基质金属蛋白酶基因（精选9篇）
基质金属蛋白酶基因 第1篇
1 对象与方法
1. 1 对象研究对象为2010 年5 月2012 年9 月期间在我院治疗的食管鳞癌患者, 所有患者均符合入选标准, 均经胃镜活检病理诊断为食管鳞癌; 患者在试验前未被诊断出其他的恶性肿瘤; 未进行手术、放疗及化疗等抗肿瘤治疗; 均签署知情同意书, 并报伦理委员会批准。入选患者共90 例, 其中男72 例, 女18 例; 发病年龄为40 ~71 岁, 平均发病年龄为 ( 55. 5 ± 11. 3) 岁。另外, 选取对照组50 例均为健康志愿者, 其中男39 例, 女11 例; 年龄38 ~68 岁, 平均 ( 53. 7 ±9. 6) 岁。
1. 2 方法取研究对象外周静脉血2 ml, 以乙二胺四七酸 ( EDTA) 抗凝, 加入等体积的生理盐水, 混合均匀, 再加入淋巴细胞分离液4 ml, 离心20 min, 取白细胞层, 继续离心5 min, 弃掉上清液, 放置于超低温冰箱中, 备用。
总RNA提取: 根据MiRNeasy Mini Kit试剂盒操作步骤, 从外周血白细胞中提取总RNA, 通过紫外分光光度计检测总RNA的纯度及浓度。并取总RNA溶液1 μl, 放置于1.5%的变性琼脂糖凝胶中, 利用电泳测定总RNA的完整程度。
逆转录: 根据PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit试剂盒操作步骤, 取1 μl总RNA进行cDNA的逆转录合成, 操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
PCR扩增: 使用Labnet莱伯特MultiGene II PCR仪, 采用25 μl的反应体系, 严格按照仪器的操作步骤进行, 激活聚合酶: 50 ℃, 2 min; 预变性: 94 ℃, 3 min;变性: 94 ℃, 30 s; 退火和延伸: 60 ℃, 35 s; 共扩增40 个循环。
1. 3 指标测定及评价标准MMP-9 表达的评价标准为: ①阳性: MMP-9 基因检测浓度不小于256 ng/μl;②阴性: MMP-9 基因检测浓度小于256 ng/μl。采用免疫组化S-P法, 由美国NeoMarker公司试剂盒进行测定ICAM-1 ( 细胞间黏附分子-1 ) 、NF-κB p50 ( 转录因子p50) 、COX-2 ( 环氧酶-2) 的表达情况, 严格按照试剂盒说明书操作, NF-κBp 50 蛋白以胞核着棕黄、棕褐色为阳性表达; ICAM-1 阳性表达定位于胞膜, 呈棕黄、棕褐色。采用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 定量检测血清中的MMP-2 含量, 阴性: <150 ng / ml, 阳性: ≥150 ng / ml。
1. 4 统计方法采用SPSS 13. 0 统计学软件进行统计处理, 计量资料数据以± s表示, 组间比较采用t检验; 计数资料进行 χ2检验, 以P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 MMP-9 在正常食管黏膜与食管鳞癌组织的表达对比MMP-9 在正常食管黏膜表达的阳性率为8. 0% ( 4/50) , 而在食管鳞癌组织表达的阳性率为62. 2% ( 56/90) , 两者的MMP-9 表达阳性率差异具有统计学意义 ( P <0. 05) 。见表1。
注: MMP-9基质金属蛋白酶-9。
2. 2 MMP-9 表达与临床病理特征的关系通过临床病理特征分组对比MMP-9 表达情况, 发现MMP-9 表达与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、组织分化程度均无统计学意义 ( P > 0. 05) 。而MMP-9 表达与TNM分期、是否存在淋巴结转移具有一定的关系, 差异具有统计学意义 ( P <0. 05) 。见表2。
注: MMP-9基质金属蛋白酶-9。
2. 3MMP-9 表达与MMP-2、ICAM-1、NF-κB p50、COX-2表达的关系MMP-9 表达与MMP-2 表达差异无统计学意义, 具有统计学意义 ( χ2= 5. 315, P < 0. 05 ) ; 而MMP-9 表达与ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 表达差异无统计学意义, ( P > 0. 05) , 将MMP-9 表达与MMP-2、ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 表达进行相关性分析, 发现MMP-9 表达与MMP-2 表达无关 ( P > 0. 05 ) , 而与MMP-2、ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 表达有关 ( P <0. 05) 。见表3。
注: ①将MMP-9 表达与各指标表达进行 χ2检验, 若P < 0. 05, 两者表达差异存在统计学意义; ②MMP-2 为基质金属蛋白酶-2, ICAM-1 为细胞间黏附分子-1, NF-κB p50 为转录因子p50, COX-2 为环氧酶-2。
3 讨论
MMP-9 基因作为MMPs家族的主要成员, 参与了创伤修复、血管形成、炎症反应及结缔组织病等多种生理病理过程。在肿瘤学研究方面, 因其可破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障, 使肿瘤细胞较易于突破原发部位, 而在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用[5-7]。本研究通过检测食管鳞癌患者外周血中MMP-9 的水平, 探讨MMP-9 在食管鳞癌发病中的意义, 为进一步研究食管鳞癌的发生、发展及治疗提供依据。目前, 国内外尚未有关于食管鳞癌患者血清中MMP-9 表达水平与食管鳞癌疾病活动度的相关报道。为了探讨血清中MMP-9 的表达水平与食管鳞癌疾病活动度之间的关系, 我们对食管鳞癌患者血清中MMP-9 表达水平及其临床病理特征进行分析。随着研究的深入, 更发现了MMP-9 基因的多态性与食管癌的发生、发展及预后都存在关联, 认为MMP-9 表达增加是促使食管发生癌变的早期事件。能否通过外周血的MMP-9 基因表达水平来评价患者的疾病状态, 是将该项成果转化为实践应用的一条可尝试的途径。
