纳豆激酶范文（精选5篇）
纳豆激酶 第1篇
蚓激酶是日本首先从蚯蚓中提取的具有降纤和溶栓作用多酶组分, 在体内可以直接降解血中纤维蛋白原及激活纤溶酶原为纤溶酶。
1 试验材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与蚓激酶
纳豆枯草芽孢杆菌由本校微生物实验室提供;发酵材料大豆购自食品市场;蚓激酶由珠海博康药业有限公司生产。
1.1.2 主要试剂与仪器
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、接种工具、恒温培养箱、离心机和游标卡尺。
1.1.3 培养基
纳豆枯草芽孢杆菌固体培养基与液体培养基。
1.2 方法
1.2.1 纳豆枯草芽孢杆菌的活化、培养与增殖
把纳豆枯草芽孢杆菌接种于优化的固体培养基, 优化培养基中葡萄糖与蛋白胨比例关系为0.2g∶1g, 硫酸镁0.2%, 氯化钙0.5%。培养24h后转接到液体培养基。
1.2.2 大豆的处理与发酵
取处于对数生长期的纳豆枯草芽孢杆菌37℃进行大豆的发酵18h。
1.2.3 纳豆激酶粗酶液的制备
发酵后的大豆加入PBS, 4℃冰箱保存24h。取上清液离心, PBS洗涤, 上清即为粗酶液。
1.2.4 纤维蛋白原-琼脂平板的制作
在每个培养皿中加入5mL凝血酶, 再加入15~20mL纤维蛋白原-琼脂糖溶液, 迅速小心振荡混匀, 室温静置过夜, 制得平板后打孔和标记。
1.2.5 溶栓对比试验
取等量粗酶液与蚓激酶液各5μL分别点样到不同标号的纤维蛋白-琼脂糖平板上, 37℃恒温箱24h后, 选择对照组与试验组最佳溶栓效果平板, 游标卡尺测溶圈垂直直径取平均值。
1.2.6 统计学方法处理数据
采用SPSS13.0统计软件进行方差分析处理数据。
2 结果
注:每行数据为等量两组的同时段溶栓效果比较, p<0.05。
在相同试验条件下, 以等量纳豆激酶粗酶液与蚓激酶同时作用于同质的纤维蛋白-琼脂糖平板相同时间, 以统计学方法检验得到p<0.05, 结果有统计学意义。
3 讨论
纳豆激酶溶栓机制部分表现为直接溶栓作用;刺激血管内皮细胞产生内源t2PA;激活体内尿激酶原转变为UK;降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂 (PAI21) 。
本研究通过把纳豆激酶与等量蚓激酶分别用药作用于纤维蛋白-琼脂糖平板的相同时段的溶栓效果作为试验结果测定依据, 以验证以不同机制对抗血栓的纳豆激酶与蚓激酶作用效果是否存在差异。研究表明:以等量纳豆激酶粗酶液与蚓激酶作为试验组, 同时作用于同质的纤维蛋白-琼脂糖平板相同时间, 同时用相同的方法分别选择最佳溶栓效果平板, 游标卡尺测溶圈垂直直径, 溶圈垂直直径数据为多次测量结果的平均值。以统计学方法检验得到p<0.05, 结果有统计学意义, 可以认为相同试验条件下, 等量纳豆激酶体外溶栓效果优于蚓激酶。
本研究测试出了等量纳豆激酶优于等量蚓激酶体外溶栓效果, 进一步确立了纳豆激酶的保健效能的地位, 为人类保健用药的选择提供了一种更便捷的方式。现阶段, 纳豆激酶的研究已经较为成熟。目前, 基于纳豆激酶特性研究方面, 方法新颖的首推日本利用了X射线衍射分析技术对纳豆枯草芽孢杆菌进行了研究;基于活性研究主要是通过发酵与培养条件的改变与培养基成分的优化实现的;基于转基因方面, NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达, 表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性;纳豆激酶基因在重组酿酒酵母中实现了分泌表达。基于基因研究方面已实现了T7表达系统代替质粒的研究, 表明了重组蛋白在枯草芽孢杆菌分泌高提出方法的巨大希望。
纳豆富含多种物质, 纳豆激酶在纳豆其他保健功能发挥中起着举足轻重的作用, 具体机制还需进一步研究。
摘要：本文在试验条件完全相同的前提下, 建立空白对照组与试验组 (等量纳豆激酶组与等量的蚓激酶组) 进行体外溶栓效果测试。结果表明:p<0.05, 结果有统计学意义, 相同试验条件下, 等量纳豆激酶体外溶栓效果比较优于蚓激酶体外溶栓效果。
关键词：纳豆激酶,蚓激酶,体外溶栓,纳豆枯草芽孢杆菌
参考文献
[1]陈志文, 徐尔尼, 肖美燕.纳豆激酶的研究进展[J].食品科技, 2002, 11 (2) :66-68.
[2]孙月娥, 王卫东, 李超.不同溶栓酶的特点、作用与临床应用研究进展[J].中国中药杂志, 2010, 35 (6) :794-798.
[3]Kwon EY, Kim KM, Kim MK, Lee IY, Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis, Biopro-cess Biosyst Eng.2011Feb20.[Epub ahead of print].
[4]Deepak V, Kalishwaralal K, Ramkumarpandian S, et al..Opti-mization of media composition for Nattokinase production by Bacil-lus subtilis using response surface methodology[J].Bioresour Technol, 2008, 99 (17) :8170-8174.
[5]宁树成, 李冀, 李丹丹, 等.纳豆激酶的体外溶栓作用研究[J].山东医药, 2006, 46 (32) :16-17.
[6]陈丽娟, 沙长青, 任永春, 等.纳豆激酶溶解血栓机制[J].中国生物工程杂志, 2003, 23 (4) :53-56, 61.
[7]Yanagisawa Y, Chatake T, Chiba-Kamoshida K, et al..Purifica-tion, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto[J].Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2010, 66 (12) :1670-1673.
[8]沙维, 刘妍妍, 张丽萍.发酵罐中生产纳豆激酶的条件与动力学研究[J].食品与发酵工业, 2010, l136 (12) :100-104.
[9]李永飞, 王正刚, 卢泽民, 等.固体发酵纳豆激酶培养基的优化[J].粮食加工, 2008, 33 (1) :58-59, 63.
[10]蔡立涛, 徐祥, 王婷婷, 等.纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备[J].中国生化药物杂志, 2010, 31 (1) :10-13.
[11]赵敏, 王开敏, 王福新.纳豆激酶基因在酿酒酵母中的表达[J].中国食品学报, 2009, 9 (4) :51-56.
