染色体畸变率范文（精选5篇）

染色体畸变率 第1篇

1资料与方法

1.1资料运用电子医学数据库作为本次研究分析的文献检索方式,联合检索《万方数据库》《中国期刊全文数据库》《中国科技期刊全文数据库》《中国生物医学文献数据库》和《中国科学文献数据库服务系统(CSCD)》 等;关键词包括“放射工作人员“”染色体畸变率“”微核率”; 对1997—2011年内的有关文献进行手工检索和追踪。

1.2纳入标准文献资料必须提供放射组和对照组的研究人数、受检人员细胞数、染色体畸变率以及微核率。各文献研究方法类似[2]。

1.3排除标准排除文献资料研究中样本量过少、无对照组、信息量较少或者数据严重缺失以及平均参考值悬殊较大、数据缺少详细的数据资料和无法获得研究资料的原始数据以及综述文献。

1.4统计学分析以文献的纳入标准和排除标准为依据,经过仔细的筛选得到国内7个区域的10篇文献资料[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12],累计分析放射组淋巴细胞染色体畸变率,细胞总数为667 280个,对照组细胞总数为135 456个。累计分析放射组淋巴细胞微核率细胞总数为2 476 200个, 对照组细胞总数为1 131 000个。采用Review Manager 5.0软件对纳入的10篇文献的相关资料数据进行整理和分析。对全部纳入的文献数据资料采用q检验法进行异质性检验,检验的统计量为Chi2和P值,检验水准 α=0.05。根据文献数据资料的检验结果选用固定效应模型(fixed effect mode1)或随机效应模型(random effect model),若纳入的文献资料的研究结果具有同质性,则采用固定效应模型(P>0.05),反之则采用随机效应模型(P≤0.05)[2]。

将10篇研究中的放射组与对照组的细胞总数和畸变细胞数输入Review Manager 5.0软件,对10篇研究中两组的染色体畸变率差(risk difference,RD)和微核率差进行合并,求其对应的效应合并值(综合效应) 及其95% CI。

2结果

2.1文献资料统计从文献资料来源看,本文选取的10篇文献均来自我国内地,其中济南市、泰安市隶属山东省,南京市、镇江市隶属江苏省,其余均来自国内不同省份,均为1997年后文献,最早的为1997年重庆市凌朝元和泰安市侯佩强的研究[11,12],最近的为2010年以来的3篇研究[3,5,8],累计放射组2 967例,对照组836例,显示在10篇文献中,外周血淋巴细胞染色体畸变率差值最高的为文献[4],RD为0.003 3,95% CI为0. 002 5~0. 004 1,率差值最低的是文献[6],RD为0.000 2,95% CI为- 0. 000 5~0. 000 8。外周血淋巴细胞微核率率差值最高的为文献[4],RD为0.001 6,95% CI为0.001 3~0.001 9;率差值最低的为文献[10],RD为0.000 1,95% CI为0.000 0~0.000 3。见表1~4。

注:“—”为文献中缺失数据。

2.2文献资料的异质性检验本次研究10篇文献经q检验法检验, 淋巴细胞染色体畸变率数据的Chi2=585.71,P<0.01;淋巴细胞微核率数据的Chi2=342.76, P<0.01。由此可知,对所纳入的10篇放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变率及微核率研究数据均采用随机效应模型进行统计分析。

2.3 Meta分析结果根据meta分析发现放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变率数据比较的RD合并值为0.001 9,其95%CI为0.000 7~0.003 1(表3)。外周血淋巴细胞微核率数据比较的RD值为0.000 7,其95%CI为0.000 4~0.001 0)(表4)。其中染色体畸变率与微核率的各自区间均未包含0,表明两组各自的总体率差与0的差异性有统计学意义,可以认为放射工作者外周血淋巴细胞染色体畸变率及微核率均高于对照组。

3讨论

Meta分析是指运用统计学方法对收集的多个研究资料进行分析和概括,合并研究结果和对研究结果进行齐性检验的统计方法。其优点是通过增大样本含量对多项研究结果的一致性进行评价以及对研究结果作系统性评价和总结,并且提出一些新的研究问题,为进一步研究提供科学依据。 meta分析增加了样本含量, 提高了检验效能,当多个研究的统计分析结果出现不一致或者没有统计学意义时,运用meta分析可得到更加接近真实的综合分析结果[13]。有相关文献报道放射工作人员外周血淋巴细胞的染色体畸变率及微核率高于其他正常人群(P<0.05),但也有学者对南京从事X射线、工业探伤作业人员外周血淋巴细胞染色体畸变率、 微核率水平分析认为与正常人群的差异无统计学意义(P>0.05)[8]。本文通过搜集整合我国7个区域报道的关于放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变率及微核率的数据资料,分析了近15年来我国放射工作人员染色体畸变及淋巴细胞微核的状况,分析研究结果显示, 与对照组相比,从事放射的工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变率及微核率显著升高,与对照组的差异有统计学意义。

受电离辐射的影响,可使细胞染色体发生断裂、畸变,或使染色体上某些基因重建、异位、丢失而诱发基因突变,这一系列的改变与人类肿瘤的发生、先天性畸形及与之相关的遗传性疾病等有着十分密切的关系[2]。 微核试验能检测职业人群接触化学毒物或物理因素诱导产生的染色体分离改变和染色体完整性改变这两种遗传学终点[4]。微核率的大小可以直接反映放射工作人员染色体的损伤程度,也间接地代表受电离辐射损伤的情况。而且微核测定方法相对简单并且十分快速,因此,外周血淋巴细胞微核率的测定是评价职业接触放射线人群受照效应的一种既简单又十分有价值的遗传学指标[14]。而微核率配合染色体畸变分析,可以更加有效地了解放射工作人员的电离辐射损伤情况。放射工作人员体内的染色体畸变的远期危害目前尚无法准确预测。至于国内某些区域出现差异无统计学意义的报道,分析其可能的原因是我国沿海和内地经济发展不均衡,在不同区域的工作场所的防护设施及个人防护方面存在一定的差异所造成的。

