转基因克隆牛,在它们的血液中能不同程度表达人类多克隆抗体,这些转染色体牛无疑会极大推进利用生物反应器大量生产人源化的抗体、酶、牛奶和其他药用蛋白的研究工作。
2.2 生物制药
通过牛乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白,一直是转基因动物研究的重点和热点。从1987年Gordon等人在转基因小鼠乳汁中得到人组织型纤维蛋白溶酶原激活因子,到现在已有数十种人体蛋白在家畜乳腺中表达,可用于治疗人类相关疾病。
1990年,荷兰Pharming公司用酪蛋白启动子和人乳铁蛋白(HLF)的cDNA构建了转基因载体,通过显微注射法获得世界第1头转基因公牛,该公牛与非转基因母牛繁殖的转基因后代中1/4后代母牛乳汁中表达了人乳铁蛋白。
20022006年,中国农业大学李宁等人利用转基因体细胞克隆技术,获得了转基因克隆奶牛,人乳铁蛋白在转基因牛奶中平均表达量达到3.43 g/L, 人α乳清蛋白表达量也达到1.55 g/L,人溶菌酶在转基因牛乳中含量达到1.50 g/L以上,这些重组蛋白表达量达到了国际最高水平。
近十年来,在利用转基因技术制取新药方面取得很大成就,目前已在牛乳汁中生产出一些人类蛋白药物,如抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、乳铁蛋白、胶原蛋白、糖基转移酶等。
2.3 防治疾病
2003年,中国农业大学李宁等人首次将人岩藻糖转移酶基因植入牛的基因组内,使牛奶中含有岩藻糖抗原,这种牛奶可作为口服药,用来防止各种胃病。
2004年,日本和美国联手利用基因工程技术培育出对疯牛病具有免疫力的牛,这种转基因牛不携带普里昂蛋白或其他传染性蛋白。
2005年,Donovan等人将编码溶葡萄球菌酶的基因转入奶牛基因组中获得转基因牛,证明在其乳腺中表达的溶葡萄球菌酶可以有效预防由葡萄球菌引起的乳房炎。据报道,转基因牛葡萄球菌感染率仅为14%,而非转基因牛感染率可达71%[8]。
2006年,Pfeife等人的牛胚胎研究结果证明,利用RNA技术能够下调朊病毒基因的表达,这为以后培育抗瘙痒病的转基因家畜提供了依据[9]。
2006年,莱阳农学院董雅娟等人与日本山口大学合作,成功地培育出2头转有抗疯牛病基因的转基因奶牛。2007年,该研究组的J.A.Richt等[10]通过基因打靶技术对PRNP基因双位点灭活,获得了存活2年以上的转基因牛。这些牛在临床解剖、生理发育、组织病理和生殖等方面都很正常,而且在体外试验中能很好抵抗疯牛病的传染。这为生产不含朊蛋白的牛肉、奶制品提供了一种很好的方法。
2.4 改良品种
转基因技术可用于改造动物的基因组,提高家畜的生长速度、瘦肉率,改善肉质;提高饲料的利用率和抗病力等经济性状;提高选择效率,而且不受有性繁殖的限制。 2003年,Brophy等人在奶牛的胚胎细胞中加入了2种额外的基因,即β-酪蛋白和К-酪蛋白,由此培育的转基因奶牛所产的牛奶中β-酪蛋白含量提高了20%,К-酪蛋白提高了1倍。
研究人员利用转基因技术把有用基因转移到肉牛中,使肉牛带有外源基因,且能在后代中表达出来,对肉牛业的发展和人们生活水平的提高有重要作用。
3 问题与展望
目前,转基因动物的应用还不广泛,究其原因,主要是转基因的效率偏低、成本较高,建立优质转基因动物品系需要的时间太长。今后,研究重点还应集中在提高现有技术水平上,以及建立更加简便、经济、实用的转基因技术,生产出有生产应用价值且外源基因稳定遗传的健康动物。 随着动物转基因技术的不断进步,它将是21世纪生物工程技术领域最活跃、最具有应用价值的项目之一。转基因动物在开发动物乳腺生物反应器、提高动物经济性状、医药卫生、生物制药、家畜改良等方面的应用前景会更加广阔。
参考文献
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神奇的转基因动物 第7篇
关键词：哈佛鼠,转基因动物,动物专利,生物科技专利
转基因又称基因工程或基因修饰 (genetic modification) , 是指将能够表达相应性状的基因片断直接移植到目标品种的基因组中, 从而使目标品种生物表现出某些在自然状态下并不具有的性状的行为。转基因动物就是用实验的方法导入外源基因, 使其在染色体基因内稳定整合并能遗传给后代。目前, 国内外采用的转基因方法主要有:显微注射法、电转移、胚胎干细胞移植法、反转录病毒感染法等。转基因动物通过动物转基因技术把外源基因导入动物的精子、卵细胞或受精卵, 培育出生长周期短、产仔多、泌乳量高, 具有抗病性, 并能在染色体基因组内稳定整合并遗传给后代的动物。从20世纪80年代初人类开发转基因动物已经历了20多年, 从取得的初步成果看, 它已深刻地影响到农业、畜牧业、医药业等许多重要领域, 同时也推动了生命科学的发展。以转基因技术为核心的现代生物技术对未来的经济增长将产生巨大影响, 通过有效的专利保护来获得对技术的暂时垄断已经成为转基因技术产业发展的主要动因。但是, 转基因技术不同于以往传统的工业技术, 其自身的特殊性对专利制度提出了挑战。本文主要通过介绍美国、欧洲、日本和中国对转基因动物的保护现状, 通过对比美国、日本、欧洲以及我国的专利理论与实践, 具体分析我国转基因动物可专利性及用专利保护的可行性。
1 各国关于转基因动物专利的比较分析
多细胞动物是否可予专利到今日仍在世界上大部份国家及地区引起广泛的讨论与争议, 各国尚未对动物品种作出明确的法律上的界定。目前, 在世界范围内仅有匈牙利、罗马尼亚等极少数国家对动物品种提供专利权的保护, 其他大多数国家都在专利法中将动物品种排除在外。不过实践中美日欧等国已经率先对转基因动动物授予了专利。
1.1 美国
比较世界各国的专利法, 美国现行的的专利制度最为激进和少禁忌。1988年4月美国专利与商标办公室 (USPTO) 向一只被称为“哈佛鼠”的转基因老鼠授予专利, 从此开了动物享有专利的先河。
“哈佛鼠”是一只由两位科学家:哈佛大学的Philip Leder与基因技术公司 (Genetech) 的Timothy Stewart两人利用基因技术制造出来的转基因老鼠。该老鼠的基因被改变后, 特别容易患上乳腺癌, 这就为科学家利用这样的老鼠对治疗乳腺癌的研究与试验提供了方便。也因为如此, USPTO认为它已经具备了专利保护的要件, 颁发了世界上第一项遗传工程改造过活体动物专利权哈佛转基因鼠专利。哈佛鼠权利要求的覆盖面十分宽泛, 保护范围涵盖了除人类之外的所有携带上述被激活的致癌基因的哺乳动物。这充分体现了美国倾向于加强对基因技术专利保护, 加强保护发明人利益的政策立场。
1992年美国专利商标局在当年度就授权三件小鼠专利及一件抗病鸡专利, 1997年更达到单年度颁发47件动物专利, 成为动物专利授权峰值。
1.2 欧盟