纳豆激酶 第2篇
关键词：纳豆 纳豆激酶 油脂
中图分类号：TQ920.4 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）08-0001-04
1 引言
納豆是日本的一种传统发酵食品，由黄豆经过纳豆芽孢杆菌发酵而成[1]。生产工艺是将煮熟的大豆冷却后接种纳豆菌种，经过恒温发酵、4℃左右后熟等工艺制成，其成品有金黄的色泽，口感较为酥软，挑起时呈现出较长的拉丝现象[2]，当用纳豆与适宜作料配制后可制作成为可口的美食。纳豆激酶（nattokinase，NK）是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生。作为纳豆生产中的主要含有物，其重要的溶纤维和溶栓[3]等作用已经在临床以及保健品剂中得到了广泛的应用，同时因其副作用小、溶栓彻底等特点已经得到医学和养生学家的重视。
随着粮食作物成本及劳动成本的不断提高，降低成本资金投入，增大原料利用率、提高产品的提取率已经成为亟待解决的问题，因此，在成本不变甚至不断增加的情况下，降低原料的投入，扩大收益率，增加产率已经成为必要途径。本文研究了纳豆生产中油脂对枯草芽孢杆菌产酶的影响，通过此研究来确定油脂在纳豆发酵过程中对枯草杆菌产酶的影响，以便达到生产酶制品的同时对大豆油脂进行部分提取，以便降低成本，提高原料利用率达到生产原料的优化配置和转化，以实现企业效益的最大化。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 生产菌株
日本株式会社赠送，菌株类型为枯草芽孢杆菌。
2.1.2 主要仪器（见表1）
2.1.3 主要试剂及配制方法
2.1.3.1 主要试剂
分析纯试剂：三氯乙酸、磷酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、无水碳酸钠、氯化钠、盐酸、钨酸钠、钼酸钠、液体溴、硫酸锂、无水乙醇；生化试剂：干酪素、酪氨酸、酵母膏、蛋白胨、琼脂。
2.1.3.2 主要试剂配制方法
（1）2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素5.000g，浸泡于50mL 0.1N NaOH溶液中放入冰箱中过夜，水浴中加热煮沸使之溶解，再用pH7.5缓冲液定容至250mL的容量瓶中，放入冰箱贮藏。
（2）酪氨酸标准溶液：取酪氨酸放入105℃干燥箱中烘干至恒重，精确称取0.1g酪氨酸干粉，用少量0.2N盐酸溶解并用蒸馏水定容至100mL，浓度为1000μg/mL。
（3）Folin-酚试剂：称取钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）10g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）2.5g，加蒸馏水70mL于250mL的烧瓶中溶解。后加入85%的H3PO4 5mL，浓HCl 10mL，使用回流装置，使其慢慢沸腾10个小时。停止加热，冷却后称量硫酸锂（Li2SO4·H2O）15g，水5mL，液体溴2-3滴，开口继续煮沸15min，使溴水尽量挥发。待冷后用水稀释至100mL，过滤后放入深色瓶中，保存于阴凉处（假如呈绿色，应该继续加数滴液体溴，继续蒸煮15min），显色时加水2倍。
（4）0.4M三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸晶体6.536g用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，用棕色试剂瓶保存于避光干燥处。
（5）0.2M pH7.5磷酸盐缓冲液：准确称取Na2HPO4 23.876g；NaH2PO45.196g溶解于500mL蒸馏水中保存。
（6）0.4M Na2CO3溶液：准确称取无水碳酸钠4.2396g，溶解于100mL蒸馏水中保存。
（7）0.1N NaOH溶液：准确称取NaOH 0.4001g，溶解于100mL蒸馏水中。
（8）0.9% NaCl溶液：准确称取NaCl 0.9000g，溶解于100mL蒸馏水中保存。
2.1.4 培养基[4]
（1）LB固体培养基：NaCl 1.000g，琼脂粉1.500g，酵母膏0.500g，蛋白胨1.000g，pH7.0-7.5；（2）LB液体培养基：NaCl 2.000g，蛋白胨2.000g，酵母膏1.000g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.5。
2.2 方法
2.2.1 纳豆生产的工艺流程
2.2.1.1 种子液制备
（1）配制：用电子天平称取酵母膏1.000g；蛋白胨 2.000g；NaCl 2.000g；后用200mL蒸馏水溶解于500mL烧杯中；充分溶解，用玻璃棒搅拌均匀后，冷却至常温后用pH试纸测定pH值，后用1N的NaOH溶液调节pH在7.0-7.5之间，以达到发酵的要求；（2）分装：种子液配好后，冷却至常温后用100mL量筒准确量取50mL分装入4个250mL三角瓶中；（3）灭菌：将配好的液体培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，设置温度为121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌结束后置于超净工作台中冷却以待接种；（4）接种：取灭菌后的试管用移液器准确量取10mL无菌水，用接种针无菌操作粘取保藏于试管斜面的菌体（1-2环），溶解于无菌水（10mL左右）中，后使用涡流混悬器充分混匀，结束后，用移液器（移液管）分别取2mL菌悬液加入到4个（培养液50mL）灭菌后的250mL三角瓶中，摇匀后用4层纱布包好；（5）培养：将4瓶接种好的液体培养基置于恒温振荡培养箱中，设置温度为37℃，恒温摇床转速150rpm，培养时间为16h，作为种子液使用。
nlc202309031705
2.2.1.2 纳豆发酵过程[5]
（1）浸泡：分别称取20g豆粕，分装入8个标号（P1，P1+，P2+……P7+）的250mL三角瓶中，加入35mL或者60mL蒸馏水，根据浸湿情况适当增加或者减少加入水量（每个三角瓶中加水量相同），保证用手指按压时有湿润感但无水浸出，保证发酵过程的正常进行。搅拌结束后置于常温下放置16h左右，使豆粕充分吸水。 （2）蒸煮：取充分浸泡吸水的豆粕（搅拌观察浸水情况，适当添加，保持水分），用四层纱布和报纸包扎好后放入高压蒸汽灭菌锅中蒸煮，设定蒸煮温度121℃，设定高压蒸汽灭菌锅蒸煮时间为30min，使豆粕充分成熟。（3）接种：用移液器吸取培养后的种子液2mL，加入到在超净工作台中冷却（蒸煮后的豆粕冷却温度保证在40℃左右）的豆粕中。（4）油脂添加：接种结束后，按照梯度（0.00，1.00，1.50，2.00，2.50……4.00）加入大豆油脂，用玻璃棒搅拌均匀后用4层纱布包扎好。（5）发酵[2，3]：将接种后搅拌均匀的豆粕产品放入恒温培养箱中进行发酵处理，设定温度为35℃，培养时间为24h。（6）后熟：发酵结束后，调节恒温培养箱温度，重新设定为4℃，开始进行后熟处理，使豆粕充分成熟，保证豆粕原料的充分发酵，以达到风味和感官的优化。（7）水分含量测定：分别称取干豆粕粉、后熟的产品准确记录其质量，用红外水分测定仪测定其水分含量。