综上,本次meta分析研究可以说明放射工作人员染色体畸变率及微核率升高与职业接触放射线辐射有显著相关性,职业接触放射线人群个人累积剂量与射线装置的性能、放射工作场所防护设施、职业接触射线人员的个人防护等直接相关,因此,放射工作人员染色体高畸变率及高微核率是一个不可忽视的问题[15]。相关的企业与医疗机构应加强对放射工作人员定期进行相关电离辐射的放射卫生防护知识培训,定期做好职业健康监护工作,卫生行政部门应加强X射线机性能、个人剂量监测等卫生监督工作,以确保放射工作场所的安全和保障放射工作人员的职业健康。

染色体畸变率 第2篇

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

健康体检人群的外周血,要求:无急慢性疾病、非放射工作者、半年内无射线和化学毒物接触史、无过量受照史、近1个月无病毒感染史、不吸烟的成年人。

1.1.2 实验试剂

人外周血淋巴细胞培养基、松胞素和秋水仙素由湖南湘雅基因技术有限公司提供。

1.1.3 主要实验设备

BG-6B医用直线加速器、冰箱、EYELA-SLA1200型恒温培养箱、生物安全柜、图像分析系统及低温高速离心机、恒温水浴箱等。

1.2 方法

1.2.1 X线离体照射的方法

用BJ-6B医用电子加速器(能量为6兆伏直线加速器),剂量率为0.3Gy/min,光阑为20χ20V,距离100 cm,分别选用剂量0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0 Gy共8个剂量点,对离体血进行照射。

1.2.2 人外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制备与观察

取肝素抗凝的血样进行X离体照射,然后在上述温度放置2 h,分别注入5 m L的RP-MI-1640生长培养基中,混匀之;培养瓶置37℃恒温箱中培养48 h;秋水仙素处理使细胞分裂停止在中期,4~6 h后收获细胞。收获细胞后经低渗和预固定、固定及再固定等程序,打匀后制成白细胞悬液;滴冰玻片上制片,烤干、Giemsa染色后再晾干;选择良好的分裂相,在油镜下进行染色体分析,观察染色体畸变。用于生物剂量估算的畸变主要有:dic-双着丝粒染色体,简称”双”;r-着丝粒环,简称”环”;f-无着丝粒断片等。因双着丝粒体和着丝粒环在活体和离体照射时无显著性差别,在体内持续时间长,形态特殊易识别,故“双+环”(dic+r)是估算剂量的最佳指标并且早是国际公认的生物剂量计[6,8,9,10]。

1.2.3 人外周血淋巴细胞的培养与微核测定

用CB法-胞质分裂阻断法[11]测定。取肝素抗凝的血样进行X离体照射,然后在上述温度放置90min,分别注入5 m L的RPMI-1640生长培养基中,混匀之;37℃恒温培养40 h,加松胞素(Cyt-B);继续培养至72 h,收获细胞后经低渗和预固定、固定及再固定等程序,打匀后制成白细胞悬液;滴冰玻片上制片,烤干、Giemsa染色后再晾干;镜检观察淋巴细胞微核。

1.3 剂量-效应曲线的建立

在0~5.0 Gy的剂量范围内,分别选0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0 Gy共8个剂量点检测X离体照射剂量;采用dic+r%和dic+r/每细胞表示,淋巴细胞微核率用‰和个/细胞表示染色体畸变率;因X线照射是低LET辐射,故染色体dic+r/细胞和微核/细胞的剂量-效应曲线采用拟合的二次多项式。

1.4 统计学方法

数学回归方程式选二次多项式(伥=a+bd+c D2),伥为染色体畸变率(每细胞畸变数或%)或微核率(每细胞微核数或‰),D为照射剂量(Gy),a为本底畸变率,b、c为回归系数。回归系数统计意义的检验用F检验,曲线拟合度检验用相关指数(R2)来检验,F检验、R2和剂量-效应曲线图均通过运用SPSS13.0统计软件得出。

2 结果

2.1 X线照射离体血诱发的淋巴细胞染色体畸变和微核的形态

2.1.1 染色体畸变的形态

X线照射离体血诱发的染色体畸变主要有无着丝粒断片、微小体、双着丝粒体(dic)及着丝粒环(r)等畸形(图1),畸变率随照射剂量增加而增高。

注:(1):细胞中可见3个双着丝粒染色体(dic);(2):细胞中可见1个着丝粒环(r)

2.1.2 微核的形态

从涂片的头至尾连续迂回分析全片的微核时,在部分淋巴细胞细胞的胞质中可见单个、2个甚至多个微核(图2),出现率随照射剂量增加而增高,且2个以上微核的细胞也随之增多。

注:(1):细胞中可见1个微核;(2):每细胞中可见2个微核;(3):细胞中可见3个微核

2.2 X线照射离体血诱发的淋巴细胞染色体畸变

2.2.1 X线照射离体血诱发的淋巴细胞染色体畸变率

从表1可见,人染色体畸变的自发率(本底值)很低,仅0.031%,照射后,各剂量点的双着丝粒、着丝粒环等畸变在0~5.0 Gy范围内,随着吸收剂量增加而增加,呈正相关。

2.2.2 淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的回归方程式

根据规范方程式[4]为:Na+b∑D+c∑D2=∑Y;a∑D+b∑D2+c∑D3=∑DY;a∑D2+b∑D3+c∑D4=∑D2Y。本实验n=8,将表2中各∑值代入规范方程式并解方程式(具体步骤略),得dic+r的剂量-效应曲线的回归方程式为:伥=1.004610-2+5.857010-3D+8.898410-2D2。

2.2.3 淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线运用SPSS13.0统计软件得出下表。

2.2.4 淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的回归方程的方差分析(F检验)

将表2中D和Y数据输入SPSS13.0统计软件,运用SPSS13.0统计软件得出淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线图,并得出剂量-效应曲线回归方程的方差分析结果,F=1725.961。

根据n=8-1=7,υ1=k(自变量个数)=2,υ2=n-k-1=5,F0.01(2,5)=13.27,P<0.01,结果表明,“双+环”细胞与剂量(Gy)的回归关系有高度的统计意义。