与美国相比, “哈佛鼠”一案在欧洲专利局审查的过程可称一波三折, 该发明于1985年6月向欧洲专利局提出申请后, 欧洲专利局在1989年7月做出驳回, 申请人于1989年9月提起上诉, 欧洲专利局技术上诉委员会虽然撤销原驳回决定, 并做出原则上可授予专利的决定, 但将“哈佛鼠”是否为动物变异种以及是否违反公认的社会秩序与道德作为问题退回原审查部复审。经复审后, 欧洲专利局 (EPO) 于1991年l0月核准授权, 且在核准通知中史无前例地附加了审查意见。
不过非议并未因专利被授权而终止。获颁专利后, 在异议期内即遭到十六个政府组织, 社会团体、政党及个人提出异议。前后历时八年的授权范围异议一案, 于2001年l1月最后作出决定:“哈佛鼠”欧洲专利仍予维持, 但其申请专利范围予以缩小:从“转基因的非人类哺乳动物”限定到“转基因啮齿类动物”;2004年7月4日至9日, EPO二审程序的上诉技术委员会举行听证会, 对著名的“哈佛鼠”专利权作出了进一步限制, 由“转基因啮齿类动物”限定到“转基因鼠”。
1.3 日本
日本专利法中没有规定对可专利性主题的排除条款。日本对动物授予专利是从1988年美国授予第一件动物专利以后开始的。截止1998年11月, 19件涉及新旧生物技术培育的动物被授予专利。截止1999年9月, 已有9项转基因植物和8项转基因动物在日本获得专利权。
1.4 其他
加拿大法院先于1996年拒绝了类似“哈佛鼠”的专利申请。2008年3月加拿大联邦上诉法院否决了先前由下级法院所作判决同意美国哈佛大学的「哈佛鼠」可以申请获得专利。加拿大专利局长在上诉法院判决完毕后两个月内, 立即向最高法院提起诉讼, 最高法院在一个月内立即开始审判流程, 但是迄今最高法院尚未对此案做出判决。加拿大行政体系对于给与基因转殖动物品种专利是持反对的立场。 (张正平、林伦帆、林佳莹, 哈佛鼠历险记从哈佛老鼠一案探讨基因转殖动物可专利性, http://seed.agron.ntu.edu.tw.) , 南非、新西兰、澳大利亚也已经有好几个授予动物专利的例子。
到20世纪末, 随着《TRIPs协议》的广泛签署和欧盟于1998年通过《关于生物技术发明的法律保护的欧洲指令》, 世界对生命物质的专利保护问题也基本达成了以下几点共识。 (1) 生命物质具有可专利性。 (2) 动物品种、植物品种和繁殖植物或动物的主要是生物学的方法不具有可专利性。但如果有关的植物或动物发明不限于特定的植物或动物品种, 则不可排除其可专利性。
美国率先对转基因动物授予专利权, 日欧等国紧跟美国而采取了相似的作法。这样既促进和保证了本国生物技术产业界的投资, 又能够吸引外国专利权人进行跨国技术转让或跨国直接投资。作为基因技术发展的主导力量欧、美、日等技术发达国家, 转基因动物的研究与开发活动需要巨额资金投入和强大技术实力作为后盾, 这决定了它们有强烈的诉求建立这样一个国际统一的基因技术专利保护制度。如果不能享受到与其竞争对手同等的保护, 本国企业在生物技术的开发中将处于劣势地位。所以与其说授予转基因动物专利是专利法律制度本身合乎逻辑或因循法理的推导结果, 还不如说是国家或地区间经济政治政策竞争的产物。
2 转基因动物的可专利性分析
根据我国专利法规定, 授予专利权的发明应当满足“三性”:即新颖性、实用性和创造性的要求, 同时其技术应充分予以公开。转基因动物若符合这几个要件, 就可以授予专利权。
2.1 新颖性
利用转基因技术, 可以创造出带有某种新性状的转基因动物。随着生物技术的发展, 尤其是DNA重组技术的飞速发展, 转基因动物和转基因植物的出现, 已经从技术上克服了当初认为植物和动物不能授予专利权的缺陷。现在大家对转基因动物的新颖性已不再质疑, 因为经过基因工程改造过的动物已经不同于自然的动物。
2.2 创造性
我国《专利法》及审查指南中创造性判断的依据主要有3个:以物质的新颖性进行判断, 结构上有新颖性, 并有一定的用途和效果;人的主导作用, 人的行为对发明起着决定作用;以发明的效果为判断依据, 如与现有技术相比具有预料不到的结果, 则具有创造性。
从以上三个条件判断, 转基因动物的发明是具有创造性的, 转基因动物是通过人为的方式将重组DNA注入动物的体内, 改变了动物的某些特定性状;人工技术手段干预并指导生物进化过程;与自然界现存动物相比, 其改变后的生物特性是无法预见的。另外, 动物转基因技术面临着一些问题, 诸如生产效率低, 基因整合效率不高, 生产周期长, 成本高, 死亡率高等问题, 如果解决了这些问题, 那么通过该方法育出的转基因动物是具有创造性的。
2.3 实用性
转基因技术能被准确地描述, 并可以被该技术领域里的技术人员重复实现。通过运用重组DNA技术等手段, 能够控制生物体的遗传性状稳定和重复地在同种或亲缘关系较远的生物体中传递, 与传统生物技术相比, 具有较高的准确性和稳定性。
而且转基因动物应用于医疗、制药等领域并凸现出的不可替代的优势, 已经足以证明其实用性。
3 转基因动物专利面临的风险及挑战
虽然在发达国家转基因动物已被授予了专利, 但反对授予生物技术专利的声音从来没有消失过。人们并不否认大部分生物技术都能够满足以上所说的“三性”, 而是对给予生物技术专利所产生的社会影响和效果表示质疑。
3.1 对生命的垄断
许多人认为向有生命的东西授予专利意味着对生命的垄断。给予动物品种专利在欧盟及加拿大引起轩然大波, 欧洲的异议团体甚至张贴开膛破肚的哈佛鼠海报, 表达为动物请命的诉求。他们反对给予动物品种专利, 认为人类没有权力为了私利对动物进行基因试验, 不应该为此侵犯动物生存的权利。
不过就目前而言, 此类动物试验模型在癌症研究中的作用是不能用其他方法来代替的。科学界也普遍承认, 转基因鼠是确定诱发肿瘤的相关基因的最有效工具, 与传统试验方法相比, 该项发明所需要使用的小鼠数量较少, 因而实际从总体上降低了动物遭受痛苦的程度。
而癌症是世界上许多国家死亡率最高的疾病之一, 给患者带来巨大的痛苦。哈佛转基因鼠发明有助于改善现有的实验方法, 并开发新的癌症治疗方法, 具有可减轻人类痛苦和保证人类健康的重要贡献, 因此是符合道德规范的。
3.2 对环境及安全的影响
反对的另一个理由是在转基因动植物对于环境仍是不安全因素, 倘若人为的转基因动物流入自然生态中, 将有可能会破坏了原有的生态平衡与生物多样性。担心开放了动物专利后, 会有更多的转基因动物被发明, 因此增加对于环境的危害。
不过这种可能的风险仅仅是实验人员的故意错误操作或重大过失的结果, 不能仅仅因为这种可能的存在而拒绝授予专利权。况且我们可以通过一些措施避免这种情况的发生。比如把“进口方的事先知情与同意”作为转基因产品进口的前提。这显然非常有利于环境的保护。另外自然发生的或人工进行的动物杂交、动物引种比比皆是, 自然界已经接受, 人们也已经接受, 而转基因动物杂合程度仅很小, 为什么一定就觉得其不安全呢?