2.2.2 酪氨酸标准曲线的绘制
吸取稀释酪氨酸标准溶液，后用蒸馏水进行10倍稀释，按照表进行操作，后用移液器吸取稀释后的溶液1mL，加入0.4M的碳酸钠溶液，在40℃水浴中预热5min后用移液器加入1mL Folin-酚试剂，置于40℃水浴锅中显色20min后测定吸光值，绘制酪氨酸标准曲线。
2.2.3 纳豆激酶活力的测定[6，7]
2.2.3.1 粗酶液的提取
（1）浸泡：将后熟结束的发酵豆粕放入超净工作台中，无菌操作，从各个发酵的三角瓶中取出部分发酵豆粕，在电子天平上称取4g左右，将豆粕加入到标号的离心管中，后用移液管量取10.00mL的0.9%的生理盐水（0.9% NaCl溶液），搅拌均匀后，放置2h，并不时的搅拌以最大限度的使酶液得到浸提，将离心管平放于试验台。
（2）离心：浸提结束后，于离心机中进行离心处理，设定温度为15℃，转速5000转，离心10min以得到纳豆发酵的产品纳豆激酶的粗产品。
2.2.3.2 酶活力的测定[8]
（1）稀释：用移液器吸取离心后的粗酶液1.00mL，用49.0mL 0.2M pH7.5的磷酸盐缓冲液溶解稀释； （2）样品处理：①反应（A样品）：用试管分别取1.00mL稀释后的酶液，放入40℃水浴锅中预热，同时40℃预热2%酪蛋白溶液，准确预热5min后用移液器准确量取1.00mL酪蛋白溶液加入1号试管，同時用秒表准确计时，迅速振荡试管，使溶液混合均匀，保证纳豆激酶与酪蛋白充分接触，1min后加入第2管，按照上述方法依次重复第1管操作；10min后取出第1管，立即加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液终止酶促反应，振荡均匀后继续放入40℃水浴锅中放置15min，11min后取出第2管，按照第1管操作加入5mL 10%的三氯乙酸（AcCl3）溶液，依次重复，全部结束后，再次40℃水浴放置15min；②对照（A对照）：用移液器准确吸取1.00mL稀释后的酶液加入试管中，置于40℃水浴锅中预热5min左右，先用移液管准确加入5mL 10%的三氯乙酸溶液，并按照反应组操作，用秒表准确计时，摇匀后继续放入40℃水浴锅中保持15min，并不断震荡，使酶充分失去活性，15min后用移液器加入1.00mL 40℃水浴锅中预热的酪蛋白溶液，振荡均匀后，按照（i）中操作，用秒表计时后于水浴锅中放置10min；③过滤：酶促反应结束后分别把①，②中反应液过滤，留取滤液待用；④显色：分别取反应滤液、对照滤液、蒸馏水各1.00mL加入到3支试管中，分别加入5mL 0.4M Na2CO3溶液，振荡均匀后40℃水浴锅中预热5min，并用秒表准确计时，用移液器加入1.00mL Folin-酚试剂，并迅速振荡均匀，1min后加入第2管，依次重复操作，反应显色20min结束后迅速将显示液置于冷水中，以终止显色，减小误差；⑤OD值测定：显色结束后，用添加蒸馏水显色组作为对照进行调零，分别测定对照液和反应液的OD值以计算酶活力。
3 结果与讨论
3.1 酪氨酸标准曲线
在680nm处测定一系列酪氨酸标准溶液显色后的吸光度，以酪氨酸浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，从而得到标准回归方程Y=0.0101X+0.0055，其中相关系数R2=0.9970，酪氨酸浓度在0.01mg/L-1.00mg/L的范围内，其与显色剂Folin-酚试剂显色后的络合物吸光度呈现出良好的线性关系，因此可以根据此标准曲线（图1）对产酶结果进行有效分析。
3.2 油脂添加前后纳豆激酶活力测定结果
在10%接种量下，添加油脂梯度，分析大豆油脂在纳豆发酵过程中对枯草杆菌产酶的影响，其中油脂梯度如表所示，1号为为添加油脂的空白样，其余为梯度添加对照。
利用0.9%的氯化钠溶液进行发酵产品中纳豆激酶的提取，得到粘度相对较大的纳豆激酶粗酶液，经过pH7.5的磷酸盐缓冲液稀释之后，反应组进行正常的酶促反应，而对照组则先进行酶的失活，并以此为对照，将反应滤液用Folin-酚试剂进行显色反应，根据酶促反应后各个样品的吸光值（见表2）与酪氨酸浓度在一定范围内良好的线性相关性来计算纳豆激酶的活力（见表3）。
3.3 油脂单因素试验结果分析
此试验为小样本，同时有多个油脂添加梯度，需要进行多重检验，所以此分析可以采用F检验的方法对试验结果进行统计学分析，分析结果见表4。从表中可以得出，8个梯度油脂添加产生的酶活力变化间差异不显著，可以判断油脂在纳豆生产中对枯草杆菌产纳豆激酶的作用不明显，无明显差异。
nlc202309031705
再以表2中数据为基础，做出纳豆激酶测定中吸光值随油脂梯度变化曲线（见图2）。
从图中可看出，在显色反应中，吸光值随油脂添加量的变化出现波动，但是规律不是十分明显。同时，在添加1.5mL（每20g）后，纳豆激酶的活性有所提高，但随着油脂浓度的增加，纳豆激酶的活性没有提高的趋势，但根据多组平行试验的分析，以及方差分析结果得出，油脂在纳豆生产中对纳豆激酶的影响作用无显著变化。同时，在测定中发酵的厚度、取样范围及均匀程度均受到一定的限制和影响，因此在测定中便可能会带来很大的误差和波动。
4 结语
本论文利用枯草芽孢杆菌进行纳豆产品的发酵，并且采用不常用的油脂提取后的豆粕作为主要的发酵原料，以此为基准，通过外加大豆油脂来研究纳豆生产中油脂对枯草杆菌产酶的影响，期望以此来判断其影响，从而找到更加廉价的生产纳豆激酶的工业方法，从而达到降低成本的目的，经过单因素试验设计，得出的初步结果如下：（1）影响纳豆发酵产纳豆激酶的因素很多，本论文通过从原料出发，利用豆粕作为发酵基料，经过多组多批次的试验，分析得知，油脂在纳豆发酵过程对枯草芽孢杆菌产酶的影响无显著变化。同时，试验过程中发现在一定油脂含量范围内纳豆激酶的产量会有所提高，在油脂含量在8.64%（按豆粕油脂残留1%计）左右有较大酶活力，多次试验证明，但随着油脂的不断添加，纳豆激酶的出现不太规律的上下波动，趋势变化不明显。（2）在纳豆的取样分析时，由于发酵纳豆杆菌的好氧特性，发现在发酵过程中只有上部表層有白色粘稠类似物出现，三角瓶底部颜色较深，且发酵迹象不明显，所以可以看出在取样时会出现较大的误差，因此，在以后试验时要注意最优厚度的确定，并且尽可能在发酵过程中进行搅拌，达到发酵的均一化保证对所分析因素干扰的排除。
参考文献
[1]陈文珊，关茵，肖然等.辅料对纳豆风味影响的研究[J].中国调味品，2011，36（1）：55-57.
[2]刘振杰，郭伟鹏，张菊梅等.纳豆的保健功效及开发应用[J].热带农业工程，2010，34（3）：25-29.