2.2.5 淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线拟合度相关指数(R2)检验

运用SPSS13.0统计软件得出淋巴细胞染色体畸变的剂量-效应曲线的相关指数R2=0.999,曲线的拟合度相关指数为0.999,说明曲线拟合度好。曲线的拟合度相关指数R2越接近1,表示拟合得越好。

从本实验结果来看,回归系数有高度的统计意义(P值<0.01),且曲线的拟合度好(R2为0.999)。

2.3 X线照射离体血诱发的淋巴细胞微核

2.3.1 X线照射离体血诱发的淋巴细胞微核率

表3显示,人淋巴细胞微核细胞和微核的自发率(本底值)很低,仅0.72‰。照射后,各剂量点的微核细胞率和微核率在0~8.0 Gy范围内,随着吸收剂量增加而增加,呈正相关。

2.3.2 淋巴细胞微核的剂量-效应曲线的回归方程式

根据规范方程式[4]为:Na+b∑D+c∑D2=∑Y;a∑D+b∑D2+c∑D3=∑DY;a∑D2+b∑D3+c∑D4=∑D2Y。本实验N=8,将表4中各∑值代入规范方程式并解方程式求出a和回归系数b、c,得淋巴细胞微核剂量-效应曲线的回归方程式为:伥=4.326010-3+2.324810-2D+1.427810-2D2。

2.3.3 淋巴细胞微核的剂量-效应曲线

运用SPSS13.0统计软件得出以下曲线。

注:Model:伥=a+bd+Cd2

2.3.4 淋巴细胞微核的剂量-效应曲线的回归方程的方差分析(F检验)

将表4中D和Y数据输入SPSS13.0统计软件,运用SPSS13.0统计软件得出淋巴细胞微核的剂量-效应曲线图,并得出剂量-效应曲线回归方程的方差分析结果,F=1190.864。

根据n=8-1=7,υ1=k(自变量个数)=2,υ2=n-k-1=5,F0.01(2,5)=13.27,P<0.01。结果表明,淋巴细胞微核率与剂量(Gy)的回归关系有高度的统计意义。

2.3.5 淋巴细胞微核的剂量-效应曲线拟合度相关指数(R2)检验

运用SPSS13.0统计软件得出淋巴细胞微核的剂量-效应曲线的相关指数R2=0.998。曲线的拟合度相关指数接近1,说明曲线拟合度好。从本实验结果来看,回归系数有高度的统计意义(P值<0.01),且曲线的拟合度好(R2为0.998)。

4 结论

X线属于低LET辐射,染色体畸变是指染色体结构和数目的异常,而微核是由分裂后期滞后的染色体断片、一条或多条染色体组成的小体,反映的是部分染色体结构畸变。辐射诱发的微核和染色体畸变存在直接相关关系,两者已被公认为诊断慢放病和辐射损伤[12]的主要参考指标。染色体畸变分析稳定性好,特异性强,可作为辐射事故照射估算的首选指标。然而,此方法阅片技术要求高,工作量大,大样本量的检测耗时长。CB法微核分析操作简单、计数迅速且阅片准确,适应大量分析[13],但存在个体敏感性差异和照射照射剂量大时淋巴细胞数量会减少等缺陷。因此,同时结合两种方法进行评估则会更及时和准确。

要确定医疗治疗方案和进行预后评估,估算事故受照者所受的剂量是受照射后的首要工作。此实验用直线加速器辐射离体血,人为造成细胞损伤,诱导细胞的染色体发生畸变[14]。然后,检测染色体畸变和微核,建立了染色体畸变和微核率剂量-效应曲线。结果表明,淋巴细胞染色体畸变和微核率与受照剂量呈正相关,与前报道相符[15,16]。通过剂量-效应曲线回归方程的方差分析(F检验)和剂量-效应曲线拟合度相关指数检验,证实本研究所建立的染色体畸变和微核率的回归系数有高度的统计意义(P值<0.01),且曲线的拟合度好(R2接近1)。因此,本实验染色体畸变和微核率的回归曲线成立,在0~5.0Gy范围内拟合的染色体dic+r畸变剂量-效应曲线的回归方程式伥=1.004610-2+5.857010-3D+8.898410-2D2,微核剂量-效应曲线的回归方程式伥=4.326010-3+2.324810-2D+1.427810-2D2,可用于本实验室对X线事故剂量估算的数学回归方程式。对本地区从事放射工作的卫生人员、企业人员及从事电离辐射的工作人员进行健康检查,评估其慢性受照剂量、出现受照损伤或受照事故时估算事故受照者所受的剂量,为及时确定医疗救治方案和进行预后评估提供依据。

摘要：目的 用X线照射离体人血检测染色体畸变和微核率,建立淋巴细胞染色体畸变和微核的剂量-效应曲线,用于受照者的受照剂量估算。方法 用BG-6B医用直线加速器在0～5.0Gy的剂量范围内分别选0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0 Gy共8个剂量点照射离体的健康人血,经细胞培养收获染色体并检测其畸变,用CB微核法检测淋巴细胞微核,建立淋巴细胞染色体畸变和微核的剂量-效应曲线,并用F检验和曲线拟合指数R2进行验证。结果 人染色体畸变和微核的自发率(本底值)很低,照射后各剂量点的染色体畸变和微核在0～5.0 Gy范围内,随着吸收剂量增加而增加,呈正相关。染色体畸变和微核的剂量-效应曲线的回归方程分别为伥=1.0046×10-2+5.8570×10-3D+8.8984×10-2D2和伥=4.3260×10-3+2.3248×10-2D+1.4278×10-2D2,经F检验,染色体“dic+r”细胞和微核细胞与剂量(Gy)的回归关系(P<0.01)有高度的统计意义,而曲线的拟合指数R2分别为0.999和0.998。结论 本实验建立的染色体畸变和微核剂量-效应曲线的回归方程式,经F检验和拟合度指数的验证,证明dic+r细胞和微核细胞与剂量的回归关系有高度的统计意义且曲线拟合度好,可作为本地区X线事故剂量估算的数学回归方程式,为慢放病、辐射损伤事故的医疗救治方案的确定和进行预后评估提供依据。