3.3 对科学研究的负面影响
转基因动物专利对于科学研究也带来一些负面影响。实验动物专利权拥有者如果因掌握基础专利而得以控制、分享其后的衍生专利, 将对学术及生物技术产业界造成的重大影响。所以在美国对转基因动物授予专利后, 科学家对于实验动物专利后造成不利于学术发展的现象提出共同呼吁。美国国家卫生院运用其影响力限制动物专利权的扩张, 一些生物科技公司也尽可能将此专利技术授权学术研究机构及商业公司使用, 以授权无偿使用的方式兼顾促进生物医学研究发展的公益目的。而一些生产基因改造动物的专业实验室也放弃了专利 (但这些实验室仍可通过收取相当的费用持续运作, 而不必担心恶性竞争或不敷成本, 这可能归结为转基因动物行) 。
除此之外, 对科学研究所带来的负面影响, 还可以通过对专利权的限制予以控制。我国专利法规定, 专为科学研究和实验目的使用专利的行为, 不视为侵权。我们可通过对科学研究和试验目的扩张解释, 将学术的目的的使用行为排除在外。另外国家也可以通过其他一些措施鼓励专利权人无偿授权学术目的的使用。
3.4 对农业的影响
转基因动物比起传统农场动物具有高产量、高质量、高抗病等附加价值, 农民们也担心在未来转基因动物将取代传统农场动物, 垄断市场, 因此间接的迫使小农们依附在大公司, 并且受到掌控。另外专利的保护将造成发达国家在农业领域的垄断进而控制全球的经济命脉, 加剧发展中国家与发达国家的对抗。
但如果对科研成果不予保护, 大家都不去研究开发, 没有新型高质量、高抗病动物的出现, 农民始终受困于自然条件, 受困于市场风险, 同样无法掌控自己的命运。同时我们还可以通过伦理道德原则、强制许可制度, 引进农民特权等方式, 打破对转基因动物的专利垄断, 尽量降低专利对农业的不利影响。
当然, 授予转基因动物以专利权不可避免地存在着一些危险性。事实上, 在新技术发展过程中, 几乎毫无例外地会产生一些人类未知的风险。但历史同样启示我们, 不能因为有一定风险就对新技术持消极的态度, 而应当慎重地权衡风险和积极效果之间的利弊, 并以此权衡的结果作为是否接受新技术的决定因素之一。而且这些风险并非是无法避免或解决的。美国生物伦理指导委员会 (NBAC) 提出了一个更为实际的办法, 就是将转基因动物技术进行分类, 这包括:用于实验室研究的转基因动物、用于农业生产的转基因动物、用于药品生产的转基因动物。这种方法可以对每种单独类别的社会影响进行独立的评价, 并对其可专利性作出适当的决定, 而不是对转基因动物发明这一整体进行衡量。这种方法更具有可行性。
4 我国对转基因动物立法政策的选择
目前我国《专利法》只对生产动物和植物品种的“方法”给予专利保护;而对动物与植物品种本身, 不管是否是基因工程制造出来的, 都不给予专利保护。
4.1 我国对转基因动物立法政策的选择
与欧美国家不同, 我国对动植物新品种不授予专利的规定更多地是从避免增加农民的额外负担、提供适合中国国情的保护水平角度出发, 而并没有产生如国外那般激烈的、尤其是针对动物是否会因此受虐待的伦理争论。
(1) 授予动物专利是生物技术发展的必然要求。
对于生物技术而言, 知识产权的参与已经不可避免。从调研、立项、实验, 到成果产生及产业化活动的各环节都已离不开知识产权的参与和支持。1美国、日本等国家和欧盟政府将基因序列纳入专利客体, 主要是出于促进生物技术发展政策的考虑和屈从于生物技术企业要求给予基因序列专利保护的压力。2比如英国10%的GDP受益于生物技术应用 (欧洲三分之一的生物技术公司位于英国, 生物技术对英国国民经济发展的作用举足轻重。见赵清华、范明杰、李玉洁、王宏广, 英国:10%的GDP受益于生物技术应用, 中国生物工程杂志[J], 2008, 28 (7) :2～5) 。中国的《专利法》没有给予动物新品种专利保护, 在实践上也会掣肘中国生物技术发展。所以生物技术的发展必然要求授予转基因动物专利。
(2) 授予动物专利有利于我国农业产业的发展。
作为农业大国的中国, 将是未来世界农业生物技术产品竞争的主要市场。但我国农牧业的整体发展水平不高, 传统农牧业仍占主导地位, 科技对农业生产的贡献率以及农业的产业化程度还处于较低水平, 农民养殖动物成本高, 质量低, 抗风险能力弱。目前将动物新品种不予专利, 是出于扶植国内产业发展的政策考虑, 但强化产业体质之手段并非一味阻止外国专利权人至我国申请专利, 而是应建立一个完善的规范架构, 提供一个清晰可行的游戏规则。3如果能对转基因动物提供专利保护, 有利于在国内营造自由竞争市场环境, 并且可在外商技术的基础上进行动物实验, 促使我国国内生物技术产业的发展。
而且生物技术产业发展遭遇资金瓶颈, 也需要专利制度的刺激。首先, 生物技术研究缺乏足够的经费支持。一些生物研究成果绝大多数都是由我国各科研院承担、由国家“863计划”提供科研经费进行的。由于国家科研经费方面始终存在这“僧多粥少”的问题, 因此严重地阻碍了许多研究项目的开展。其次, 我国基因技术专利保护现状的落后也阻碍了产业资本进入基础研究领域, 由于缺乏足够的风险投资介入, 产品以仿制国外专利发明为主, 也滞缓了研究成果尽早产业化的进程。
4.2 我国对转基因动物专利的具体立法建议
建议我国也能对转基因动物网开一面, 授予其专利权。
(1) 对动物专利审慎授权。
我国生物技术正值萌芽阶段, 建议我国不采取美国开放的动物专利方式, 以免造成国外生物公司对我国市场的垄断, 增加国内产业的发展成本。我们可以仿效欧洲, 对转基因动物授予专利采用谨慎、严格审查的措施。可以通过在实施细则或审查指南中, 将该动植物品种限定为“用传统生物学方法得到的动物和植物品种”, 绕开“动植物品种不能获得专利保护”的立法障碍, 以此打开动物不能授予专利的缺口。同时严格限定其保护范围, 使其适合我国产业的发展。
(2) 引入农民特权的例外规定, 对保护范围严格解释。
为保护农民利益, 可以借鉴植物新品种保护法的规定:首先, 在专利法中引入有关农民特权的例外规定, 规定对获得专利权的转基因动物, 农民在第一次购买后可以自行育种繁殖并不支付费用, 但不包括在范围内销售或为商业性目的的繁殖行为。其次, 行政审查或司法实践中应对保护范围作严格的解释。该专利基因的保护范围应仅局限于通过该专利基因直接获得的动植物产品, 而对于通过该动植物产品再次获得的含有该专利基因的动植物后代不应在保护范围之列。
哺乳动物转基因技术研究 第8篇