[3]李轶平，戴贤君.纳豆芽孢杆菌的分离鉴定和抑菌评价[N].科技论坛，2010，（33）：76.
[4]姚笛，王月.纳豆菌的抗菌作用研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2009，21（2）：77-79.
[5]薄金岭.纳豆激酶高产菌株的筛选及发酵条件的优化.[J].大豆通报.2004，（2）：22-23.
[6]熊迎新，尹宗宁，杨超等.纳豆激酶活性测定方法的研究[J].药物生物技术，2006，13（2）：140-143.
[7]杨郁，张丽靖，董本祥等.固体发酵及干燥粉碎条件对纳豆激酶活性的影响研究[J].浙江农业科学，2008，241-242.
[8]李晶，王玉霞，王佳龙等.纳豆激酶活性测定方法的比较[J].黑龙江医药，2003，16（6）：507-509.
[9]魏华，赵祥颖，刘建军等.纳豆激酶溶栓活性的测定方法[J].食品与药品，2006，8（08A）：59-61.
高产纳豆激酶菌株的筛选鉴定 第3篇
试验从徐州地区农家自制的豆豉中分离筛选产纳豆激酶的菌株,对菌株进行鉴定,为纳豆激酶的生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样品
徐州地区农家自制的豆豉(俗称盐豆子),为黄豆先浸泡蒸煮,然后自然发酵,经调味晾干后得到。
1.2 主要试剂和仪器
牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、琼脂,购自国药集团化学试剂有限公司;Na Cl(分析纯),购自上海广诺化学科技有限公司;酪素,购自北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖(分析纯),购自天津市鑫铂特化工有限公司;HCl(分析纯),购自上海中泰化学试剂有限公司;Na OH(分析纯),购自广东光华科技股份有限公司;硫酸铵(分析纯),购自西陇化工股份有限公司;黄豆,市购;蔗糖(分析纯),购自北京化工厂;可溶性淀粉,购自北京红星化工厂;纤维蛋白原,Sigma公司产品;尿激酶,10 k U,购自CALBIOCHEM公司。
恒温水浴锅(XMTD-204)、高压蒸气灭菌锅(YXQ-SG46-280SA),购自上海博迅实业有限公司;恒温摇床(KYC-100C)、生化培养箱(MJ-300BS),购自上海维诚仪器有限公司;超净工作台(SW-CJ-2F),购自苏州净化设备有限公司;电炉,购自荣华仪器制造有限公司。
1.3 培养基
斜面培养基:为牛肉膏蛋白胨培养基,配方为牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、Na Cl 0.5%、琼脂2%,p H值为7.0~7.4,1×105Pa灭菌处理15 min。
筛选培养基:为酪素培养基[7],配方为琼脂2%、酪素0.5%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.1%、K2HPO40.1%、KH2PO40.05%、Mg SO40.01%,p H值为7.0~7.4,制作平板时先用素琼脂铺满培养基底,凝固后再倒入酪素培养基。1×105Pa灭菌处理15 min。
固体发酵培养基:选取小粒、颗粒饱满的新鲜大豆,将大豆彻底清洗后用3倍量的水浸泡24 h。用1 000 m L烧杯装入浸泡大豆,铺平,用8层纱布覆盖,包扎。1×105Pa灭菌处理30 min。
1.4 试验设计
1.4.1 纳豆激酶菌株的筛选
1)初筛。采集徐州地区农家自制豆豉样品36份,每种样品取豆豉10粒,加入含10 m L无菌水的试管中,振荡,制备菌悬液,37℃培养30 min。将菌悬液放入80℃的水浴锅中处理15 min,冷却至室温后,适当稀释后涂布在酪素培养基上,37℃倒置培养24 h,挑取有透明圈的单菌落,在酪素培养基上点种,每个单菌落接种到2个平板上,每个平板接种2次,共接种4次,分别测定透明圈直径和菌落直径,计算R值(透明圈直径/菌落直径),求出R平均值和标准偏差。选取R平均值较大的10个菌株进行斜面保藏并复筛。2)复筛。初筛得到的10株菌通过固体发酵后,称取1 g纳豆,加入3 m L生理盐水浸泡12 h,然后取20μL接种到纤维蛋白原平板上的牛津杯内,37℃培养24 h后测量透明圈的直径,对直径最大的菌株进行鉴定。
1.4.2 纳豆激酶菌株的鉴定
1)形态鉴定。将菌株在牛肉膏蛋白胨平板和酪素平板上画线,37℃培养24 h,观察单菌落形态,对该菌株进行革兰氏染色,观察菌体形态。
2)生理生化鉴定。根据东秀珠等[10]编著的《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行生理生化鉴定。将菌株接入细菌微量生化反应管,37℃培养12 h,考察对蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖、棉籽糖、肌醇、甘露醇的利用情况。将菌株分别在1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、18%Na Cl培养基中培养,观察渗透压情况。测定淀粉水解、明胶水解、牛奶水解、硝酸盐还原、亚硝酸盐还原、V-P反应情况。
3)16S r DNA序列鉴定。该菌株活化后提取DNA,PCR扩增16S r DNA序列,用Blast初步比对后选取同属内近缘种的16S r DNA序列,采用MEGA4.0软件进行序列比对和系统发育分析。该步骤在北京华大基因研究中心完成。
1.4.3 纳豆激酶活性的测定
1)纤维蛋白原平板法。制备纤维蛋白原平板,在纤维蛋白原平板上放置直径9 mm的牛津杯,吸取待测样品各20μL加到牛津杯中,37℃培养24 h。测定透明圈直径,计算面积,根据尿激酶标准曲线计算酶活性。
2)尿激酶标准曲线的绘制。将标准尿激酶依次稀释成浓度为100,200,300,400,500,600,700,800,900 IU/m L。在纤维蛋白原平板上放置直径为9 mm的牛津杯,吸取待测样品各20μL加到牛津杯中,37℃培养24 h。测定透明圈直径,计算面积,以透明圈面积为纵坐标、以尿激酶浓度为横坐标绘制尿激酶标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 产纳豆激酶菌株的筛选结果
在酪素培养基画线分离出产透明圈的单菌落后,挑取单菌落在酪素培养基平板上点接种,每个单菌落接种在两个平板上,每个平板接种2次,共4次,结果见图1。
分别测量透明圈直径和菌落直径,计算比值R(R=透明圈直径/菌落直径)。选出10株R平均值较大的菌株进行复筛,结果见表1。
将这10株菌进行固体发酵后,用纤维蛋白平板进行复筛,结果见图2。经复筛确定N148为透明圈最大的菌株,经计算菌株N148固体发酵生产纳豆激酶的酶活为1 360 IU/g湿黄豆。