染色体畸变率 第3篇

关键词：多色荧光原位杂交,膀胱移行细胞癌,染色体畸变,复发

膀胱癌是我国泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,其中90%以上为膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional Cell Carcinoma,BTCC)。临床上常运用各种影像学技术如CT、MRI等,进行膀胱肿瘤的临床分期,对指导临床医师进行病程分析和手术方案的选择具有较为客观的参考价值。分子细胞遗传学技术-荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术通过检测尿脱落细胞间期细胞核染色体的数目或结构变化辅助诊断膀胱移行细胞癌,可用于BTCC临床分期和病理分级的评估。本研究运用M-FISH法,检测不同分期分级BTCC患者尿脱落细胞间期核染色体数目畸变的情况,以探讨此染色体组畸变情况与膀胱癌分期分级的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008年11月～2010年11月就诊于桂林医学院附属医院泌尿外科住院患者术前晨第2次尿液150 m L。46例BTCC血尿患者。其中,男33例,女13例,年龄24～81岁,中位年龄64.5岁;肿瘤的临床病理情况(膀胱肿瘤2002 TNM分期系统和WHO1973分级法):Ta～T114例,T216例,T310例,T46例;G114例,G220例,G312例。所有病例均经病理诊断为BTCC。

1.2 主要仪器、试剂

探针试剂盒Uro Vysion TM Bladder Cancer Kit(美国雅培Abbot-Vysis Inc);胃蛋白酶(SIGMA公司Cat:P6887,Lot.:074k77165);20SSC,20PBS(上海生工);聚赖氨酸玻片(福州迈新生物技术有限公司);9 mm and 2222 mm盖玻片(VMR International Borosilicate Glass);荧光显微镜(日本OLYMPUS2BX51);PCR仪(Thermo electron corporation HBPX2220);低温离心机(Thermo Labofuge400R);微量加样器(Eppendorf公司);电热恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);PH计(赛多利斯科学仪器有限公司);去离子水机(ELGA Labwater);迷你离心机(eppendorf AG 22331 Hamburg)。

1.3 实验方法

本研究M-FISH技术采用3、7、17号染色体着丝粒探针(Chromosome Enumeration Probe,CEP)和9p21区带探针进行检测。3号CEP为红色荧光信号,7号CEP为绿色荧光信号,17号CEP为蓝色荧光信号和杂交到9号染色体长臂(9p21)的P16探针为金色荧光信号。收集受检者新鲜尿液后,按照试剂盒说明书方法进行M-FISH实验操作。

1.4 判断标准及结果分析

荧光显微镜下观察,通过M-FISH点计数分析2.0软件控制的冷电荷耦合设备(CCD)相机摄取图像进行分析。实验的操作者与报告者处于盲态。结果判断的标准[1]:(1)每个探针在每个病例至少计数100个细胞核,部分患者尿脱落细胞少,达不到100个,按实际数目尽量多计数。细胞重叠、破损、以及淋巴细胞不计数。(2)各号探针在同一病例细胞核中信号强度应较为一致,微弱杂交信号不计数。(3)细胞核杂交信号相互靠近者计为一个信号。(4)将单体信号细胞核数>15%定义为单体,三体及多体信号细胞核数>10%定义为多体。如果尿脱落细胞间期核片上细胞很少,则单体细胞核数≥12个或多体细胞核数≥4个定义为阳性。(5)组合探针阳性判定标准:每个病例至少有4个细胞内2个染色体(除了9p21)表现为多体,或者超过12个细胞存在9p21的纯合性缺失。

1.5 统计学分析

采用SPSS 11.5统计软件行χ2检验,用于分析染色体组合探针阳性率与临床病理参数之间的相关性,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 M-FISH与BTCC临床分期的关系

使用M-FISH技术诊断膀胱尿路上皮癌,Ta～T1、T2、T3和T4的检出例数分别为7(7/14)、13(13/16)、8(8/10)和6(6/6),Ta～T1与T2～T4相比,其敏感性较低(P=0.027,<0.05),具体见表1。

2.2 M-FISH与BTCC病理分级的关系

使用M-F ISH技术诊断膀胱尿路上皮癌,在膀胱癌的病理分级中,G1、G2和G3的检出分别为6(6/14)、16(16/20)和12(12/12),经分析显示与病理分级有明显相关关系(P=0.003,<0.01),具体见表2。

2.3 复发性BTCC的染色体畸变率

在本组46例膀胱移行细胞癌病例中,12例为BTCC术后复发的患者。在进行术后血尿的M-FISH监测中,发现有83.33%(10/12)的患者被检测出结果为阳性,结合膀胱镜活检确诊其肿瘤复发。

3 讨论

与大部分恶性肿瘤一样,膀胱癌是一种多基因、多因素、多步骤参与的疾病,在经历了一系列的遗传学改变之后,遗传物质的不同变化持续累积,最终形成膀胱癌[2]。FISH技术是分子细胞遗传学最常使用的研究手段之一,其主要用于染色体数目和结构畸变的研究。在中期和间期细胞均可检测DNA序列及其变化,而染色体分析已被认为是许多恶性肿瘤的诊断和预后指标之一。相关研究表明,该技术克服了以往多种尿液或尿细胞检查方法在血尿、膀胱炎以及肠代膀胱的患者中假阳性率高的缺点[3]。本研究中,34例(34/46)出现血尿的膀胱癌患者,均能获得准确的阳性检测结果,进一步验证了该技术的抗干扰能力。从以往的研究来,FISH诊断膀胱癌的敏感性56.00%～86.00%、特异性约为86.00%～97.00%[4,5,6],在所有比较FISH与细胞学的文献中,对于各个期别和级别尿路上皮癌,FISH的诊断效果均优于尿细胞学。本实验结果显示,M-FISH诊断膀胱移行细胞癌的敏感性为73.91(34/46),其敏感性均高于以往尿脱落细胞学的相关研究结果。