关键词：转基因哺乳动物,外源基因,转基因技术
20世纪70年代开创的DNA重组技术已被广泛的应用在生命科学的各个研究领域, 并取得了丰硕的研究成果。转基因哺乳动物自20世纪80年代初诞生以来, 一直是生命科学研究和讨论的热点, 随着研究的不断深入和实验技术的不断完善, 转基因技术得到了广泛的应用。转基因技术是20世纪遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第4代技术, 是生物学领域发展史上126年中14个转折点之一。
1 转基因哺乳动物的研究概况
1980年Gordon等首先采用受精卵原核注射方法, 将疱疹病毒基因SV40DNA片段和PBR322原核DNA分别注射到小鼠受精卵的雄原核内, 移植受体后获得了相应的转基因小鼠。1982年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因 (r GH) 导入小鼠受精卵, 得到了21只小鼠, 其中7只带有目的基因, 有6/7的小鼠比同窝对照组生长快近2倍, 这些快速生长的转基因小鼠被誉为“超级小鼠” (super mouse) , 表明整合了的外源基因可以在宿主体内得到有效正确表达, 表达产物可以在宿主动物体内行使正常的功能。
自此便掀起了培育转基因动物的大潮, 按照研究转基因小鼠的思路, 转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊及转基因牛都陆续育成。特别是1997年英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生, 突破了有性生殖的框架, 表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。同年美国PPL公司和罗斯林研究所合作, 利用该法生产出具乳腺表达人第九因子的绵羊[1]。
利用转基因克隆技术获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等[2]。
我国从1984年开始转基因动物研究, 并于同年最先获得了含人B2珠蛋白基因的转基因小鼠。1985年和1986年又分别获得了含人生长激素 (MT2h GH) 基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含Hbg Ag乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因2种乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、含“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠[3]。
2 哺乳动物转基因技术基本方法
2.1 物理方法
主要包括显微注射法、电激法、超声波法、冻融法、基因枪法等, 其中以显微注射法使用最为广泛, 多数转基因动物是通过该方法获得的。显微注射法是用微吸管在显微操作仪下将一定量的外源基因直接注入到受精卵的雄原核中, 将受精卵培养后移植给受体动物。1980年Gordon将SV40的TK基因整合后的质粒以显微注射法注入小鼠受精卵原核中, 首次成功地培育出转基因小鼠, 随后利用该方法, 转基因兔、猪、绵羊、鱼、牛和山羊也都相继获得成功。这种方法的优点是:外源基因易整合入染色体, 导入的基因大, 可使用任何载体承载基因片段, 也可注射无载体的基因片段, 外源基因的长度不受限制, 可达100Kb, 实验周期相对比较短。但这一技术还存在明显不足, 由于基因整体进入染色体的随机性, 使外源基因整合位点和拷贝数无法控制, 需要昂贵精密的设备, 操作复杂, 需培训专门技术人员。尽管如此, 由于其直接对基因进行操作, 整合率较高, 因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
2.2 化学方法
主要包括磷酸钙沉淀法、多聚阳离子试剂法、脂质体包埋法和DEAE-葡聚糖法。目前, 脂质体包埋法是最佳的选择。脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡, 通过细胞的内吞作用, 将所携带的目标基因导入细胞中。自Felgner等 (1987) 首次用DOTMA/DOPE阳离子脂质体介导基因转染培养细胞成功以来, 取得较大进展, 通过此方法获得了转基因山羊、绵羊、牛[4]。该方法效率很高, 离体细胞可以瞬时表达外源基因, 但其作用机理尚未完全阐明。Kawaura等 (1998) 发现, 抑制细胞内吞的物质 (如细胞松驰素) 可最大程度地抑制转染, 说明转染机制可能是细胞内吞。该技术的优越性表现在细胞毒性低, 对外源基因片段大小无特殊要求, 且脂质体易于制备, 尤其是免疫原性低, 可在体内转染时使用与体外实验相同的载体。目前, 面临的主要问题是转染靶向性不强, 易被吞噬细胞清除, 血清的抑制作用以及转化效率低等。
2.3 生物方法
主要包括反转录病毒法、精子载体法、原生质介导法、细胞融合法、胚胎干细胞 (Embryonic Stem Cell, ESCs) 法和人工酵母染色体载体法。
2.3.1 反转录病毒法。
反转录病毒是病毒中的一个大科, 其成员可感染许多不同种属的动物。它与其他病毒的区别在于其复制是通过一个DNA中间体, 即前病毒来完成的。中间体是反转录病毒生命周期的一个组成部分。反转录病毒携带的反转录酶, 能以RNA病毒基因组作为模板产生双股的DNA拷贝, 单一拷贝能有效地插入宿主细胞的基因组中。反转录病毒具有能将其病毒基因插入宿主细胞染色体中的能力, 加上其能对多种细胞类型的非溶解性感染, 使之成为基因转移实验的理想载体。并且利用反转录病毒的高感染效率和在DNA上高度整合的特性, 可以提高生产转基因动物的效率。早在1974年, 就有关于反转录病毒作为动物基因转移载体的研究。Janenisch等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中, 发现获得的小鼠体内有SV40DNA整合。随后, 他又成功地用鼠白血病病毒作为载体, 将外源基因导入小鼠胚胎。Harvey等用猫白血病病毒作为载体, 成功地将外源基因导入去透明带的羊胚胎中[5]。Anthony等认为以反转录病毒载体介导的基因整合的关键在于有丝分裂时出现的核膜分裂, 处于减数分裂中期的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞, 这就为反转录病毒载体介导的基因插入提供了可能[6]。