2.2 纳豆激酶菌株的鉴定结果
2.2.1 形态鉴定
菌株N148在牛肉膏蛋白胨平板单菌落的形态见图3。
菌落为圆形,乳白色,边缘规则,较湿润,隆起,不透明。菌株N148在酪素平板的单菌落形态见图4。
菌落为圆形,乳白色,不透明,扁平,干燥,产生透明圈。对菌株N148进行革兰氏染色,菌体形态见图5。结果该菌呈革兰氏阳性,杆状,菌体内有圆形或椭圆形芽孢,芽孢中生或端生。
2.2.2 生理生化鉴定
见表2、表3、表4。
注:+表示能利用该糖,-表示不能利用该糖。
菌株N148能发酵蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、棉籽糖、甘露醇,不能发酵半乳糖、纤维二糖和肌醇。
渗透压试验结果见表3。
Na Cl浓度≤9%时,菌株N148均能生长良好;Na Cl浓度在11%~13%之间,菌株N148能生长;Na Cl浓度≥15%,菌株N148不能生长。
其他试验结果见表4。
菌株N148能水解淀粉、明胶、牛奶,能还原硝酸盐和亚硝酸盐,V-P试验呈为阳性。
注:+表示能生长,数量越多表示生长越好;-表示不能生长。
注:+表示阳性。
2.2.3 16S r DNA序列鉴定
菌株N148的16S r D-NA序列分析结果见图6。
该菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近,相似度达99%,结合菌落形态、菌体形态、革兰氏染色及生理生化试验结果,可以确认菌株N148为枯草芽孢杆菌。
3 结论
从徐州农家豆豉中经酪素培养基初筛得到10株R值较大的菌株,用纤维蛋白原平板进行复筛,得到的菌株N148产纳豆激酶能力较强,纳豆激酶酶活为1 360 IU/g。对菌株N148进行菌落形态、菌体形态、生理生化试验及16S r DNA鉴定,确认该菌株为枯草芽孢杆菌。
摘要：为了从徐州农家豆豉中筛选高产纳豆激酶的菌株,试验采用酪素培养基和纤维蛋白原平板进行筛选,通过形态鉴定、生理生化试验及16S r DNA分析对目标菌株进行鉴定。结果表明:筛选到一株产纳豆激酶能力较强的菌株N148,确认该菌株为枯草芽孢杆菌。
关键词：纳豆激酶,初筛,复筛,形态鉴定,生理生化鉴定,16S r DNA分析,枯草芽孢杆菌
参考文献
[1]SUMI H,HAMADA H,TSUSHIMA H,et al.A nove L fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia,1987,43(10):1110-1111.
[2]张杰,葛武鹏,张静,等.高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化[J].食品工业科技,2015,36(8):202-205,209.
[3]谢嵩,于宗琴,刘秀菊.纳豆激酶的制备及其降血脂功效研究[J].中国生化药物杂志,2015,35(1):17-20.
[4]李妍,吴庆红,陈义伦,等.一株纳豆芽孢杆菌的产酶条件优化[J].食品科学,2013,34(3):179-183.
[5]赵仲麟,李淑英,聂莹,等.纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究[J].生物技术通报,2015,31(3):161-164.
[6]李淑英,赵仲麟,聂莹,等.纳豆激酶研究进展[J].中国农业科技导报,2013,15(4):139-143.
纳豆激酶 第4篇
1 材料与方法
1.1 试验菌株
纳豆枯草芽孢杆菌菌株N148,徐州生物工程职业技术学院实验室从徐州农家豆豉中分离筛选并进行鉴定。
1.2 原料、试剂和仪器
豆粕,为加工豆油中产生的高温脱脂豆粕;麸皮,购自市场。
KH2PO4(分析纯),购自国药集团化学试剂有限公司;Na Cl、KCl、Ca Cl2(分析纯),购自上海广诺化学科技有限公司;酪素(化学试剂),购自北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖、木糖、乳糖(均为分析纯),购自天津市鑫铂特化工有限公司;Mg SO4、Mg Cl(均为分析纯),购自无锡市亚盛化工有限公司;HCl(分析纯),购自上海中泰化学试剂有限公司;Na OH(分析纯),购自广东光华科技股份有限公司;硫酸铵(分析纯),购自西陇化工股份有限公司;蔗糖、果糖(均为分析纯),购自北京化工厂;纤维蛋白原(生物试剂),购自Sigma公司;10 k U尿激酶,购自CALBI-OCHEM公司。牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、琼脂,自行配制。
高压蒸汽灭菌锅(YXQ-SG46-280SA),购自上海博迅实业有限公司;恒温摇床(KYC-100C),生化培养箱(MJ-300BS),购自上海维诚仪器有限公司;超净工作台(SW-CJ-2F),购自苏州净化设备有限公司;电炉(1000w),购自荣华仪器制造有限公司。仪器均由徐州生物工程职业技术学院实验室提供。
1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基(斜面培养基),配方为牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、Na Cl 5 g/L、琼脂20 g/L,p H值为7.0~7.4,1×105Pa灭菌15 min。
LB培养基(种子培养基),配方为胰蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、Na Cl 10 g/L,p H值为7.0,1×105Pa灭菌15 min。
1.4 试验设计
1.4.1 菌种的活化
从纳豆枯草芽孢杆菌N148保藏斜面中取一环菌苔,接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中,37℃培养36 h进行活化。
1.4.2 种子液的制备
菌种活化后从斜面上挑取一环,接入装有30 m L LB液体培养基的250 m L三角瓶中,37℃、150 r/min摇床恒温培养12 h。
1.4.3 单因素优化
单因素试验基础发酵条件是将豆粕用3倍的水浸泡12 h,取300 g湿豆粕装入1 000 m L烧杯中,自然p H值,接种量为5%,37℃培养48 h后测定发酵物纳豆激酶活性。在上述基础发酵条件下,分别考察麸皮添加量、速效碳源种类及其添加量、速效氮源种类及其添加量、无机盐种类及其添加量对纳豆激酶酶活的影响,确定各单因素的适宜范围。
1.4.4 响应面的优化