CONSTANTINOU等[7]研究证实FISH的诊断灵敏度在膀胱肿瘤p T1、p T2、p T3分别为80.00%、100.00%和100.00%;RIESZ等[8]也曾报道FISH的灵敏度和特异性分别87%、100%,且指出肿瘤浸润程度与细胞染色体的变异度呈正相关。HOUSKOVA等[9]的研究则认为FISH的诊断灵敏度在膀胱肿瘤G1、G2、G3的灵敏度分别为63.60%、64.30%和91.70%。张业贵等[1]的研究显示,3、7、l7号染色体和9p21的畸变率分畸变与分期无相关性,与病理分级有显著相关性。在本研究中,M-FISH的灵敏度在膀胱癌Ta～T1、T2～T4分别为50.00%和84.38%,在膀胱癌G1、G2和G3分别为42.86%、80.00%和100.00%,显示染色体畸变程度与肿瘤的临床分期、病理分级有正相关(P<0.05)。

膀胱癌有易复发和复发后进展的特性,早期发现并给予积极治疗是提高临床治愈率的关键[10]。虽然分期、分级仍然是膀胱癌最重要的预后判断指标,但是,传统的病理分期、分级系统无法精确地预测部分肿瘤的生物学行为,尤其是对于T1期肿瘤[11,12]。膀胱癌的发生、发展经历了一系列的遗传学变化,揭示这些变化可能帮助发现有用的遗传学标志,以提高早期诊断水平,并使膀胱癌的预后判断、治疗更加个体化[13,14]。相关研究表明,荧光原位杂交技术具有监测术后复发[3]。本研究结果中,12例存在复发的膀胱尿路上皮癌尿脱落细胞标本中,就有10例M-FISH结果为阳性,畸变率为83.33%。本研究复发的病例数不够充分,但从这些统计数据显示的结果来看,与前人的研究结果相似,进一步证明染色体的畸变对膀胱癌复发的预测可能是个很好的指标。

染色体畸变率 第4篇

在TCC的发病过程中, 癌组织染色体异常表现极其复杂, 早期的细胞遗传学研究以及后来的比较基因组杂交 (comparative genome hybridization, CGH) 、杂合性缺失 (loss of heterozygosity, LOH) 等分子遗传学研究显示, 在TCC的发生、发展、分期、分级、治疗反应、预后评估中均易发生相当数量的非随机性染色体数目和结构的畸变。全基因组分析显示, 低分期、低级别肿瘤与较高分级、较高分期肿瘤相比, 具有更少的染色体畸变, 同时, 一些染色体畸变与肿瘤的进展及浸润有特异的相关性。膀胱的癌前病变中, 包括增生、不典型增生和原位癌也发现存在染色体异常。而且在TCC患者中, 形态学正常的尿路上皮也经常发现同病变部位相同类型的染色体畸变。本文就染色体畸变与TCC关系的研究进展作一综述。

1 TCC基因组研究

1.1 细胞遗传学

细胞遗传学一词可追溯到100多年前科学家在细胞核里发现染色体的时候。染色体显带技术的发展使科学家们能够识别不同的染色体, 从而在染色体水平上来了解许多疾病的遗传变异。但是, 细胞遗传学研究也有它的不足之处。首先, 受限于显带技术的分辨率, 检出像染色体微缺失综合征之类的微小染色体变异可能性很小;第二, 传统细胞遗传技术只能分析中期分裂相细胞, 而且, 许多肿瘤特别是实体瘤, 染色体改变非常复杂, 无法通过显带分析方法得到全部染色体核型。

早期的细胞遗传学研究显示, 9号染色体整体或部分的缺失是TCC中最常见的染色体畸变。Kinmra等[1]提出, 9号染色体上遗传物质的缺失, 即9号染色体长臂或短臂经常性的全部或部分缺失, 是TCC中最常见的基因改变。他们的研究结果表明, 9号染色体长臂上存在着1个或几个抑癌基因, 与TCC的发展有关。

细胞遗传学研究可以确立膀胱基因组的基本特征, 如一些染色体的畸变 (包括遗传物质的缺失或扩增) , TCC的进展是受抑癌基因的失活和癌基因的激活所控制等。然而, 这种方法不能直接确定与肿瘤相关的基因, 染色体带不足以阐明TCC中的基因变化;同时, 依赖于对肿瘤细胞的体外培养, 使这一研究仅限于能够在试管内生长的细胞。在荧光原位杂交的基础上建立的比较基因组杂交 (CGH) 技术很好地解决了这个问题。

1.2 CGH研究

CGH技术可以在一次实验中分析整个基因组的DNA序列拷贝的数目变化。将等量的被检测组织和正常对照组织全基因组DNA分别用绿色或红色荧光标记, 混合变性后与标记探针和正常的分裂中期染色体杂交, 杂交后对照各自的参考染色体分别计算和分析检测组织和正常对照组织的荧光比率。此项技术可以有效地检测染色体不平衡, 例如缺失、重复。应用CGH技术检测癌变过程中的不同阶段、肿瘤进展的不同时期及不同类型肿瘤的非随机性染色体改变, 有助于从分子细胞遗传学角度了解肿瘤的发生发展, 对发现肿瘤遗传学标记、初步查寻肿瘤相关基因的位置均具有重要意义。CGH也有缺点, 首先, 该技术只能检测非平衡的染色体重组, 对平衡染色体重组却无能为力, 不能检测出纯合性缺失;其次, 大部分CGH软件有自动核型分析软件包系统, 但是需要一定程度的手动干预;再者就是分辨率低, 一般只有大于10 Mb的非平衡改变才能被检测。

应用细胞分裂中期CGH技术对尿路上皮癌的研究, 发现了一系列复杂、广泛的染色体失衡[2,3,4]。虽然存在着一定的差异, 这些报道显示9p和9q的缺失在各分级和分期的肿瘤中都广泛存在;1q、3p、6p、8q、10p、17q和20q的扩增, 2q、5q、8p、10q、1q、13q、14q、和17p的缺失在T1和T2肿瘤中更加常见;6q的缺失、7p和Xq的扩增在T2～T4肿瘤中更加常见。