本文研究显示, MMP-9 在正常食管黏膜表达的阳性率为8. 0%, 处于较低的水平; 而在食管鳞癌表达的阳性率为62. 2%, 处于较高的水平。显然MMP-9 在食管鳞癌中表达出现了异常。在食管鳞癌患者血清中MMP-9 表达水平与食管鳞癌患者临床病理分级关系的分析中, 食管鳞癌患者血清中MMP-9 表达水平与食管鳞癌患者的淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关, 而与年龄、性别、T分期、组织分化程度无关。这提示MMP-9 的表达程度越高, 食管鳞癌患者的病理特征也就越明显, 这可能就说明MMP-9 表达水平与食管鳞癌疾病的进展存在着一定的关系。另外, 将MMP-9 表达与MMP-2、ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 表达差异进行统计学分析, 发现MMP-9 表达与MMP-2 表达存在着显著性差异, 这提示细胞来源不同, 在特定肿瘤中其表达和激活的调控也不一致。而与ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 表达差异不显著, 这说明MMP-9 表达与MMP-2表达不存在着联系, 而与ICAM-1、NF-κB p50、COX-2表达具有一定的关系, 这提示肿瘤转移进展是一个多因素参与的过程, 除了细胞外基质的降解和改建推动细胞迁徙和浸润外, 还受许多其他因素的影响[8]。
综上所述, MMP-9 在食管鳞癌患者中的表达高于正常食管黏膜中的表达, 而且MMP-9 表达与食管鳞癌患者发病年龄、性别、肿瘤部位、组织分化程度无明显关系, 但与TNM分期、是否存在淋巴结转移具有一定的关系, 与ICAM-1、NF-κB p50、COX-2 也存在着一定的关系。
摘要：目的 分析基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 基因在食管鳞癌患者中的表达及二者的关系。方法 选自2010年5月—2012年9月在河北省卢龙县医院治疗的90例食管鳞癌患者。同时选取健康检查者50例作为正常对照组, 对比两组的MMP-9基因表达水平, 并分析临床各指标与MMP-9基因表达的关系。结果 MMP-9在正常食管黏膜表达的阳性率为8.0% (4/50) , 而在食管鳞癌组织表达的阳性率为62.2% (56/90) , 两者的MMP-9表达阳性率差异有统计学意义 (P<0.05) ;MMP-9表达与年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、组织分化程度差异均无统计学意义 (P>0.05) , MMP-9表达与TNM分期、是否存在淋巴结转移具有一定的关系 (P<0.05) ;MMP-9表达与MMP-2表达差异有统计学意义 (χ2=5.315, P<0.05) , 而MMP-9表达与细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) 、转录因子p50 (NF-κB p50) 、环氨酶-2 (COX-2) 表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 MMP-9在食管鳞癌患者的表达高于正常食管黏膜中的表达, 而且MMP-9表达与食管鳞癌患者发病年龄、性别、T分期、组织分化程度无明显关系, 但与TNM分期、是否存在淋巴结转移具有一定的关系, 与ICAM-1、NF-κB p50、COX-2也存在着一定的关系。
关键词：食管鳞癌,基质金属蛋白酶-9基因,相关性
参考文献
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基质金属蛋白酶基因 第2篇
含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测
目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统--含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16-RGD)作为基因转染载体的`可行性.方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72 h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况.结果转染效率与K16-RGD和质粒的比例有关,转染体系中K16-RGD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EGFP有最高的表达效率.结论含RGD肽K16-RGD能有效介导外源基因在BMSCs内的转染和表达,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础.
作 者： 潘海涛 郑启新 郭晓东 刘勇 宋玉林 作者单位： 430022,华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 刊 名： 国际生物医学工程杂志 ISTIC PKU 英文刊名： INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICAL ENGINEERING 年，卷(期)： 2006 29(3) 分类号： Q78 Q813.1 关键词： 含RGD肽 绿色荧光蛋白基因 基因转染 骨髓基质干细胞
基质金属蛋白酶基因 第3篇
【关键词】 热痹康汤；关节炎，胶原诱导性；基质金属蛋白酶-3；实验研究；动物；大鼠
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因尚不明确的主要累及关节，以慢性、对称性多关节炎为突出临床表现的全身性自身免疫疾病。活动期的RA患者血清中基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）水平明显升高，提示MMP-3在RA的发病中起着重要的作用。本实验采用牛Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）和弗氏不完全佐剂诱导胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，观察热痹康汤对大鼠血清MMP-3的影响，探讨热痹康汤治疗RA的作用机理。
1 实验材料
1.1 实验动物 雌性Wistar大鼠50只，体重（100±10） g，购于广西中医药大学实验动物中心。
1.2 实验试剂 弗氏不完全佐剂、牛Ⅱ型胶原蛋白（由美国Chondrex公司生产）；MMP-3检测试剂盒（由南京建成生物工程研究所生产）。
1.3 实验药品 热痹康汤（由广西中医药大学附属瑞康医院新药研发中心制备提供），药物组成：秦艽15 g、防风10 g、桂枝10 g、威灵仙10 g、制川乌10 g、地龙10 g、桑枝15 g、葛根15 g、忍冬藤15 g、青风藤15 g、黄柏20 g、苍术15 g；甲氨蝶呤片【由上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，生产批号20070121】。
2 方 法
2.1 动物造模及分组 50只Wistar大鼠适应性喂养7天后，造模方法参照文献[1]方法进行：在无菌条件下，用0.1 mol·L-1冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白（浓度为4 mg·L-1），置冰箱4 ℃过夜后，再与等体积弗氏不完全佐剂（1 mg·mL-1）混合、震荡至充分乳化，制成CⅡ乳剂，置冰箱4 ℃保存备用。实验时于每只大鼠颈、背部多点皮内注射CⅡ乳剂0.25 ml，14天后再次注射（方法和剂量同上）。造模成功后（评分4分以上）随机分为模型组、甲氨蝶呤组、热痹康汤高剂量组、热痹康汤中剂量组、热痹康汤低剂量组共5组，每组10只。