以单因素试验结果为基础,以纳豆激酶酶活为考察指标,每个因素选取3个水平,以(-1,0,1)为编码,对数据进行二次回归拟合,得到二次方程,能够分析各因素的主效应和交互作用,在一定条件下取得最佳值,然后在最佳条件下进行验证试验[5,6]。
1.4.5 纳豆激酶活性的测定
纤维蛋白原平板法:制备纤维蛋白原平板,在纤维蛋白原平板上放置直径为9 mm的牛津杯,吸取待测样品各20μL加到牛津杯中,37℃培养24 h。测定透明圈直径,计算面积,根据尿激酶标准曲线计算酶活[7]。
2 结果与讨论
2.1 单因素优化纳豆激酶发酵条件
2.1.1 麸皮添加量对纳豆激酶发酵的影响
在基础发酵培养基中分别添加0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%麸皮,考察不同麸皮添加量对纳豆激酶发酵的影响,结果见图1。
添加适量的麸皮有利于纳豆激酶的发酵,原因是麸皮除了含有丰富的营养成分外,更重要的是可以使培养基保持疏松,有利于氧气的传递。不添加麸皮或添加麸皮较少的培养基黏性较大,氧气传递效果差,不利于菌体的生长和纳豆激酶的发酵;添加过多麸皮会影响产品得率。综合考虑,麸皮添加量选择30%。
2.1.2速效碳源种类对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮,然后分别添加2%蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖作为速效碳源,比较各种速效碳源对纳豆激酶发酵的影响,结果见图2。
速效碳源添加有利于纳豆激酶发酵。葡萄糖由于更易于被微生物吸收和利用,可以使菌体迅速繁殖,对纳豆激酶产量的提高也更显著;而木糖较难被微生物利用,效果较差。遂选择葡萄糖作为速效碳源。
2.1.3 葡萄糖添加量对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮,然后分别添加1%、2%、3%、4%、5%、6%葡萄糖,考察葡萄糖不同添加量对纳豆激酶发酵的影响,结果见图3。
适当添加葡萄糖有利于菌体生长和纳豆激酶的发酵,但是葡萄糖过多会产生反馈抑制。由图3可以看出,葡萄糖添加量为2%时纳豆激酶产量最高。
2.1.4 速效氮源种类对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮、2%葡萄糖,然后分别添加2%硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素,考察不同速效氮源种类对纳豆激酶发酵的影响,结果见图4。
速效碳源有利于纳豆激酶的发酵。原因可能是速效氮源易于被菌体利用,有利于菌体的迅速繁殖,从而可以生产更多的纳豆激酶。由图4可以看出,尿素对纳豆激酶的发酵有显著影响,遂选择尿素作为速效氮源。
2.1.5 尿素添加量对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮、2%葡萄糖,然后分别添加0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%尿素,考察不同尿素添加量对纳豆激酶发酵的影响,结果见图5。
适量尿素有利于菌体生长,有利于纳豆激酶发酵;尿素过多会使菌体过度生长,从而使发酵后劲不足。从图5可以看出,最佳尿素添加量为1%。
2.1.6 无机盐种类对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮、2%葡萄糖、1%尿素,然后分别添加0.2%氯化钙、氯化镁、氯化铁、氯化钾、硫酸镁考察不同的无机盐对纳豆激酶发酵的影响,结果见图6。
各种无机盐对纳豆激酶的发酵均有促进作用,硫酸镁效果最为明显,原因可能是镁离子是多种酶的激活剂,硫元素参与含硫蛋白质的合成。因此,选择硫酸镁添加到培养基中。
2.1.7 硫酸镁添加量对纳豆激酶发酵的影响
在基础培养基中,加入30%麸皮、2%葡萄糖、1%尿素,然后分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%硫酸镁,考察硫酸镁添加量对纳豆激酶发酵的影响,结果见图7。
硫酸镁添加量对结果影响不大,说明低浓度硫酸镁即可以满足发酵的需要。遵守节约的原则,采用最少硫酸镁添加量,确定硫酸镁添加量为0.1%。
2.2 响应面优化纳豆激酶发酵条件
利用Box-Behnken试验设计选取(-1,0,1)3个编码水平,分别对应各因素的取值见表8,试验结果见表9。
通过Design Expert1软件对试验结果进行分析,获得回归方程如下:
对该方程进行方差分析,模型Pr>F值为0.0022,小于0.050 0;失拟项Pr>F值为0.496 2,说明该模型合理,可以用于分析和预测纳豆激酶发酵的优化。
295页彩图8为Y随X1、X2、X3变化的响应面分析,从图8可以看出变量与响应值、变量与变量之间的关系,而且回归模型确实存在最大响应值。该模型预测的最大值如下:当X1=40%,X2=1.8%,X3=1.2%时,Y=4 811 IU/g。为了检验模型的准确性,按照预测条件进行验证试验,所得纳豆激酶酶活为4 809 IU/g,与预测值接近。
3结论
以豆粕为原料优化纳豆激酶的固体发酵条件,通过单因素试验确定麸皮添加量为30%;由速效碳源选择葡萄糖,葡萄糖添加量为2%;由速效氮源选择尿素,尿素添加量为1%;由无机盐选择硫酸镁,硫酸镁添加量为0.1%。选择麸皮添加量、葡萄糖添加量、尿素添加量进行响应面试验,由响应面试验模型预测的最大值如下:麸皮添加量为40%,葡萄糖添加量为1.8%,尿素添加量为1.2%;其他条件为硫酸镁添加量为0.1%,接种量5%,裝料量30%,发酵时间48 h,纳豆激酶酶活为4 811 IU/g湿豆粕。为了检验模型的准确性,按照预测条件进行验证试验,所得纳豆激酶酶活为4 809 IU/g湿豆粕,与预测值接近,比优化前提高了1.6倍。
参考文献
[1]李建.发酵豆粕研究进展[J].粮食与饲料工业,2009(6):31-35.
[2]张杰,葛武鹏,张静,等.高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌优选及发酵工艺条件优化[J].食品工业科技,2015,36(8):202-205,209.
[3]谢嵩,丁宗琴,刘秀菊.纳豆激酶的制备及其降血脂功效研究[J].中国生化药物杂志,2015,35(1):17-20.
[4]王常苏,孙晓彤,余洁,等.纳豆激酶高活性菌株BN-05鉴定及发酵工艺优化[J].中国酿造,2014,33(1):91-95.
[5]齐凤元,李欢欢,杨利,等.响应面法优化花生纳豆的发酵工艺[J].中国粮油学报,2012,27(10):87-91,97.
[6]张健,高年发.利用响应面法优化丙酮酸发酵培养基[J].食品与发酵工业,2006,32(8):52-55.