应用CGH技术, 细胞遗传学研究中的一些结论得到了证实, 例如9号染色体和11p的频发缺失。Fadl- Elmula[5]在45%的TCC患者中发现了9号染色体的部分或全部缺失, 这也是TCC患者中出现频率最高的细胞遗传学改变。对同一位患者, 对其首次发生的肿瘤和复发肿瘤的检测发现具有相同的基因扩增和缺失, 这提示促进原发肿瘤形成的基因在疾病发展过程中保持稳定。Prat等[6]最近应用CGH的研究证实了染色体缺失和疾病进展的关系。他们发现, 与染色体缺失关联的患者比与染色体增加关联的患者生存率更低。

基于基因芯片的CGH (array- based CGH, a- CGH) 技术是一种突破性平台, 这种平台能够支持研究人员通过微阵列准确研究与疾病有关的染色体的变化, 大大促进实验方法改进和科研成果的获得。a- CGH实际上有机地结合了芯片技术和CGH技术二者的优势, 在保留了CGH技术样本要求低、全基因组快速扫描等优点的同时, 解决了敏感性差、自动化程度低、操作复杂等技术问题。首先应用a- CGH对TCC进行研究的是Veltman等[7], 他们的研究发现了错综复杂的TCC染色体重组的更多细节, 确定了一些较小的基因改变, 以及8p23.1、9p21.3和11p13这3个位点的频发的杂合性缺失。通过对数据的分析, 他们鉴别出两个可能的目标基因:已知的9p21上的CDKN2A (p16) 基因、和11p13上的TRAF6、RAG1基因。研究还确定了7个高水平扩增的位点, 其中包括6p22上的E2F3基因、11q13上的CCND1和19q13上的CCNE1, 这3个基因都对细胞周期起正性调控作用。

1.3 LOH研究

长期的细胞遗传学研究证实, 几乎所有的肿瘤细胞都存在染色体片段的非随机性丢失, 也就是说这些丢失的片段中可能含有某些与肿瘤相关的基因, 这就是所谓LOH, 即一个位点上两个多态性的等位基因之一的丢失, 在肿瘤细胞中另一个等位基因突变失活。LOH是肿瘤细胞一种常见的遗传学改变, 往往涉及抑癌基因突变。

Simoneau等[4]报道, 在初次诊断的浅表性TCC中, 高级别的肿瘤与9号染色体的LOH有关, 而且较大的肿瘤中可见经常性的9p缺失。Edward等[8]应用荧光PCR法研究9号染色体的LOH与TCC复发的关系, 发现在复发组的肿瘤中, 全部被检测位点都存在LOH, 而且在复发后的原发肿瘤中存在高比例的LOH, 尤其在9q34位点。

3号染色体断臂的候选抑癌基因FHIT、hMLH和VHL在中国人TCC发生中起作用。国内高燕宁等[9]对40例TCC组织进行LOH分析, 结果显示, FHIT基因和hMLH1基因的缺失作为分子标志, 有可能为TCC的早期诊断提供新的途径和依据, 而VHL基因的缺失可能是TCC发生的晚期事件。

2 染色体畸变与原位癌 (CIS) 、不典型增生及增生

关于原位癌、不典型增生和增生的染色体畸变的结果也有所报道。Sean等[10]认为包括p53基因突变在内的染色体畸变谱与高级别CIS有很强的相关性。相对于这些高级别CIS, 低级别CIS复发几率高, 但很少呈侵袭性发展。对于发现高级别CIS的患者, 有必要采取更积极的治疗及更严格的随访。杨立新等[11]的研究发现, 突变的p53过度表达不仅揭示了TCC发生与发展的可能机制, 而且与TCC细胞分化恶化有着直接关系。低分化及高分期BTCC更倾向p53高表达, 提示随着膀胱肿瘤恶性程度的进展, P53蛋白表达率升高, 与Sean的结论一致。其他学者也发现, CIS和不同等级的不典型增生有着相似的染色体畸变。Zieger等[12]分析了12例CIS和4例轻度不典型增生者的资料发现, 12例CIS中有9例表现出类似于高级别肌层浸润性TCC的染色体畸变, 有3例没有表现出畸变。轻度不典型增生均没有检出染色体畸变。虽然样本数不多, 但是提示我们, 染色体畸变可能在不典型增生中已经发生, 而在CIS中可能发生复杂的基因重组。

增生也被发现存在染色体畸变。Hartmann等[13]应用荧光原位杂交技术 (FISH) 对12例增生的研究发现, 9例存在CDKN2A位点的缺失, 其中1例为纯合性缺失。Obermann等[14]应用CGH和LOH分析了10例TCC患者的增生病变, CGH分析显示10例中有5例为9号染色体缺失, 有8例为LOH, 说明9号染色体的缺失在这一癌前病变中有重要意义。van Oers等[15]应用LOH在24位病人中发现了7位存在9号染色体的频繁缺失。他们还发现增生中的FGFR3突变, 这是低分期、低级别乳头状TCC一种常见的典型的突变。总体来说, 增生和不典型增生具有相似的染色体改变。

3 染色体畸变与TCC的预后

不断积累的遗传学研究数据显示出了TCC基因组的一些特征。频发的改变如9号染色体、9p21、CDKN2A loci的缺失已经被鉴定;高级别肿瘤有更多数量的基因畸变, 其中很多畸变只在具有较强侵袭性的肿瘤中发现。基于基因特征和肿瘤行为之间表现出来的密切关系, 学者们开展了一系列探究将染色体改变作为TCC可能的预后因子的研究。美国食品药品管理局 (FDA) 批准了UroVysion系统用于TCC的检测, 并且应用此系统已经有了一系列的研究。UroVysion系统是基于对人类尿液标本的原位杂交并计数3、7、17号染色体的数量以及CDKN2A位点的拷贝数。然而, 在肿瘤检测中, UroVysion系统究竟能多大程度地替代标准细胞学检测一直存在争论[16]。2001年, 美国FDA批准TCC诊断试剂盒UroVysion (包含3、7、17着丝粒和9p21区带探针) 上市, 其敏感性高于尿细胞学检查, 而特异性较高, 这为TCC的无创性诊断提供了新的选择。对近期研究数据的评估可能会改变我们对TCC基因组的认识, 发现作为研究目标的特定位点。例如, 在早期的细胞遗传学分析中, 7号染色体的扩增经常被发现, 但是在随后的CGH分析中却很少见到。在侵袭性肿瘤中经常发生的其他染色体区域畸变包括:5号染色体短臂 (5p) 和6号染色体短臂 (6p) 的扩增, 17号染色体短臂 (17p) 和13号染色体长臂 (13q) 的缺失。研究发现, 17p和13q的缺失分别与抑癌基因TP53和RB1有关, 6p的扩增同致癌基因E2F3有关。