2.2 给 药 模型组给予生理盐水2 ml·（100 g）-1灌服，每天1次；甲氨蝶呤组予灌服甲氨蝶呤药液2.7 mg·kg-1，每只约0.405 mg，每周1次；热痹康汤各剂量组，分别灌服热痹康汤（含生药16 g·kg-1、
8 g·kg-1、4 g·kg-1）2 ml·（100g）-1，每天2次。共治疗28天。
2.3 项目检测
2.3.1 关节肿胀评分 参照有关文献[2]采用0～4级关节评分法。0分：无关节炎；1分：小趾关节轻度肿胀；2分：小趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内全部关节肿胀；关节指数积分越高，关节症状越严重。评分4分以上为造模成功。
2.3.2 MMP-3检测 治疗结束后，腹腔注射水合氯醛将各组大鼠麻醉，腹主股动脉抽血，分离血清并放置冰箱-20 ℃保存备测。MMP-3的测定采用ELISA試剂盒，并按试剂盒说明进行检测。
2.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行数据分析，所有数据以表示，不同组间用方差分析及t检验。
3 结 果
治疗28天后热痹康汤各剂量组MMP-3水平均有降低，与模型组相比，差异有统计学意义
（P < 0.05）；热痹康汤高、中剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
4 讨 论
RA是一种系统性、全身性的免疫性疾病。其基本病理改变是滑膜炎，出现滑膜炎症、增厚、血管翳形成、软骨及软骨下骨质破坏，最终导致关节畸形。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一组在结构上具有极大同源性，能降解几乎所有细胞外基质成分的酶，主要参与组织重建与修复、炎症反应、伤口愈合、软骨基质的降解和骨吸收等，在关节炎等病理状态下，使基质发生不可逆的降解以及关节内炎症反应逐步加重，MMPs的异常表达可促进RA的发生和发展。
MMP-3是金属蛋白酶类的主要成员之一，是导致软骨降解最重要的蛋白酶，它在滑膜、软骨和软骨下骨的细胞外间质的降解中有着重要的作用，影响软骨的降解，使软骨基质崩解，从而导致软骨的破坏[3]。MMP-3能激活胶原蛋白酶、间质胶原酶及进一步的酶链反应，作用于软骨引起骨组织的破坏。同时，炎性浸润的滑膜细胞滑膜绒毛样生长形成血管翳；血管翳沿软骨表面逐渐侵入与软骨紧密黏连形成软骨-血管翳，促使软骨变性和进一步破坏[4]。国外有研究表明，在早期的RA患者中，外周血清MMP-3水平较正常人明显升高，并且与ESR、CRP、放射学评分、关节功能评定呈正相关[5，6]。
MMP-3在RA关节破坏中发挥着极其重要的作用，它是RA早期疾病活动的一个重要预测因子和炎症标志物，可作为反映病情活动指标以及滑膜损害和预后的预测指标。
热痹康汤是庞学丰教授治疗类风湿关节炎的经验方，具有清热利湿、除痹止痛之功效。我们用热痹康胶囊治疗湿热型RA患者发现，该药能明显降低患者的C-反应蛋白、类风湿因子、血沉、免疫球蛋白等实验室检测指标，能明显改善患者的临床症状以及关节功能，无明显毒副作用[7]。动物实验表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平，升高IL-4的水平[8，9]。本研究结果表明，热痹康汤能降低CIA大鼠血清MMP-3的水平，能减轻关节滑膜的炎症，是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一。
nlc202309030555
5 参考文献
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基质金属蛋白酶基因 第4篇
1 资料与方法
1.1 研究对象
脑梗死组:2005年6月~2006年12月本院神经内科住院患者共70例。男性40例,女性30例;年龄42~76岁,平均(57.7±10.2)岁,病程1~28d,平均(10±4)d。临床诊断为颈内动脉系统脑梗死,所有患者均经严格的神经系统体检、CT和MRI检查。有明显的肝、肾或心功能衰竭,严重的全身感染以及风湿性心脏病患者均排除在外。对照组:60名体格检查健康者。其中男性35名,女性25名;年龄43~70岁,平均(54.2±9.4)岁,无心脑血管疾病病史,血压、血脂及血糖均正常,眼底及神经系统检查正常。所有研究对象均为汉族非血缘个体,并排除肝脏疾病、肿瘤及结缔组织疾病。两组间年龄及性别构成差异均无显著性(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 血浆MMP-9水平检测
所有对象均清晨空腹取静脉血3 mL,肝素抗凝,将血浆完全去除血小板后,立即以-20℃低温保存待检。血浆MMP-9水平采用上海森雄科技有限公司的进口分装酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测,严格按说明书进行操作。
1.2.2 PCR-R FLP法基因分型
DNA的抽提:肘静脉血5mL,EDTA抗凝,采用低渗溶血、酚/氯仿法(饱和酚为AMRESCO公司产品)从白细胞中抽提基因组DNA,适量双蒸水溶解,核酸分析仪测定DNA浓度,-80℃保存。PCR扩增MMP-9C1562T位点及其侧翼区:引物由上海生工公司合成,上游引物为5'-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3',下游引物为5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3'。PCR反应体系为10Buffer2.5μL,d NTP(各10 mmol/L)0.5μL,上下游引物各6μmol/L,DNA模板0.1μg,Taq DNA聚合酶(BBI公司产品)2 u,加双蒸水至总体积25μL。反应条件:95℃预变性2 min,然后按94℃变性45 s,61.5℃退火45 s,72℃延伸1 min,重复35个循环,最后72℃延伸10 min。反应结束后,2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪检测PCR产物特异性。酶切反应:反应体系包括PCR纯化产物(试剂盒购自QIAGEN公司)1μg,10Buffer2μL,限制性内切酶SPh I(New England Biolabs公司产品)2.5 u,加双蒸水至总体积20μL,置37℃温育16 h,终止酶切反应,产物经2%琼脂糖凝胶电泳后,EB染色,凝胶成像系统判定结果。序例分析:对其中部分病例的PCR产物进行切胶纯化,于ABI377型全自动测序仪上作DNA序列测定,验证C1562T位点是否突变。MMP-9基因突变标准为CC基因型(435 bp)、CT基因型(435 bp、247 bp、188bp)、TT基因型(247 bp、188 bp)。等位基因频率=(2纯合子数+杂合子数)/(2受检人群)。
1.3 统计学方法
全部资料用SPSS10.0统计软件进行分析,各组基因型和等位基因频率比较用χ2检验,两组间均数比较采用t检验,P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 两组血浆MMP-9水平比较