反转录病毒感染法的优点是操作简单, 无需特别的仪器设备, 外源基因的整合率较高, 效果稳定, 通常外源基因是单拷贝整合到受体基因组中, 而且转染不受胚胎发育阶段限制。动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达, 还能引发所导入外源基因的表达[7]。这一技术的缺点在于外源基因难以植入生殖系统, 成功率较低;病毒衣壳大小有限, 不能插入大的外源DNA片断;感染宿主时, 为非同源整合, 结合不稳定;调控区内可能会发生相互作用, 这就要求选择能稳定整合表达的外源基因, 并用高感染力的反转录病毒作载体;最关键的是携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组过程中有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其他有害基因, 安全性令人担扰。
2.3.2 精子载体法。
精子载体法是将成熟的精子与外源DNA进行预培养后, 使精子携带外源基因, 受精后并使外源基因能整合到受精卵染色体中。此项技术在实际操作中存在许多问题, 但在思路上对大型动物的转基因研究具有重要的意义, 目前, 在猪、鸡、鱼类等的基因转移中已获得成功, 关键之处在于精子与外源DNA的结合[8]。
2.3.3 ESCs法。
ESCs法是将目的基因转移入ESCs后, 再重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ESCs进行克隆, 从而培育出转基因个体。ESCs法的最大特点是, 在克隆的ESCs被转移到动物胚胎之前, 可先把外源重组DNA整合到细胞的染色体组中, 然后将这些胚胎干细胞进行筛选, 找到理想的ESCs, 从而大幅提高转基因动物的生产效率。但ESCs法的缺点是ESCs建株很困难, 同时还需要预先选择和克隆基因转移型细胞。目前, 利用该方法生产转基因动物有2个最大限制条件, 一是只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用;二是即使有了胚胎干细胞, 对家畜来说繁殖嵌合体还有一定困难。
2.3.4 人工酵母染色体载体法。
人工酵母染色体载体是近年来发展起来的新型载体, 具有克隆百万碱基对级 (Mb) 大片段外源基因的能力, 可以保证巨大基因的完整性, 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变, 从而使得较长的外源片断在转基因动物研究中整合率的提高, 另外, 目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效应[9]。技术关键为:胚胎干细胞转染YAC后体筛选, 阳性胚胎干细胞囊胚腔的注射, YAC原核注射[10]。1996年Berm G通过此法获得转基因兔[11]。
3 外源基因的整合和表达
3.1 外源基因的整合
外源基因的整合受DNA构型、进入宿主细胞的方式、DNA的浓度等的影响。外源基因进入细胞后整合方式不同, 可分为随机整合与定点整合。整合一般具有稳定性, 大部分以孟德尔方式遗传后代, 少部分嵌合体, 极少转基因未整合到染色体上, 而是以附加体形式存在, 并可传至后代。1~100拷贝的外源基因以头尾成串的方式整合到宿主细胞的染色体上, 一般为单位点整合, 有时在不同染色体的不同位点整合。目前, 认为基因表达的强弱与整合的拷贝数无关, 而与整合位置有关。另外, 原核生物的载体序列可能会抑制某些基因的表达, 少数基因位点的侧翼序列有重排现象, 或基因部分整合情况。外源基因插入常出现宿主基因序列的重排、缺失、重复或异位, 转基因可能会造成宿主细胞基因突变出现新表现型, 有时会影响管家基因以至发育致死[12,13]。
3.2 外源基因的表达
从基因到蛋白是一个多因素作用的生化过程, 尤其是对随机插入宿主染色体的外源基因, 其表达与否或表达程度强弱除受其本身结构影响外, 整合位点的位置及附近顺式调控元件的有无都对外源基因表达产生影响。另外, 转基因沉默、RNA的错误剪接、原核载体序列及动物的遗传背景等也是外源基因不表达或表达水平低的原因。
外源基因表达很大程度上受整合位点的影响, 所谓“位置效应”即是因整合位点不同而导致的基因表达差异。对位置效应最直接的解释是插入位点附近的序列特点影响了其表达的程度[14]。比如, 如果外源基因插入转录失活的异染色质区域, 则其表达有可能受到完全抑制。目前, 使用的酵母人工染色体 (YAC) 介导转基因, 因保证了目的基因上下游侧翼序列的完整性, 可在一定程度上减弱位置效应。
3.3 提高外源基因表达的策略
3.3.1 导入大片段目的基因。
YAC载体是近年来发展起来的新型载体, 它的大容量为处理大片段DNA提供了有力的武器。YAC载体不存在位置效应, 因YAC载体的大容量能保证巨大基因的完整性, 保证所有顺式作用因子的完整性, 另外, 目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的“位置效应”而引起缓冲区域的作用, 从而提高外源基因的表达水平。
3.3.2 添加内含子。
结构基因有3种形式:一是基因组基因, 包括外显子和内含子;二是微型基因, 也是基因组基因, 但大部分的内含子都已去除;三是不包含内含子的c DNA。大量的试验结果表明, 基因组DNA在转录迁移方面优于c DNA及微型基因。Grosveld等研究人β-球蛋白基因在转基因鼠中表达时发现, 第2内含子对于表达是必需的, 而采用c DNA构件, 由于缺乏内含子, 外源基因在转基因鼠中未能激活, 在所进行的转录迁移实验中, 采用含有内含子的基因组构件比采用c DNA的表达率提高表达10~100倍, 说明内含子有利于基因的转录[12]。
3.3.3 利用启动子和增强子。
启动子是RNA聚合酶进行精确有效转录必需的。在转基因动物研究中如何选配设计启动子是决定外源基因在受体细胞中能否正确表达的关键环节。有时为了增强基因的特异表达, 还必须设计出单一型增强子或复合型增强子与之匹配[12]。