Cai等[17]研究了特异基因畸变与治疗反应的关系。他们调查了使用卡介苗 (BCG) 治疗时9p21缺失的预后判断作用。作者选择IFN- α基因作为9p21缺失的标记而不是广泛使用的与其很近的CDKN2A基因。他们的原理为:IFN- α参与由BCG治疗引起的免疫反应, CDKN2A的缺失不总是包括IFN- α的缺失。结果发现, IFN- α位点的缺失对BCG治疗的反应有显著影响。Eguchi 等[18]发现8p23缺失和预后有关, Tzai等[19]发现9p和14q LOH的同时存在与不良预后有关。Uchida 等[20]发现, 9p21 (CDKN2A位点) 和18q21 LOH的同时存在可作为预后判断的独立标记, 但是当它们单独存在时则与预后关系不大。虽然这些显著的关系已被发现, 但是其结果需要在更大的组群中复制才能证明其有用性。而且, 许多结果在单变量分析下得到, 还需要进一步的多变量研究。Tzai等和Uchida等的研究结果表明, 应该对多个染色体区域进行综合分析才能作为可操作的预后标记。这一结论与Prat等[6]和Blaveri等[21]应用CGH的研究结论一致。因此, 更加重视畸变数量和类型的研究, 而不是表现出来的某种特定畸变, 似乎是另一可行的途径。这也向我们提出了一个问题:基因本身的不稳定性是否以及如何影响TCC的预后。

Jin等[22]按照这一思路对TCC患者病理切片中分裂中期染色体桥进行计数。分裂中期桥的出现, 是由所谓的断裂- 融合- 桥循环 (染色体畸变的主要原因) 导致的染色体融合的结果。因此, 分裂中期桥的出现是持续发展的基因不稳定性的标志。Jin等的研究也表明分裂中期桥的出现可以对预后造成影响。基因不稳定性也受中心体功能的影响。中心体中作为细胞的主要微管组织中心, 在细胞周期中建立有丝分裂纺锤体, 调节细胞有丝分裂, 从而对维持染色体的稳定起着重要作用。中心体功能的改变可能导致遗传物质分配到子代细胞时发生障碍, 从而形成基因不稳定性。Jiang等[23]以膀胱冲洗液的细胞悬液为标本, 45例TCC患者的标本中有40例标本检出中心体扩增 (数目增多、体积增大、分布不规范) , 1、2、3级TCC标本细胞中心体扩增阳性率分别为69%、93%、100%, 而10例正常对照标本无一发现中心体扩增, 提示中心体扩增可用于TCC的早期诊断和判断预后。Yamamoto等[24]应用免疫组织化学评估中心体在TCC病理切片标本的地位, 结果显示, 中心体扩增与较短的无复发生存率、较短的无进展生存率均有显著关系。

4 TCC中形态学正常黏膜的染色体异常

一般认为, 基因改变的积累导致了肿瘤的进展。这些改变大多是不可逆的或者是不太可能因为偶然而复原。因此, 通过对患者多次复发肿瘤的基因改变的分析, 可能确定该患者的遗传学改变顺序。如果肿瘤的复发是起源于以前切除的肿瘤, 可以认为, 肿瘤的遗传学改变顺序应该与肿瘤复发年表相一致。为此, van Tilborg等[25]用LOH和突变分析研究了11位复发5次或以上的患者, 每位病人都建立了基于基因事件的复发年表。然而, 没有发现基因年表与肿瘤复发时间的相关性。具有复杂染色体改变的复发可以出现在只具有单一染色体改变的复发的很早以前。Lindgren等[26]运用CGH、LOH和突变分析的一项最近研究也有同样的发现。他们认为, 造成新近复发的肿瘤细胞在既往行肿瘤切除术时就已经存在于尿路上皮中。

TCC患者中癌前病变和形态学正常的尿路上皮中都观察到了基因改变, 使该结论得到了证实。FISH研究发现, TCC患者形态学正常的尿路上皮有着同肿瘤组织中相似的染色体改变。运用CGH和LOH也发现了正常尿路上皮中基因不稳定性的反复出现。因此, 染色体异常但形态学正常的细胞似乎与肿瘤的发生有着密切关系。大量的研究显示, 特定的基因改变可能存在于侵袭性、侵袭前期的尿路上皮肿瘤以及显微镜下正常的尿路上皮中。TCC患者中发生基因改变的区域可能覆盖了大部分的尿路上皮, 一些基因改变存在于所有病变部分, 而另一些基因改变则是分散出现如“岛”状。这些发现表明, 肿瘤发生于具有遗传学异质性的尿路上皮。由此人们可能感兴趣于通过局部切除肿瘤的特征来预测将来的肿瘤复发与进展。

5 展望

TCC的病因比较复杂, 与环境因素、社会生活条件、代谢紊乱、泌尿系统本身的疾患及遗传易感性有关, 其发生是多因素多阶段的过程, 但个体差异较大。TCC可能是多条染色体改变相互作用引起的, 单个染色体的改变并不能用来对TCC进行确诊。为了系统性地描述染色体改变, 一种称为ISCN的命名法 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature) [27]使更加有序地、精确地表示发现的染色体的改变成为可能。从目前TCC患者的染色体畸变的研究数据来看, 也许设计出一套更能反映基因片段对TCC发生发展重要性的标志物, 比关注于某一基因或位点的畸变更有意义。同时, 确立存在基因畸变的尿路上皮的肿瘤发生发展的信息, 可能还需要对尿路上皮进行遗传学异质性方面的更为深入的研究。