对照组血浆MMP-9水平为(46.2±9.7)mg/L,脑梗死组MMP-9水平为(128.6±32.8)mg/L,脑梗死组血浆MMP-9水平明显高于对照组,差异有显著性(P<0.01)。
2.2 MMP-9基因C1562T基因型和等位基因频率分布
PCR扩增产物435 bp经SPh I酶切后,T等位基因被切为247 bp和188 bp两个片段,而C等位基因由于无酶切位点仍为一个435 bp的片段,从而存在3种可能的基因型,即纯合子CC(435 bp)、杂合子CT(435 bp、247 bp和188 bp)、纯合子TT(247bp和188 bp),部分样本酶切结果,见附图。PCR产物纯化后,并经测序验证。脑梗死组CT基因型频率与对照组比较差异有显著性(P<0.05),脑梗死组1562T等位基因频率分布与对照组比较差异亦有显著性(P<0.05),见附表。研究对象MMP-9基因型分布,经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡,表明患者来自同一群体。
注:覮与对照组比较,P<0.05
注:1:100 bp DNA Ladder;2、3:CT基因型;4:TT基因型;5~7:CC基因型
2.3 MMP-9基因型对血浆MMP-9水平的影响
C1562T位点CC基因型者血浆MMP-9水平为(72.5±24.7)mg/L,而CT/TT基因型者血浆MM P-9水平为(104.1±40.6)mg/L,两组比较,差异有显著性(P<0.01)。
3 讨论
动脉粥样硬化斑块根据其病理组织学特征,分为稳定性与不稳定性两种。不稳定性斑块内炎性细胞明显增多,增多的炎性细胞大量分泌MMPs,使MMPs水平增高,纤维成分降解加剧,从而导致斑块碎裂或斑块表面小血栓脱落,产生栓子,这是脑梗死、心肌梗死的高危险因素。REYNOLDS等[2]发现有5种蛋白质对脑梗死的特异性及敏感性较高,MMP-9便是其中之一。KALELA等[3]观察血浆MMP-9水平与冠状动脉造影结果,提出MMP-9与病情呈正相关,MMP-9水平越高,狭窄越严重,提示血浆MMP-9可以作为动脉粥样硬化及脑梗死等病情活跃的标志物。本实验结果显示,脑梗死患者的血浆MMP-9水平明显高于正常人,提示血浆MMP-9参与了脑梗死的病理生理过程。
MMP-9又称明胶酶B,分子量为92 k Da,活化后为84k Da,是基质金属蛋白酶家族中表达量最高的肠胶原酶,可降解人体内最丰富的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。这2种蛋白是血管内膜和粥样斑块纤维冒的主要结构蛋白,MMP-9在动脉粥样硬化的内膜中表达增加,多种细胞可分泌MMP-9,正常动脉内膜却未见此现象。在动脉粥样硬化的斑块边缘和泡沫细胞积聚的地方MMP-9含量同样增加,可见MMP-9通过降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,使纤维冒变薄,促进粥样斑块进入不稳定状态。已证实稳定、光滑、缓慢进展的斑块不会引起脑梗死,当斑块内出血、破裂时,会出现明显的临床症状[4]。推测MMP-9基因可能通过作用于脑动脉粥样硬化斑块而参与脑梗死的发生,由于血管内血栓形成、栓塞导致的脑动脉阻塞是脑梗死的主因,所以MMP-9基因多态性与脑梗死的关系更为密切。
C1562T多态性位于MMP-9基因的启动子部位,国外有研究认为,该变异可从转录水平影响基因表达调控酶蛋白合成的数量,其机制可能是由于该突变位点正好位于该基因与其转录抑制蛋白结合的区域内,当C突变为T后该结合区域的构型发生了变化,使基因与转录抑制蛋白结合的能力下降,从而转录抑制作用减弱,最终表现为启动子的活性增强,基因转录增强,蛋白质的表达量增加[5]。目前推测由于该突变位于基因的外显子部位,可能影响了酶蛋白的空间构象,使其与底物的结合力增强。当两位点的突变同时存在时,由于能通过上述两种不同机制共同增加酶蛋白的活性,因而MMP-9水平显著升高。本研究结果发现,脑梗死组MMP-9基因CT基因型频率和1562T等位基因频率高于对照组,两组比较,差异均有显著性,并且携带CT/TT基因型者血浆MM P-9水平较高,显示中国人中1562T等位基因与脑梗死发病有关。综合以往研究报道,T等位基因可引起MMP-9表达增加[6],提示C1562T基因突变可能通过上调MMP-9表达,使斑块易于破裂,而导致脑梗死发生,MMP-9基因T等位基因可能是脑梗死遗传易感性的基因标记之一。
参考文献
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基质金属蛋白酶基因 第5篇
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年6月~2011年2月在本院就诊的早期宫颈癌患者95例,年龄24~76岁,平均(49.07±12.38)岁。所有患者在采集标本之前均未经化疗和放疗。并收集同期进行健康查体的妇女120名的外周血标本作为对照组,年龄26~71岁,平均(47.26±10.65)岁。所有研究对象均来自本地汉族人群。
1.2 方法
收集全部受试者外周血标本,每例5 m L,经乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic,acid EDTA)抗凝,离心3 000 r/min,5 min,抽取白细胞层后置于EP管中,采用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,经紫外分光光度计测DNA。采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymor phism,PCR-RFLP)方法对MMP-7基因上的A-181G多态性位点进行基因分型。引物设计参考文献[1],上游引物5'-TG-GTACCATAATGTCCTGAATG-3';下游引物:5'-TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATGAATT-3'。PCR反应条件:预变性94℃3 min;变性94℃30 s,退火温度55.5℃45 s,延伸72℃30 s,共35循环;最后延伸7 min。PCR扩增产物经限制性内切酶Eco RⅠ37℃消化过夜后,于2%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。MMP-7-181A/G的A/A基因型为150bp,G/G基因型为120 bp和30 bp,A/G基因型为150 bp,120 bp和30 bp,因30 bp片段太小,故电泳后一般看不到该片段PCR。
1.3 统计学分析
SPSS 13.0统计软件,使用χ2比较正常对照组与早期宫颈癌组间基因型分布频率的差异。不同基因型的相对风险度用优势比(odd ratio,OR)及其95%可信区间(CI)表示。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