纳豆激酶 第5篇
本次试验主要是研究本单位分离自纳豆的纳豆芽孢杆菌B.Subtlis HW236- 5, 经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定并保藏, 发酵大豆[3]提取的纳豆激酶在不同条件下的酶学稳定性, 采用纤维蛋白- 琼脂糖平板法测定纳豆激酶的酶活。在不同加热温度、p H、加热时间以及不同Na Cl离子强度时, 对纳豆激酶酶活稳定性的影响。
1材料和方法
1.1材料
纳豆激酶:以黑龙江省科学院微生物研究所筛选的纳豆芽孢杆菌HW236- 5 发酵大豆经提取获得。
试剂:实验涉及的试剂均采用分析纯、生化纯。
设备:电子分析天平、电热恒温培养箱、超净工作台等。
1.2 方法
1.2.1纳豆激酶的基础性质
纳豆激酶的分子量及等电点。
A.分子量的测定:采用SDS-PAGE电泳法
SDS-PAGE电泳法操作步骤:
a.将模具准备好, 并用适量的水溶液检测其是否漏水, 如果漏水, 做相应的调整至不漏水, 然后进行下面的操作。
b.在小烧杯中配制所需浓度的分离胶, 配置溶液所需体积按表1, 用玻璃棒搅拌使溶液混匀, 用移液枪吸取适量的凝胶溶液, 并小心加入到不漏水的模具内, 避免气泡的出现。加入分离胶结束后, 并在其上层加入一层水或者乙醇, 既隔绝空气又消除气泡, 保证凝胶表面的平整。
c.待分离胶凝结后, 在模具上层插入梳子, 并配制浓缩胶, 配置溶液所需体积按表1, 轻轻搅拌混匀后, 加至分离胶的上层。
d.将凝胶模具放入到电泳槽内备用, 并将配好的电泳缓冲液先加入到内部的电泳槽中, 使其没过最低的那个平板, 再往外部电泳槽中倒入电泳缓冲液, 从而使所制得的凝胶无论是加样的部位, 还是远离加样的部位, 都能够浸泡在电泳缓冲溶液中。
e. 将纳豆激酶样品与配置好的放置在4℃冰箱中备用的样品缓冲液按1∶5 的比例, 在带盖的试管中混合, 然后置于沸水浴中, 煮沸5 min后取出, 待混合液冷却后, 取10 μL混合样品加入到样品位置处。
f.通电, 直至样品线跑至凝胶的底端为止。
g.将凝胶取下, 放入培养皿中, 倒入染色液, 染色1.5 h;最后进行脱色处理。
h.将脱色处理后的凝胶, 用凝胶成像仪或者相机进行拍照记录。
B等电点的测定:采用Zeta电位测定法
纳豆激酶的等电点在8.6±0.3 的范围内, 故用酸碱溶液对纳豆激酶溶液调节p H, 使p H的范围在8.4~8.9, 并测定每一个p H下的Zeta电位。等电点为Zeta电位为零的点。
1.2.2 纳豆激酶的酶学特性研究
纳豆激酶酶活性质的测定是参照Astrup法制备纤维蛋白——琼脂糖平板, 并依据《中华人民共和国卫生部WS2011 (X2005) 95》中“尿激酶琼脂糖- 纤维蛋白平板法”进行测定。
1.2.2.1 试剂配制
A.磷酸盐缓冲溶液 (0.01 mmol/L p H=7.75) 。取磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O) , 磷酸二氢钠 (Na H2PO4·2H2O) 混合制备0.01 mol/L、p H=7.75 的磷酸盐缓冲溶液。
B.工作液。取磷酸盐缓冲液 (0.01 mmol/L) 与0.9%氯化钠 (即生理盐水) 按照1:17 的体积比混匀即可。
C.1%的琼脂糖溶液。取琼脂糖1 g, 加工作液100m L, 放置在微波炉中, 用中火加热3 min后, 即可溶解得到琼脂糖溶液。
D.纤维蛋白原溶液。取纤维蛋白原148mg, 加工作液配成0.3%的溶液, 便为纤维蛋白原溶液, 现用现配。
E.凝血酶溶液。取凝血酶20 BP单位 (5.24 mg) , 加生理盐水20 m L, 配成1 BP/m L的凝血酶溶液。
1.2.2.2 纤维蛋白———琼脂糖平板的制备
取经过微波炉加热溶解后的琼脂糖溶液16.2 m L置于烧杯中, 放入45℃水浴中保温, 同时将纤维蛋白原液16.2 m L、凝血酶液1.3 m L亦在45℃水浴中加热和保温, 待温度平衡后, 将三种液体混匀, 然后迅速倒入平皿中, 室温下放置30 min凝固即成。之后储存于4℃层析柜中待用, 并在使用之前对平板进行打孔处理, 用于纳豆激酶的酶活测定。
1.2.2.3 纳豆激酶活性测定方法
用移液枪吸取经过处理的酶液10 μL滴在平板上, 加盖, 在恒温培养箱37℃中培育18 h, 到时间后, 取出平板, 用千分尺测量平板溶解圈的两垂直直径, 以垂直两直径的乘积为酶的酶活。
1.2.2.4 纳豆激酶酶活标准曲线
根据纤维蛋白———琼脂糖平板测定方法, 以尿激酶作为标准品, 并以其相应的浓度作为横坐标, 经游标卡尺测量的相对直径的乘积, 所得的面积为纵坐标, 绘制标准曲线。
1.2.2.5 纳豆激酶的最适反应温度
用0.02 mol/L的磷酸盐缓冲溶液 (p H=7.4) 配制一定酶活力的纳豆激酶溶液。将酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃的水浴中保温30 min, 用纤维蛋白- 琼脂糖平板法测定其相对酶活。并以25℃的酶活力为100%, 其他温度下的酶活与其比值为该温度下的相对酶活。
1.2.2.6 纳豆激酶的最适反应p H
用磷酸———柠檬酸缓冲液 (p H=3~8) 、碳酸钠缓冲液 (p H=9~10) 及Na OH溶液 (p H=11) 配制酶液 (p H值取的间隔为0.5) , 并在温度为40℃的水浴中保温30min, 然后用纤维蛋白- 琼脂糖平板法测定其相对酶活。以其中最高酶活时的p H值相对应的纳豆激酶的酶活力为100%, 其余p H下的酶活与其的比值为该p H下的相对酶活。
1.2.2.7 纳豆激酶的保温时间稳定性
用p H为6.5 的缓冲溶液配置相应浓度的纳豆激酶溶液, 在40℃的水浴中保温不同的时间 (30 min、60min、90 min、120 min、150 min、180 min) , 然后用纤维蛋白- 琼脂糖平板法测定其相对酶活。以其中最高的残余酶活为相对酶活100%, 其他时间的残余酶活与其的比值为该时间下的相对酶活。
1.2.2.8 Na Cl浓度对纳豆激酶酶学性质的影响
在40℃水浴中、溶液为p H=6.5 以及加热时间为60 min条件下, 在酶的水溶液中添加不同浓度的Na Cl, 测定纳豆激酶在离子强度分别为0.15 mol/L、0.55 mol/L、0.95 mol/L、1.35 mol/L、1.75 mol/L时的酶活。以不含金属的相应纳豆激酶溶液的残余酶活为相对酶活100%, 其他相应的含有不同浓度Na Cl的纳豆激酶溶液的残余酶活与其的比值为该Na Cl浓度下的相对酶活。
2 结果与分析
纳豆激酶的分子量:
将制备的纳豆激酶样品, 经过Sephadex G- 75 凝胶层析纯化后, 利用SDS- PAGE法测定纳豆激酶的分子量, 并使所得到的样品与凝胶中的蛋白标品进行比较, 从而得到样品的分子量。实验结果如图1 所示。