3.3.4 利用反式作用因子。
动物基因的表达除受到顺式作用元件作用外, 还受到反式作用因子的调节。这些反式作用因子是可扩散并能与调控序列结合的蛋白因子或激素类物质, 是由调控序列结构基因以外的基因编码的, 在顺式元件的调控序列上有其特异的结合位点, 是调控序列实现基因表达调控过程中不可缺少的功能性分子。反式作用因子不仅能激活不同外源基因的转录, 而且能结合到染色体的不同位点。将一个基因的调控序列与另一个基因的结构序列重组可以产生新的组织特异表达, 1个反式作用因子可以对几个基因的表达起作用, 同时它也具有组织特异性[13]。
3.3.5 添加基质附着区。
基质附着区 (Matrix Attachment R-egion, MAR) 又称核骨架附着区 (Scaffold Attachment R-egion, SAR) 。S/MAR是指染色体上能专一性地与核骨架结合的DNA片段, 该区域为A T丰富区, 通常含拓扑异构酶II保守序列。S/MAR有时能显著增强基因表达、克服位置效应和消除转基因沉默, 它已越来越多的被作为一种重要的顺式调控元件应用在转基因工程中。
3.3.6 利用基因打靶系统实现外源基因的定点整合。
转基因动物中外源基因在染色体上的整合状态与该基因的表达调控关系极大。一般情况下, 外源基因几乎全部都以随机插入的方式整合在受体细胞中染色体的随机位点上, 因而几乎所有的转基因动物都面临遗传稳定性差、易引起插入突变和基因修饰并导致遗传病变等问题[14]。近年来, 国内外在这方面作了大量工作, 设计出了多种基因打靶系统, 使外源基因在受体细胞中定点整合在特异染色体的其特异位点上, 从而基本上消除了随机整合带来的问题。另外, 基因打靶与胚胎干细胞培养系统结合, 可方便地将各种突变引入生物体内, 从而在整体水平上研究高等真核生物基因的表达调控。
4 转基因哺乳动物的检测方法
检测方法通常采用的是不同层次的分子杂交法, 如基因水平的DNA印记法 (Southern Blot) 、转录水平的RNA印记法 (Northern Blot) 、翻译水平的蛋白质印迹法 (Western Blot) 、聚合酶链式反应法 (PCR) 、斑点杂交法 (Spot Hybridization) , 也可采用基因定位法 (Gene Location) , 一般情况下多种检测方法联合使用。
4.1 DNA印记法 (Southern Blot)
DNA印记法是转基因动物鉴定的主要方法, 也是目前最具权威的方法。技术要点为:提取组织DNA, 选择导入基因中的单一限制酶位点, 酶切后电泳, 转膜并选择适当的探针进行杂交, 通过放射自显影获得结果。优点是结果明确可靠, 缺点是操作繁琐、工作量大。
4.2 聚合酶链式反应法 (PCR)
该法需设计一对特异性引物, 以提取组织DNA为模板进行PCR扩增, 检测是否有特异性片段。由于PCR方法有时存在假阳性, 特别是扩增出的内源性片段对转基因的筛选影响较大时, 假阳性更明显。因此, 如何消除PCR假阳性是一个重要问题。
4.3 斑点杂交法 (Spot Hybridization)
提取待检动物组织DNA点于硝酸纤维素膜上, 用探针杂交, 放射自显影后获得杂交结果。该法存在一些问题, 如整合的外源基因与内源性基因有同源性时, 往往出现假阳性。另外, 由于提取的染色体脱氧核糖核酸较为浓稠, 加之整合拷贝数低, 杂交效果有时不太理想。因此, 该法虽十分简单, 但很少用于转基因动物筛选[15]。
5 哺乳动物转基因技术的应用及存在的问题
动物转基因技术应用正走向产业化的道路, 具有十分广阔的前景。如动物转基因技术可用来改良动物品种[16], 提高生产性能, 生产药物蛋白[8], 用转基因动物的器官作为人类器官移植的供体, 建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型[17]。
转基因动物与生物制药 第9篇
一、基因工程药物的发展
(一) 细菌基因工程药物。
把目的基因通过适当改建后, 导入大肠杆菌等工程菌中, 通过原核生物来表达目的基因蛋白。细菌基因工程的成功使大量生产人体内的稀有蛋白成为可能, 改变了蛋白药物生产的传统模式。但是细菌基因工程也存在着两个极大的缺陷:一是细菌本身是一种低等生物, 缺乏真核生物基因所必需的一些翻译后加工机制, 把构建好的哺乳动物乃至人类的基因导入细菌里, 往往不能表达必须经过后加工才能成为有活性的蛋白药物, 因此用于表达真核基因时的蛋白产物往往没有活性;二是即使表达了, 产物往往没有生物活性, 必须经过糖基化、羧基化等一系列修饰加工后才能成为有效的药物。而这个后加工过程相当复杂, 在成本和工艺上也有许多问题, 因而限制了细菌基因工程的发展。
(二) 细胞基因工程药物。
从20世纪70年代开始转向使用真核细胞表达系统来生产药用蛋白。细胞基因工程解决了两个问题:一是能够表达人或哺乳动物的蛋白;二是哺乳动物细胞具备对蛋白进行修饰加工的条件。用这样的方法可以生产出有生物活性的产品。如人凝血因子Ⅸ就是用这种方法生产的一种代表性产品。但是细胞基因工程也有不足之处, 因为人或哺乳动物细胞培养条件相当苛刻, 药物生产的成本太高。
(三) 用转基因动物生产药用蛋白。
由细胞基因工程存在的不足之处人们又想到, 是否可以把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物的受精卵里, 导入的基因如果与受精卵的染色体DNA整合在一起, 细胞分裂时, 染色体倍增, 该基因也随之倍增, 每个细胞里都带有导入的基因, 而且能稳定地遗传到下一代。但新的问题随之出现, 即导入的药物蛋白基因所表达的部位与原来的期望往往不一致。因此, 让药物蛋白基因表达控制在某一特定部位, 而不是随机地在身体任意部位表达就成了新的研究课题。外源基因在转基因动物体内最理想的表达场所是乳腺, 就基因药物而言, 最理想的表达场所也是乳腺。因为乳腺是一个外分泌器官, 乳汁不进入体内循环, 不会影响到转基因动物本身的生理反应。从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物, 不但产量高、易提纯, 而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工, 具有稳定的生物活性, 因此又被称为动物乳腺生物反应器。细菌基因工程需要很大的发酵车间, 细胞基因工程也需要很多昂贵的设备来培养细胞, 而若用转基因动物, 就只需要饲养牛、羊等动物即可。