早期宫颈癌组中MMP-7-181G/G基因型分布频率为10.53%,明显明显高于健康对照组3.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-7-181A/G基因多态性中GG基因型是早期宫颈癌发病风险的危险因素,与AA基因型相比,GG基因型可使宫颈癌的发病风险增加约3.7倍(OR=3.698,P=0.026;95%CI=1.096~12.475)。但AG+GG基因型与早期宫颈癌的发病风险间无明显相关性(OR=1.419,P=0.207;95%CI=0.825~2.441)。
3 讨论
MMP-7为基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)中的成员之一,可降解细胞外基质和基底膜,参与肿瘤细胞周期调控、细胞增殖与分化、血管形成、转移灶的迁移等过程。MMPs基因家族许多成员均存在基因多态性位点,其中一些多态性位点对基因的功能具有影响。MMP-7基因启动子区-181 bp处的AG突变可通过产生热惊厥转录因子(hot transcription factor,HSTF)的结合序列NGAAN而改变启动子的转录活性,使m RNA转录水平发生改变,从而影响MMP-7蛋白的表达。研究表明[2,3,4],MMP-7在上皮细胞的过度表达与口腔鳞癌、肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌等肿瘤的发生、发展具有相关性。
本研究以外周血为标本,结果显示早期宫颈癌组中MMP-7-181G/G基因型频率明显明显高于健康对照组,差异有统计学意义,说明MMP-7-181A/G基因多态性中GG基因型是早期宫颈癌发病风险的危险因素,与AA基因型相比,GG基因型可使宫颈癌的发病风险增加约3.7倍(OR=3.698,P=0.026;95%CI=1.096~12.475)。SINGH等[5]对印度人群中150例宫颈癌患者和162例健康者MMP-7-181G/G基因型进行检测,结果显示基因型分布频率分别为29.30%和19.40%,差异有显著性,与本研究结论类似,但其分布频率较高,与本研究不同,可能与不同群体的基因多态性差异有关。MMP-7-181A/G基因多态性在其他肿瘤中意义也有报道,ZHANG等[6]研究发现MMP-7基因启动子区-181A/G位点的多态性与非小细胞肺癌、食管鳞癌等的易感性具有相关性。VAIRAKTARIS[7]等研究认为-181A/G位点的多态性与早期口腔鳞癌的发病危险度相关。吕中强等[8]研究表明G/G基因型较A/G基因型能够使<45岁的成人男性对星形胶质细胞瘤的易感性提高约3倍。LI等[9]在卵巢癌的研究中发现,与A/A基因型相比,等位基因-181G(A/G+G/G)携带者卵巢癌的易感性增加。以上说明MMP-7-181G/G基因型与多种肿瘤发生风险具有相关性,尽管宫颈癌的具体发病机制尚不完全清楚,但宫颈癌的发生受环境因素与遗传因素的共同影响,不同地域人群遗传异质性和基因多态性均参与宫颈癌的发病发展,其中基因多态性可决定了个体对肿瘤易感性的差异。对MMP-7基因启动子区-181A/G的研究,有助于筛选宫颈癌发病及早期宫颈癌淋巴转移的高危人群,为宫颈癌的预防和治疗提供线索。
摘要：目的 探讨基质金属蛋白酶-7(MMP-7)基因多态性与本地区人群早期宫颈癌的发病风险的关系。方法 采用病例对照研究方法,选取95例经组织病理学确诊为宫颈癌患者作为病例组和120例健康查体者作为对照组;提取两组的外周血DNA,采用限制性片段长度多态性法(RFLP)-聚合酶链反应(PCR)分析MMP-7的基因多态性。结果 早期宫颈癌组中MMP-7-181G/G基因型分布频率为10.53%,明显明显高于健康对照组3.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-7-181A/G基因多态性中GG基因型是早期宫颈癌发病风险的危险因素,与AA基因型相比,GG基因型可使宫颈癌的发病风险增加约3.7倍(OR=3.698,P=0.026;95%CI=1.096～12.475)。结论 MMP-7-181A/G基因多态性与早期宫颈癌的发病密切相关。
关键词：基质金属蛋白-7,基因多态性,宫颈肿瘤
参考文献
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基质金属蛋白酶基因 第6篇
1 MMPs的基本特点
MMPs是一组锌离子 (Zn2+) 依赖性的内源性蛋白水解酶家族, 几乎可降解除多糖外的全部ECM成分, 参与胚胎植入、伤口愈合、肿瘤转移、心肌重塑和动脉粥样硬化等重要生理病理过程。除MMPs-7外, 均包括3个同源性结构域;①前肽区结构域, 包含一小段约10 kD的信号肽, 引导新合成的酶分泌。同时, 此结构域使MMPs处于失活状态, 其他酶将其裂解后可激活酶。②催化结构域, 包括中心部位的锌离子和与之相结合的3个组氨酸, 促进酶与底物的结合。③C-末端结构域, 包含ECM的蛋白结合位点, 与酶的特异性有关, 各种MMPs特异性的差异就是由于该结构区域的不同而导致的。不同的MMPs都具有以下共同特性:①至少可降解一种ECM成分;②在pH中性环境中活性最佳;③每一分子MMPs需要两分子Zn2+和一分子Ca2+维持其稳定性;④可被其他蛋白酶或有机汞激活, 同时也可被金属离子螯合剂如乙二胶四乙酸 (EDTA) 抑制;⑤均为内肽酶, 能从肽链中间裂解产物;⑥通常以潜酶-抑制物复合体形式分泌到细胞外, 常位于底物附近, 并在细胞外激活;⑦除膜型MMPs外, 其他MMPs均可被相应的金属蛋白酶组织抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs) 抑制。
2 MMPs的分类
MMPs可分为2型, 4个亚群[2]。一是分泌型MMPs:此型MMPs以潜酶方式分泌到细胞外, 需蛋白水解酶激活, 包括胶原酶 (MMP-1、MMP-8、MMP-13、NNP-18) 、明胶酶 (MMP-2、MMP-9) 、基质水解酶 (MMP-3、MMP-10、MMP-11) 3个个亚群。二是膜结合型MMPs (MT-MMPs) :包括MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25。该型MMPs位于细胞膜上, 为ECM蛋白降解提供了特定位置, 并可激活其他种类MMPs (如MMP-2) , 且不受局部TIMPs的抑制。
通过近年的研究, 人们发现:心肌组织中MMPs主要来源于成纤维细胞等非心肌细胞, 其中又以MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、MMP-14与心肌重塑有关。
3 MMPs的活性调控
机体内的MMPs主要受5种形式的调节, 包括转录水平的调节、潜酶的活化、特异性TIMPs的调节、其他抑制因子的调节和负反馈调节。
3.1 转录水平的调节
①大多数MMPs的基因调节序列中, 在-30±2位置中含TATA盒, 此盒之前存在多种转录调节结合位点, 激素、细胞因子可直接与之结合, 或通过诱导C-fos、C-jun等原癌基因表达相应产物并与这些位点结合, 从而刺激MMPs转录。②有的MMPs转录起始部位还有转录因子的多瘤病毒增强子A3 (PEA3) 结合位点, PEA3可与ets基因产物结合, 是一功能性转录元件, 具有调节编码基质降解酶基因转录因子的作用。③MMP-2基因无TATA盒, 其表达很少受原癌基因影响, 属典型的看家基因。④细胞外基质金属蛋白酶诱导剂 (EMMPRIN) 是存在于心肌组织中的一种免疫球蛋白, 也可诱导MMPs基因表达。