由图1 可知, 第一条条带的是蛋白标准品, 分别显示不同的分子量, 从下往上依次为14.4 k Da、22 k Da、31 k Da、43 k Da、66.2 k Da、97.4 k Da 。所得到的纳豆激酶的条带在22 k Da~31 k Da。经测定纳豆激酶的分子量为28 k Da。
纳豆激酶等电点, 纳豆激酶在不同p H下的Zeta电位, 并选择zeta电位接近零时的p H, 进行相应的细分, 以能得到Zeta电位为0 时的p H, 该p H即为纳豆激酶的等电点。实验结果如图2 所示。
由图2 可知, 在p H=8.58 时, 纳豆激酶所带的电荷为零, 故此纳豆激酶的等电点为8.58。
纳豆激酶的酶活测定, 根据纤维蛋白- 琼脂糖平板测定方法, 以尿激酶作为标准品, 并以其相应的浓度作为横坐标, 经游标卡尺测量溶解圈的相对直径, 并以两直径的乘积为纵坐标, 绘制酶活的标准曲线, 结果如图3 所示。
得到纳豆激酶酶活的标准回归方程为:y=1.5695x+157.06, 其中R2=0.9805。表明此方法用于测定纳豆激酶的活性, 在浓度为20~100 U/m L时, 线性关系良好。
由纤维蛋白一琼脂糖平板法测定样本中的纳豆激酶的酶活, 经由游标卡尺测量后得到纳豆激酶的溶解圈面积为255.19 mm2, 并由图3 中的标准曲线计算可得, 样品中纳豆激酶的基本酶活为62 520 U/g。
以25℃时的纳豆激酶的残余活性为相对酶活100%, 其他温度下的纳豆激酶的残余酶活与之的比值为该温度下的相对酶活。实验结果如图4 所示。
由图4 可知, 随着温度的逐渐上升, 纳豆激酶的相对酶活是逐渐下降的趋势。在低温的环境下, 纳豆激酶的酶活受到的影响较小, 稳定性能够得到较好的保存;且纳豆激酶的酶活在40℃~55℃下降趋势明显;高温条件下, 纳豆激酶的酶活会完全失活, 丧失了其溶解血栓的能力。故而, 在对纳豆激酶的储存或者使用时, 都应该控制温度在40℃以下, 从而使纳豆激酶能够有较高的酶活。
不同p H对纳豆激酶酶活性质的影响, 实验条件为:水浴温度40℃、加热时间30 min、p H为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0。并以其中最高的纳豆激酶残余酶活为相对酶活100%, 其他p H下的纳豆激酶残余酶活与之的比值为该p H下的相对酶活。实验结果如图5 所示。
由图5 可知, 随着p H值的增加, 纳豆激酶的相对酶活会逐渐升高然后再下降, 最后纳豆激酶的相对酶活几乎为零, 也表示纳豆激酶在此p H的区间内, 完全失去活性。纳豆激酶的最适p H为6.5, 并且其可以在p H=4.5~8.0 时维持较高的酶活。
温度对酶活的影响具有不可逆性, 在高温下失活变性后, 酶的结构被破坏。酶在p H=6.5、水浴温度40℃下进行保温处理, 保温的时间对酶活稳定性的影响如图6。
在保温时间较短时, 对酶活起到了激发的作用, 促使酶活逐渐上升;当保温时间过长, 酶活随着时间的延长而逐渐降低。故在以后对酶进行应用研究时, 尽量控制酶反应的时间在60 min以内, 以保证在反应期间酶活能够保持较高的活性。
不同Na Cl浓度对纳豆激酶酶活稳定性的影响, 实验条件是:加热温度40℃、加热时间为60 min, 以不含金属的相应纳豆激酶溶液的残余酶活为相对酶活100%, 其他相应的含有不同浓度Na Cl的纳豆激酶溶液的残余酶活与其的比值为该Na Cl浓度下的相对酶活, 实验结果如图7 所示。
由图7 可知, 随着Na Cl溶液浓度的逐渐加大, 纳豆激酶的相对酶活呈现出先上升后下降的趋势。低浓度的Na Cl对纳豆激酶的活性有相应的促进作用;但当浓度较高时, 又会对纳豆激酶的相对酶活有一定的抑制作用。当Na Cl的浓度低于1.35 mol/L时, 纳豆激酶的相对酶活都有相应程度的升高, 尤其是当Na Cl的浓度为0.95 mol/L时, 纳豆激酶的相对酶活为最高, 其相对酶活为127.87%, 激活作用相对明显;但当Na Cl的浓度高于1.35 mol/L时, 纳豆激酶的相对酶活受到一定程度的抑制, 从而导致其相对酶活降低。
3 结论
通过本次试验研究, 测得经菌号HW236- 5 的纳豆芽孢杆菌发酵大豆提取的纳豆激酶的酶学特性, 纳豆激酶的分子量为28 k Da, 等电点为8.58, 酶活为62 520U/g;纳豆激酶的酶活稳定性随着温度的升高而逐渐降低;并且当温度足够高时, 纳豆激酶会彻底失活, 纳豆激酶应该在40℃以下进行储存以及应用;纳豆激酶在中性p H时, 能保持较高的活性;但当p H值偏向酸或者碱的情况下, 纳豆激酶的相对活性会相应降低。当p H=6.5~8.0 时, 纳豆激酶的相对酶活相对较高;但当p H<6.5 或者p H>8.0 时, 纳豆激酶的酶活急剧下降;纳豆激酶的酶活稳定性随着保温时间的延长, 会受到一定的损失;Na Cl在低浓度时对纳豆激酶的酶活起到相应的促进作用;但在高浓度时, 其对纳豆激酶的酶活起到一定的抑制作用。人体中的Na Cl浓度为0.155mol/L, 处于对纳豆激酶的酶活起促进作用的浓度范围内。因此, 在使用或者食用纳豆激酶时, 应该注意对Na Cl浓度的控制, 因为当Na Cl浓度超过1.35 mol/L时, 对纳豆激酶的酶活是起到相应的抑制作用的, 故应合理控制Na Cl浓度的大小, 从而使酶能最大化的发挥其作用。
摘要：本次试验所用纳豆激酶是由本所分离并命名的HW236-5纳豆芽孢杆菌, 发酵大豆经提取分离获得, 主要对纳豆激酶的酶学特性进行研究。采用SDS-PAGE法以及Zeta电位法分别测得纳豆激酶的分子量为28kDa, 等电点为8.58, 纳豆激酶的酶活为62520U/g。纳豆激酶在不同的加热温度时, 温度越高, 其酶活越低。NaCl在浓度低于1.35mol/L时, 对纳豆激酶的酶活起到促进作用, 但是高于此浓度时, 纳豆激酶的酶活明显受到了抑制。
关键词：HW236-5纳豆芽孢杆菌,纳豆,纳豆激酶
参考文献
[1]张玉岩.多功能保健食品纳豆的营养价值[J].湖南农机 (学术版) , 2013, 40 (2) :237.
[2][日]须见洋行, 马场健史, 岸丁明.纳豆中のづロウキナゼ活性化酵素と血栓溶解能[J].日本食品科学工学会志, 1996, 43 (10) :46-49.
[3]黑龙江省科学院应用微生物研究所.发酵大豆-纳豆及其成分的保健功能[M].哈尔滨:黑龙江人民出版社, 2005.
[4]刁建中, 陈桂光, 马波, 等.纳豆激酶的最新研究进展[J].轻工科技, 2012, 160 (3) :7-8.
[5]关海琳.药食两用纳豆激酶的研究进展[J].生物技术世界, 2014, (02) :82.
[6]赵仲麟, 李淑英, 聂莹, 等.纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究[J].生物技术通报, 2015, 31 (003) :161-164.