二、转基因动物在生物制药中的应用
(一) 利用转基因动物生产药用蛋白。
利用转基因动物生产药用蛋白主要通过三种渠道。一是通过血液, 将人的血红蛋白基因转移给猪种, 这样可以通过转基因猪来生产人血红蛋白。二是通过尿腺, 利用膀胱中尿腺合成和分泌蛋白的功能作为反应器的优点是, 转基因动物终其一生都将产尿, 并且尿中几乎不含脂肪和其他蛋白, 容易纯化。1996年, Kerr和Wau获得能在尿液中表达人生长激素的转基因小鼠, 含量高达0.5克/升。三是通过乳腺, 泌乳对动物健康没有影响, 加之乳腺摄取、合成、分泌蛋白质的能力很强, 并且能对重组蛋白质进行多种翻译后加工, 包括羟基化、糖基化、氨基化等, 同时能将重组蛋白质折叠成有功能的构象。因此, 动物乳腺是目前公认的生产重组蛋白质的理想器官。
(二) 利用转基因动物生产营养医疗保健品。
据美国商业信息研究所估计, 美国2 1世纪初的营养医用品市场大约为2500亿美元, 而欧洲将超过这个数字。目前全球营养医用品市场的平均增长率超过187%, 其中营养医用蛋白的发展潜力最大, 已经成为营养医用品的支柱。
(三) 利用转基因动物生产可用于人体器官移植的动物器官。
异种器官移植可能是解决世界范围内普遍存在的器官源短缺的有效途径, 目前对器官供体动物研究较多的是猪。然而器官移植时出现的超急性排斥反应极大地阻碍了这一进程, 解决这一问题的关键是如何使经移植的器官不被患者的免疫系统识破。在异源器官移植方面, 英国剑桥大学的研究工作者做了十分细致和有意义的工作, 经过遗传改进的猪器官已开始在灵长类动物上作临床试验, 可望取得突破。
(四) 建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型。
在动物转基因技术问世之前, 发现自然突变体几乎是遗传学家获取遗传疾病模型的惟一途径。目前, 遗传学家可以通过精确地失活某些基因或增强修复某些基因的表达来制作各种各样的研究人类疾病的动物模型、治疗模型和新药筛选模型。
建立模型首先必须获得转基因疾病动物, 这些动物的发育、生理、病理及其他有关表型可以通过缺失或破坏原来正常表达的基因来实现, 而实现这一目标是通过转基因使基因加倍或基因打靶的方法。目前利用转基因动物可筛选抗肿瘤、抗艾滋病、抗肝炎病毒、抗肾脏疾病的药物。
三、问题与展望
转基因动物技术和转基因动物制药将为人类解决许多生命科学领域的重大问题, 是蛋白质药物生产领域的一场革命, 这就决定了今后相关的研究将不断深入, 竞争也将更加激烈。
尽管转基因动物制药, 特别是转基因动物-乳腺生物反应器制药给人们展示了美好的前景, 但迄今还没有一个商品化的药物上市。除了转基因动物制药的研制周期较长, 前期投资大的原因外, 还存在较多的技术问题需要解决主要体现在: (一) 转基因动物的成功率较低; (二) 目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题, 包括目的基因的整合位点、整合的拷贝数、整合机理及与宿主染色体之间的相互作用等问题还不清楚; (三) 产品纯化问题; (四) 安全性也是一个十分值得研究并给予特别关注的问题:一是外源基因的插入可能会对宿主动物自身产生的影响及对其生活环境所造成的影响, 二是转基因动物制品的使用安全性, 即是否可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类; (五) 制成口服生物制品问题。
总之, 转基因动物制药 (乳腺生物反应器) 是21世纪生物医药产业的一种新的药物生产模式。转基因动物制药的可行性已毋庸置疑, 该项技术的迅速发展为制药业带来了全新而巨大的变革, 也为制药业发展提供了良机。随着人类基因组计划工作草图的绘就, 人类遗传结构的全部秘密将大白于天下。这些遗传信息将是21世纪宝贵的医药资源, 蕴藏着巨大的商业价值。
参考文献
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动物防御素的基因工程研究进展 第10篇
1 防御素的分类、分布及分子结构
根据半胱氨酸的位置和二硫键连接方式的差异, 哺乳动物防御素可分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素3种类型。α-防御素是最先从豚鼠和兔子的多形核嗜中性粒细胞中分离出的一个防御素亚家族, 广泛分布于人、鼠、兔、猪的嗜中性粒细胞, 兔的齿槽巨噬细胞以及人和啮齿类动物的小肠潘氏细胞中, 在哺乳动物消化道和泌尿生殖道的上皮细胞中也有表达。它是由29～36个氨基酸组成的短肽, 分子内有6个保守的半胱氨酸形成的3对二硫键, 以Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5方式连接, 其中Cys1-Cys6二硫键与N端和C端的半胱氨酸形成分子大环, 所以α-防御素的一级结构为圆形。另外α-防御素二级结构是由3对二硫键形成稳定的反向平行的3股β片状结构。二硫键使小分子紧密连接以防御蛋白酶的水解, 所以防御素在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中能保持特性, 这也是防御素区别于其他抗微生物肽的主要原因。β-防御素是美国科学家Diamond等最早从牛气管黏膜上皮中分离得到的。它广泛分布于人、鼠、牛、羊、猪的多种器官上皮细胞内。家禽体内只含有β-防御素。β-防御素由38～42个氨基酸组成, 其分子内也有6个保守的半胱氨酸, 但6个半胱氨酸形成的3对二硫键的位置与α-防御素不同, β-防御素分子中二硫键是由Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6方式连接, 其分子质量相对较小并具明显的半胱氨酸排列特征, 对维持分子的三级结构有重要意义。θ-防御素是在灵长类动物中发现的具有活性的基因家族, 它存在于猕猴的中性粒细胞和单核细胞的颗粒中, 由6个半胱氨酸形成3对分子内二硫键, 以Cysl-Cys6、Cys2-Cys5、Cys3-Cys4的方式连接形成环状结构。成熟的θ-防御素由2个半防御素经过修饰与结合而产生, 它的前体是变异的α-防御素基因和一个未成熟的终止密码子的编码产物[2]。这在某种程度上印证了所有的防御素均起源于同一个基因的观点。