3.2 潜酶的活化
MMPs均以潜酶形式分泌到细胞外, 在蛋白水解酶的作用下快速激活和动员, 主要有3种激活方式:①逐级活化:新分泌的MMPs前肽区含有高度保守序列PRCGVPDV, 内有一半胱氨酸残基, 它通过与催化部位的Zn2+相互作用而使酶处于失活状态。一些蛋白水解酶如纤溶酶、胰蛋白酶可将前肽区劈开, 使半胱氨酸与Zn2+分离, 从而暴露出Zn2+活性中心, 即被激活。由于整个过程均是酶活化, 因而具有瀑布级联效应。某些细胞因子如白介素-1 (IL-1) 可诱导纤溶酶原激活因子合成, 抑制纤溶酶原激活抑制因子合成, 使纤溶酶合成增加, 进而促使MMPs酶原激活。②细胞内活化:MT-MMPs与其他MMPs不同, 它们是在分泌过程中逐渐活化, 到达细胞膜时已呈活化状态。③由MT-MMPs激活:部分MMPs可被MT-MMPs激活, 如MT1-MMPs可激活MMP-2、MMP-13。
3.3 其他抑制因子的调节
α2-巨球蛋白可抑制所有蛋白水解酶, 但由于分子量太大, 难以进入结缔组织, 故对MMPs调节作用较弱。
3.4 负反馈调节
纤溶酶一方面激活MMPs, 引起ECM降解, 另一方面又诱导产生纤溶酶原激活抑制因子-1, 使纤溶酶的产生受限, 从而使其作用不至过度。
4 MMPs在心肌重塑中的作用
所谓心肌重塑, 是指在各种病因作用下, 心肌细胞出现坏死、凋亡和肥大, 心肌细胞外基质主要是胶原蛋白的类型、组织、连接结构和浓度发生改变 (即间质纤维化) 的过程。在这一过程中, MMPs扮演着重要角色, Battle等[3]发现扩张性心肌病致重度心力衰竭病人的心肌MMP-9表达水平下降;Felkin等[4]发现需要左心辅助装置的重度心力衰竭病人心肌MMP-1和MMP-8表达增高;Ahmed等[5]发现高血压伴左室肥厚的病人MMP-2和MMP-13表达下降, 而MMP-9增加;在Syrian豚鼠心肌病模型中, MMPs的活性明显升高, 且发生心肌重塑的心肌标本中MMPs活性升高更明显。Mori等[6]发现在转基因大鼠的MMP-3活性增加并可通过调节MMP-9促进心肌重塑和心力衰竭的发展。Ducharme等证实, 剔除MMP-9的大鼠发生心肌梗死后, 其左心室腔扩大延缓至梗死后15 d;过度表达肿瘤坏死因子 (TNF) 转基因小鼠, 早期出现MMPs活性增高, 后逐渐出现心肌总纤维胶原减少及左室的扩大。总的说来, MMPs在心肌重塑中主要作用有:①直接降解ECM中的胶原, 引起ECM退化, 从而心肌排列紊乱, 收缩功能异常。②增加 (趋化作用) 纤维细胞进入其作用后的区域, 引起胶原沉积, 使基质重量增加, 但质量下降。③介导许多物质的活化, 如TNF-α、转化生长因子-β (TGF-β) 及白介素-1β (IL-1β) , 这些物质一方面增加新胶原的合成, 并破坏心肌细胞;另一方面可促使MMPs表达增加, 构成恶性循环, 进一步加重心肌重塑。需要指出的是, 某种MMP在心肌重塑中到底起何作用, 除了取决于其本身的特异性, 还与其产生的时间、地点及底物有关。
5 国内外对MMPs及其抑制剂的研究进展
过去20年来, 各国学者尤其是以Weber、Schaper为首的研究小组对心肌ECM研究做了大量的工作, MMPs作为ECM的高效水解酶, 自然备受青睐。由于多种MMPs在心肌重塑、心力衰竭过程中均有不同程度的活性增高, 因此人们希望通过某种方式抑制MMPs活性, 以达到延缓甚至逆转心肌重塑的目的。理论上说, 抑制MMPs活性有如下方法:①加入外源性TIMPs;②减少局部MMPs的产生;③促进局部TIMPs合成;④研制人工合成的MMPs抑制剂。其中, 外源性TIMPs易受各种因素影响而发生变性和降解;人为加入某些细胞因子可减少局部MMPs产生或促进局部TIMPs合成, 但副反应较大。因此, 人工合成的MMPs抑制剂成为主要研究方向。Spinale等用MMPs抑制剂PD166793治疗快速起搏引起充血性心力衰竭猪, 减轻了左室扩张和后壁变薄程度, 并使左室功能得到改善。Rohde等在心肌梗死小鼠模型中证实, 早期应用MMPs抑制剂可以减轻左室扩张。虽然广谱MMPs抑制剂减缓了心肌重塑过程, 但它同时还会影响正常组织的重建, 引起不良反应如肌肉骨骼肌疼痛。因而, 选择性MMPs抑制剂成为研究的新热点。2003年King等[7]证实选择性MMPs抑制剂可在不影响正常组织结构和功能的前提下阻止心力衰竭中心肌重塑过程。
6 目前研究中存在的问题
尽管动物实验结果为MMPs抑制剂的临床应用展现出美好的前景, 但仍存在以下问题亟待解决:①心肌重塑、心力衰竭是一个逐渐进展的漫长过程, 在这一过程中, MMPs并非一直保持高表达, 而是呈现动态变化规律。在不同原发疾病致心肌重塑、心力衰竭的演变中, 活性增高的MMPs种类及变化规律是不尽相同, 不同时相中起主要作用的MMPs种类也是不同的。当临床医生面对心力衰竭的病人时, 又应当在何种时期选用何种选择性MMPs抑制剂?关于这方面的研究较少。②MMPs、TIMPs及各种细胞因子之间构成了一个复杂的调控网络。当使用MMPs抑制剂时, 网络中其他成员也会受到一定影响, 并间接作用于ECM, 从而可能干扰疗效。对于这一调控网络, 我们仍然知之甚少。③许多关于MMPs抑制剂的研究时间太短, 对其改善心功能及降低死亡率的长期效应尚不明确, 因此还不能对MMPs抑制剂的疗效贸然下结论。④使用MMPs抑制剂可能导致合并其他脏器纤维化疾病的病人出现病情恶化。
参考文献
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基质金属蛋白酶基因 第7篇
1 资料与方法
1.1 主要试剂与仪器
兔抗人MMP-1多克隆抗体、兔抗人MMP-3多克隆抗体、羊抗兔二抗、SABC免疫组化试剂盒 (购自武汉博士德生物) 。强脉冲光治疗仪:Lumenis One治疗仪 (美国Lumenis) 。UVB台式紫外线辐射仪SS-04B (sigma公司) 。HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统 (武汉千屏影像技术有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 成纤维细胞原代培养
皮肤标本取自本院正常儿童切除的包皮组织, 运用组织块贴壁法进行原代培养, 获得人皮肤成纤维原代细胞后将细胞常规培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中, 在37℃, 5%二氧化碳 (CO2) 温箱中传代培养。将处于对数生长期的细胞接种于培养板进行爬片处理后进行实验。
1.2.2 实验分组及干预