摘要：膀胱移行细胞癌 (简称膀胱癌) 患者常存在染色体的数目或结构的改变, 其发生、发展是染色体畸变累积的结果。本文就膀胱癌基因组研究方法、染色体畸变与原位癌、不典型增生和增生、染色体畸变与膀胱肿瘤的预后、形态学正常黏膜的染色体异常等方面作一综述。

染色体畸变率 第5篇

关键词：改良秋水仙素处理技术,染色体畸变分析

染色体畸变分析是放射工作人员健康监护和慢性小剂量受众远期医学效应评价的重要指标, 是最直接反映辐射损伤的检查项目之一[1,2]。秋水仙素处理是染色体分析实验中关键步骤, 常规方法是在细胞培养后加入秋水仙素处理, 然后再行收获、制片和染色[3,4]。本实验室根据长期的细胞遗传学工作经验, 改良了秋水仙素处理的方法, 采取细胞培养同时进行秋水仙素处理, 并取得良好的实验结果。现对该实验方法做如下分析。

1 材料与方法

1.1 材料

共采取30份样本 (均为肝素抗凝外周全血10 m L) 、RPMI1640培养基、秋水仙素 (20μg/m L) 、低渗液 (为0.075 mol/L氯化钾) 、磷酸盐缓冲液 (由浓度均为1/15 mol/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾以1∶1体积比混合, p H值为6.8) 。

1.2 方法

1.2.1 每个样本分成两份, 分别采用A方法和B方法进行细胞培养和秋水仙素处理。

A方法 (常规法) 秋水仙处理:用5 m L注射器取血0.3 m L, 接种到淋巴细胞培养液中, 培养50~54 h后, 加入秋水仙素工作液处理3 h (终浓度为0.07µg/m L) 。B方法 (改良法) 秋水仙处理:用5 m L注射器取血0.3 m L, 接种到己融化好的培养基中, 同时加入秋水仙素工作液 (终浓度为0.03µg/m L) , 将培养基混匀, 置于37℃恒温培养箱中, 培养50~54 h。

1.2.2 首先收集细胞, 将培养基倒入10 m L离心管中, 1000 rpm/min离心6 min。

弃上清液, 加入低渗液8 m L, 用滴管轻打混匀, 于温箱中静置15 min。预固定:加入固定液1 m L, 轻轻混匀。以1000 rpm/min离心6 min。固定:弃上清液, 加入固定液8 m L混匀, 静置20 min, 然后以1000 rpm/min, 离心6 min。再次固定, 弃上清液, 加入6 m L固定液, 静置20 min, 然后以1000 rpm/min, 离心6 min。弃上清后, 依细胞数量多少加入适量固定液, 约0.2 m L, 备用。

1.2.3 制片:

取细胞悬液滴在备用的湿冷玻片上, 在酒精灯上过火, 写上编号。

1.2.4 Giemsa染色:

Giemsa染液与磷酸缓冲液制成5%的工作液, 把晾干的载玻片反盖在上面 (细胞面朝下) , 将制备好的工作液灌满染色槽, 排出气泡, 染色20 min后用自来水冲片, 气干。

1.2.5 镜检:

在低倍镜下寻找分散良好, 长短适中的分裂相, 换用油镜对其进行细致观察, 每张片计数200个分裂相。计算每种方法的有丝分裂指数。

1.2.6 统计学分析:

本实验数据为计量数据, 自身配对实验设计, 利用SPSS 17.0软件进行t检验 (P<0.05时有统计学差异) 。

2 结果

2.1 制片后镜下观察细:

镜下观察, 两种方法处理后的细胞均生长良好, 分裂指数高, 能够满足分析要求, 染色体分散均匀, 着色良好, 长短适中, 两条姐妹染色体大致平行分离, 着丝粒清晰。根据每条染色体的大小和着丝粒的位置, 可区分中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。如下是制备完成的分散良好的染色体图片 (图1和图2) 。

2.2 30份样本经两种方法

(A常规法/B改良法) 秋水仙素处理后有丝分裂指数比较表, 见表1。

经SPSS 17.0软件计算后结果, 见表2和表3。

经过统计学运算, P>0.05, 可见两种方法所得有丝分裂指数比较, 无统计学差异。

3 讨论

总所周知, 常规法秋水仙素处理已经在染色体畸变研究中得到广泛的使用, 其可靠性毋庸置疑[5]。但由于该方法实验过程中需要多时间点监控, 所以各实验室在开展该项技术的初期, 经常会花费较多时间去摸索实验条件, 故学习曲线较长, 不利于实验技术的推广。我们实验室经过长期经验积累, 总结出改良法秋水仙素处理技术, 实践证明效果很好, 通过上述实验数据的统计学分析, 我们可以看出, 两种方法在实验结果方面并没有明显的统计学差异, 也就是说利用改良法秋水仙素处理可以得到和常规方法相同的实验结果。

在实践过程中, 我们也可以看到, 改良法具有以下几方面的优势: (1) 减少秋水仙素的用量和浓度, 可以减少秋水仙素的毒性所致的细胞毒作用。秋水仙素使用:我们将秋水仙素于接种时即与标本混合, 我们认为这样的好处首先是接触充分, 利于秋水仙素的作用;其次, 由于秋水仙素具有细胞毒性, 高浓度其镜下表现在可见细胞核及细胞质固缩, 着色深紫色, 细胞转化率低[6], 培养前混入秋水仙素, 可减少秋水仙素的浓度 (建议终浓度为0.03µg/m L) 和用量, 即减轻其细胞毒作用, 是提高实验效能的关键。 (2) 操作简便, 单时间点控制, 便于学习, 利于推广。实验方法上我们可以看到常规方法需要控制两个时间节点, 即培养结束加入秋水仙素的时间点和秋水仙素作用时间点, 两个时间点均须严格把控, 稍有失误, 就会导致实验失败。而改良法, 只需掌握一个时间节点, 即培养结束时间, 且由于秋水仙素浓度较低, 即便时间稍有延长 (<2 h) , 也不会影响制片效果, 也不会导致实验失败。所以改良法更利于学习, 利于技术的推广。

综上所述, 改良法秋水仙素处理技术便于学习, 利于推广, 且效果良好, 值得推广。

参考文献

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