2 防御素的生物学功能与作用机制
2.1 抗菌活性及作用机制
防御素的杀菌机制是在细菌的细胞膜上穿孔形成离子通道, 引起细胞内的原生质外漏而导致细菌死亡。首先, 当病原微生物侵入动物机体时, 机体释放防御素分子, 由于静电吸引的作用, 防御素α-螺旋上的正电荷与细菌表面结合, 然后借助分子连接结构的柔性将疏水基团插入细菌质膜中, 防御素也随即插入, 此时, 穿过膜的离子数量和浓度也发生了改变, 使细菌膜蛋白和脂质排列顺序改变, 出现萎缩、崩溃等现象。由于α-螺旋的两亲性, 防御素在膜内发生分子间相互位移而聚集在一起, 形成离子性通道, 从而使细菌失去膜电势, 细胞必需的代谢物质渗出, 外界物质内漏, 最终菌体因无法去除和修复损伤而死亡。机体通过该机制驱除病原体实现自我保护。
2.2 抗病毒活性及作用机制
防御素对疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等有囊膜病毒具明显的抑制和杀伤作用, 该作用机制是防御素通过与病毒外壳蛋白结合而使病毒失去生物活性。但防御素对无囊膜病毒的抑制作用不理想, 进一步说明防御素抗微生物的作用机制是通过膜的相互作用来实现的。另外, 防御素对病毒的抑制程度与其浓度和分子内二硫键连接的紧密程度有关, 同时也受环境温度、湿度、pH值和培养液组成的影响。
2.3 抗肿瘤作用及机制
Liehtenatein A等离体试验表明, 纯化的防御素能杀伤多种肿瘤细胞, 特别是对抗肿瘤坏死因子的U9TR细胞系及抗自然杀伤细胞因子的YAC-1和U937细胞系具有杀伤活性, 它是通过直接作用于肿瘤细胞的染色质来发挥杀伤作用的。具体表现为线粒体空泡化, 嵴脱落;核膜界限模糊、破损;核染色体DNA断裂;DNA的合成受阻等。王芳等通过昆虫抗菌肽作用于人髓样白血病和正常人白细胞的对比研究, 显微镜下观察到核染色体DNA断裂的现象, 进一步证实了该机制。
2.4 其他生物学功能
研究发现, 防御素除具有广谱抗微生物作用外, 在获得性免疫中也扮演重要角色。当微生物入侵时防御素可以作为效应分子在一定受体的参与下趋化单核细胞、T淋巴细胞及表皮细胞等, 使其凝集到病变部位发挥免疫吞噬作用。此外, α-防御素还可与补体系统中的补体结合从而抑制补体的溶血活性, 低浓度的防御素还能起到免疫监视作用。
3 防御素的基因工程研究
防御素虽来源广泛, 但体内含量较低, 直接提取难度大而且对技术和设备的要求高, 人工合成虽然省时省力, 但由于成本较高不适合大规模工业化生产。因此, 利用基因工程技术, 通过细菌或酵母等表达系统来大规模制备防御素具有广阔的前景。
防御素对原核细胞有一定的毒害作用。目前多以融合蛋白在大肠杆菌中进行表达。Harder J等[3]将人β-防御素 3 (hBD3) 的基因克隆入pET-30c 中构建融合表达载体, 以大肠杆菌 BL21 为宿主菌, 产物用肠激酶切割后反向高效液相色谱纯化, 结果获得了高纯度的 rhBD3 蛋白, 其活性与天然抗菌肽活性相同。Yang Y等将人的阳离子抗菌肽 hCAP-18和LL-37、凝血酶识别位点和硫氧还蛋白构建在一起, 然后在大肠杆菌中进行表达, 获得的融合蛋白经凝血酶消化后形成重组的GSLL-39具有抗革兰阳性菌和革兰阴性菌的活性。尽管运用该系统已经成功地表达了一些防御素, 但防御素对宿主有细胞毒性、融合蛋白对表达蛋白活性也有影响。宿主细胞表达的防御素会反馈性地抑制大肠杆菌等宿主细胞的增殖, 从而影响防御素的进一步表达。
目前, 酵母表达体系是抗菌肽基因和生物工程中应用最为广泛的表达体系之一。其中巴斯德毕赤酵母表达系统的应用最多。它具有操作简单、外源蛋白能正确加工与修饰、表达量高、易纯化和可大量发酵培养等优点。Hong I P等运用毕赤酵母系统表达了人皮肤抗菌肽LL-37, 该基因装载于pGAPZ-E/LL-37载体, 转染毕赤酵母X-33, 甲醇诱导表达, 结果目的蛋白以分泌的形式表达, 产物纯化后经藤黄微球菌测试具有抗菌活性。张辉华等通过RT-PCR方法扩增鸡β-防御素-1 (Gal-1) , 然后插入酵母表达载体pPICZα-C中, 电转入宿主菌X-33, 体外抑菌活性检测具有抗大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌的活性。王艾平等将人α-防御素5 (mHD5) 与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K构建表达质粒, 经摇瓶发酵和甲醇诱导, 成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清液, 抑菌鉴定对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种标准株都有明显抑菌活性。综上所述, 多数防御素基因在毕赤酵母表达系统中实现了目的蛋白地分泌表达, 并且产物对宿主菌未产生抑制作用, 表达产物多具有抑菌活性。这表明利用基因工程生产防御素小肽, 毕赤酵母表达系统是首选的表达体系。
4 小结
利用基因工程的原核与真核体系来获得防御素的尝试已初见成效, 但使其真正成为一类药物还需解决许多问题:①毕赤酵母作为理想的表达系统, 自身存在一些缺陷。如稀有密码子的影响、表达周期长、表达产量低甚至有些防御素难以获得有效表达等;②防御素由于分子质量小, 对蛋白酶敏感, 易被降解;③还要解决安全性问题。随着人们认识的加深和分子生物学的发展, 通过模拟体内环境[4]在体外进行防御素结构的设计与改造, 同时通过改造毕赤酵母密码子、表达载体的启动子等可以优化表达条件, 并不断寻找和开发更理想的表达系统, 相信制约防御素高效表达的瓶颈必将解除。
摘要：防御素是一类富含半胱氨酸的小分子阳离子肽, 具广谱抗微生物性能, 无公害、无残留, 不会导致耐药菌株的出现, 是较有潜力的抗生素替代品。笔者从防御素的分类、分子结构, 生物学功能等方面进行了综述, 概括利用基因工程技术生产防御素的前景及问题, 为深入研究防御素提供参考。
关键词：防御素,抗微生物,毕赤酵母
参考文献
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