将实验细胞分为:A组 (正常对照组) :无UVB照射无IPL干预组;B组 (UVB照射组) :采用UVB (20 m J/cm2) 照射成纤维细胞无IPL干预;C组 (UVB+IPL干预组) :先用UVB (20m J/cm2) 照射成纤维细胞, 24 h后再用强脉冲光照射成纤维细胞, 强脉冲光选择590 nm滤光片, 采用双脉冲模式, 脉宽1为3.0 ms, 脉宽2为5.0 ms, 延迟40 ms, 能量密度20 J/cm2, 照射1次, 培养48 h后进行免疫组化检测细胞中金属基质蛋白酶-1 (matrix metalloproteinases-1, MMP-1) 、金属基质蛋白酶-3 (matrix metalloproteinases-3, MMP-3) 的表达。
1.2.3 MMP-1、MMP-3表达水平检测
依照免疫组化试剂盒说明书对三组细胞进行染色, 以PBS代替一抗作为阴性对照。一抗浓度均为1∶100稀释。阳性结果为胞浆或胞膜着棕黄色。通过HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统测定平均光密度值。
1.3 统计学方法
数据以均数±标准差 (±s) 表示, SPSS 13.0进行t检验, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP-1在三组间成纤维细胞的表达
MMP-1在正常对照组中仅有少量表达, B组MMP-1表达显著增加, 与A组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。C组MMP-1表达较B组显著下降 (P<0.05) 。 (图1, 附表) 。
2.2 MMP-3在三组间成纤维细胞的表达
MMP-3在A组中表达较弱, B组MMP-3表达较正常对照组显著增加 (P<0.05) 。C组MMP-3表达较B组降低 (P<0.05) 。 (图2, 附表) 。
A:正常对照组;B:UVB照射组;C:UVB+IPL照射组
A:正常对照组;B:UVB照射组;C:UVB+IPL照射组
注:1) 与该指标A组比较, P<0.05;2) 与该指标B组比较, P<0.05
3 讨论
光老化于1986年首次定义为, 皮肤慢性暴露于某些环境主要是紫外线 (UV) 辐射后出现的变化, 临床上光老化皮肤特点为皱纹、粗糙、松弛、脆性增加、色素变化、毛细血管扩张以及伤口愈合延迟[3,4]。目前用来改善光老化的方法主要有药物和手术治疗。药物治疗中维甲酸被认为是具有抗光老化皱纹形成的作用, 但由于其皮肤刺激性及致畸性副作用限制了它的应用[5];而其他药物如各种维生素等均作为皮肤的保护剂使用, 其对皮肤光老化的疗效并不十分理想[6]。注射肉毒素以及一些整形手术治疗虽可取得明显的改善皱纹的效果, 但仍然存在一定的风险, 可能出现疤痕、过敏、表情不自然等副作用[7,8], 而且对减轻皮肤静态纹理的效果欠佳。自从上世纪90年代初强脉冲光应用于临床嫩肤治疗至今, 它已经成为对抗皮肤老化的一线治疗方案之一。大量临床观察证实了它的效果, 本研究发现IPL治疗光老化皮肤可以减轻皱纹, 达到皮肤亮白细嫩的目的。IPL是一种发出宽波长 (400~1 200 nm) 的强脉冲光源, 在波长515, 550, 570, 590及616 nm存在阻塞过滤器, 防止短波长射线发射。各种参数修改使其治疗灵活, 这些参数包括波长、能量密度、脉冲足迹、脉冲持续时间、脉冲延迟、脉冲序列和皮肤温度控制。光通过血液吸收, 增加血管周围温度, 使周围组织热损伤, 引起炎症介质释放, 诱导愈合过程。学者推测治疗效果可能与IPL对皮肤内靶色基如黑色素、血管及胶原本身等的光热作用和光生物学效应有关, 但其具体机制仍有待阐明[9,10,11]。
大量研究证明, 胶原蛋白的减少是皮肤形成皱纹的一个重要原因, 而成纤维细胞是皱纹形成过程中最主要的效应细胞。一方面, 紫外线导致成纤维细胞合成抗氧化酶的能力下降, 诱导成纤维细胞凋亡, 抑制其增殖活性, 从而导致胶原蛋白合成降低[12,13]。另一方面, 基质金属蛋白酶 (MMP) 促进了胶原及其他细胞外基质的降解。在皮肤衰老过程中, 成纤维细胞分泌MMP增多, 同时紫外线、自由基也可刺激成纤维细胞产生MMP增加[14,15,16], 而基质金属蛋白酶抑制剂TIMP被认为对皮肤衰老有保护意义, 在衰老成纤维细胞中表达减少[17,18]。本研究发现MMP-1与MMP-3在正常对照组中仅有少量表达, UVB照射组MMP-1与MMP-3表达显著增加, 与正常对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。说明MMP-1与MMP-3参与了UVB诱导的皮肤光老化过程。
本研究还发现强脉冲光治疗UVB照射后的人成纤维细胞, 增加的MMP-1和MMP-3较未治疗组显著降低 (P<0.05) , 说明强脉冲光可能通过减少MMP的表达而达到减少胶原蛋白降解的作用, 真皮随后出现胶原纤维重塑及新的胶原蛋白形成。除了原有理论认为的强脉冲光可以促进胶原合成, 其对胶原的保护作用也同样显著。IPL的光热机制[19,20]是以不同色团为靶点并预热, 在靶点及周围组织间产生温度差异, 临床治疗后在真皮可制造出目标区域热损伤, 而对表皮没有影响。有研究发现[20]IPL不仅通过增加胶原产生, 还可以通过减少胶原降解达到效果, 这与本研究结果一致。综上所述, IPL临床可有效祛皱和嫩肤, 这些可能是通过影响MMP-1和MMP-3表达来实现的。
摘要：目的 观察强脉冲光 (IPL) 照射人皮肤成纤维细胞后金属基质蛋白酶-1 (MMP-1) 、金属基质蛋白酶-3 (MMP-3) 表达的变化, 探讨强脉冲光嫩肤的分子生物学机制。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞, 分为三组:A组 (正常对照组) :无UVB照射无IPL照射;B组 (UVB照射组) :采用UVB (20 m J/cm2) 照射成纤维细胞;C组 (UVB+IPL照射组) :先用UVB (20 m J/cm2) 照射成纤维细胞, 24 h后再用强脉冲光照射成纤维细胞。培养48 h后采用免疫组化检测细胞中MMP-1、MMP-3的表达。结果 UVB照射后成纤维细胞中MMP-1及MMP-3表达较对照组显著升高 (P<0.05) , C组成纤维细胞MMP-1及MMP-3表达较B组显著降低。结论 强脉冲光能显著抑制UVB导致的成纤维细胞MMP-1、MMP-3的表达升高, 可能通过该机制改善光老化中皱纹的形成。
基质金属蛋白酶-9与脑梗死 第8篇
1 MMP-9的生物学特性
MMPs是一类活性依赖于锌、钙离子的内肽酶[1], 由巨噬细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞产生, 在正常组织中低剂量表达, 在特定的生理及病理条件下表达增多, 如白细胞介素-1 (IL-1) 、白细胞介素-6 (IL-6) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、转移生长因子 (TGF-β) 等可刺激MMPs合成, MMPs被激活后几乎能降解除多糖外细胞外基质 (extrcellularmatrix, ECM) 的所有成分, 其功能特征包括: (1) 降解ECM成分; (2) 潜在形式是未知的, 需要活化; (3) 它们的活性部位包含Zn2+; (4) 它们需要钙以加强稳定性; (5) 在中性p H值时起作用; (6) 它们能被特异的MMPs组织型抑制剂 (tissue inhibitors ofmetalloproteinases, TIMPs) 所抑制[2]。其中MMP-9是基质金属蛋白家族的重要成员之一, 主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、眀胶、纤维连接蛋白等[3]。MMP-9的活性受酶基因表达、酶原激活及抑制剂的调控。在转录水平, 许多生长因子和组织因子 (IL-1、血小板源性生长因子、TNF-α等) 均可诱导MMP-9合成增加;而TGF-β、肝素、可的松等则抑制MMP-9的合成。MMP-9抑制剂包括内源性MMP组织抑制剂 (TIMP-1) 和α-巨球蛋白。人为调节MMP-9与TIMP-1之间的平衡, 抑制MMP-9、增强TIMP-1, 有可能成为治疗脑血管病的新途径。
2 MMP-9在脑梗死中的病理作用
国外通过尸检脑梗死及脑出血患者死亡6 h内的脑组织, 发现在梗死、梗死周围的脑组织及出血的脑组织MMP-9水平均显著增高, 在梗死脑组织, MMP-9主要位于血管周围, 来源于渗出的中性粒细胞及激活的神经胶质细胞, 而在梗死周围的脑组织, MMP-9主要来源于神经胶质细胞, 提示MMP-9表达增高与脑组织坏死及周围脑组织水肿关系密切[4]。
研究显示, MMP-9在脑缺血-再灌注后表达上升[5], 通过降解基底层的胶原蛋白和层黏连蛋白以及和血-脑屏障相关的紧密连接蛋白 (zonulaoccludens-1, ZO-1) [6,7], 破坏血管壁和血-脑屏障的完整性, 从而引起脑水肿和梗死后出血发生。
3 脑梗死患者MMP-9的变化趋势
临床研究发现MMP-9随病程进展呈现先升高后逐渐下降至正常水平的动态变化趋势, 高峰多出现在发病第2~5天, 2周后逐渐降至正常水平。国外研究通过检测脑梗死患者发病后第1、2、4、8天及第12天的血浆MMP-9水平, 发现血浆MMP-9水平在脑梗死后第1天即迅速升高, 可持续至梗死后第12天[8]。魏汝云等[9]选取124例急性脑梗死患者, 测定其发病后24 h内、第5天和第14天时血清中MMP-9的含量, 发现脑梗死患者血清中MMP-9含量24 h内迅速上升, 第5天达高峰, 第14天明显下降, 与正常对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。高宝山等[10]用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测30例脑梗死患者发病后第1、3、7、15天的血浆v WF、VEGF、MMP-9的浓度, 并选取20名体格检查正常者作为对照组, 结果脑梗死组血浆v WF、VEGF、MMP-9浓度显著高于对照组, 并且在第1、3、7、15天浓度的变化有显著差异。上述研究均说明MMP-9水平的升高呈动态变化, 与脑梗死病程密切相关。
4 MMP-9与脑梗死面积
脑梗死早期诊断至关重要, 早期检测MMP-9水平可在CT显示病灶前预测梗死灶体积。章昀等[11]研究显示, 血浆MMP-9水平与脑梗死面积呈正相关, 而与神经功能缺损程度评分无明显相关性, 提示血浆MMP-9水平可以反映脑梗死灶面积大小。高宝山等[10]通过动态监测脑梗死患者血浆MMP-9水平, 并比较不同梗死部位及梗死面积患者的血浆MMP-9水平, 发现MMP-9水平与脑梗死面积呈正相关, 而与梗死部位无关。魏汝云等[9]研究表明, 脑梗死面积越大, 血清MMP-9水平越高, 并随病程变化呈现动态变化, 而且在大面积脑梗死组中其动态变化趋势表现最为明显。
5 MMP-9与脑梗死后脑出血转换
脑梗死后的出血性转换是急性缺血性卒中继发的最严重的并发症, 使患者的预后恶化及死亡率增高。研究证实, 缺血、低氧和再灌注损伤导致血-脑屏障通透性增高以及血-脑屏障完整性破坏是脑梗死后出血性转换的主要机制, 而MMP-9在此过程中起重要作用。研究显示, 血管周围的中性粒细胞是MMP-9的主要来源;MMP-9在梗死及出血转化区增多, 而且激活的MMP-9在出血转化区尤其增高;在缺血区的血-脑屏障微血管基底膜处MMP-9显著增高, 而血-脑屏障微血管基底膜的严重降解可使含有MMP-9的中性粒细胞渗出及红细胞溢出, 从而导致脑缺血后出血性转换的发生[12]。
溶栓作为急性缺血性脑血管病有效的治疗手段, 而溶栓后出血性转换的发生是影响溶栓疗效和安全性的主要因素, 因此, 了解溶栓后出血性转换的发生机制以降低这一并发症具有重要的临床意义。研究显示, 组织纤溶酶原激活物r-PA可促进中性粒细胞释放MMP-9, 增强MMP活性, 从而导致出血并发症的发生[13]。相反, 动物实验发现, 在应用t PA治疗脑梗死实验动物前, 给予MMP抑制剂能显著降低t PA治疗后出血并发症的发病率和严重程度[14]。这些研究表明, MMP-9参与了t PA溶栓治疗后的出血性转换。同时, 国外实验证实, MMP-9基线水平能预示rt-PA治疗后脑实质出血的发生情况[15]。因此, 检测发病早期MMP-9浓度可预测溶栓治疗的安全性。
6 MMP-9与脑梗死患者预后的关系
多项临床研究提示MMP-9是判断脑梗死近期预后的重要指标之一。国外研究显示, MMP-9在梗死后第7天水平与NIHSS计分无关, 而与梗死后3个月校正的Rankin计分呈正相关, 提示MMP-9水平可预测脑梗死患者的近期预后[16]。另有研究显示, 基线MMP-9水平与脑梗死当时的脑组织损伤面积无关, 而与脑梗死后24 h内脑组织损伤面积的扩大呈正相关;而且MMP-9水平与基线状态的NIHSS计分无关, 但与随后神经学上的结局呈正相关, 即MMP-9水平越高, 患者的预后越差, 提示MMP-9可对脑梗死患者的预后有预测价值[17]。魏汝云等[9]的研究也表明脑梗死急性期血清MMP-9水平、白细胞计数可能与脑梗死患者近期预后有密切的关系。
综上所述, MMP-9与脑梗死关系密切, 不仅参与了脑组织的损伤、脑梗死后血-脑屏障的破坏、周围脑组织的水肿, 而且在脑梗死后发生出血性转换中起重要作用;而且MMP-
9 可预测脑梗死后出血转换、溶栓治疗后脑出血并发症的发生及脑梗死患者的预后, 对指导临床治疗有重要意义。
摘要：本文通过详解MMP-9的生物学特性和MMP-9在脑梗死中的病理作用, 研究脑梗死患者MMP-9的变化趋势, 分析脑缺血后出血性转换发生的原因, 总结MMP-9与脑梗死患者预后的关系, 最终得出MMP-9与脑梗死关系密切的结论。
基质金属蛋白酶基因 第9篇
1 材料与方法
1.1 主要试剂
黄芪多糖(四川百利药业有限责任公司,批号:080606);脂多糖(LPS)(Sigma公司);香烟(云南红河卷烟厂软乙香烟,尼古丁含量:1.3 mg;焦油含量:14 mg);强的松片(西安利君沙制药股份有限公司);羟脯氨酸(MPO)试剂盒(南京建成生物工程研究所);MMP-9、TIMP-1抗体(武汉博士德公司)。
1.2 模型的建立、分组与标本处理
健康Wistar雄性大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)40只,平均体重250~300 g,适应性饲养环境周后采用随机数字法将动物分为4组:正常对照组、COPD组、黄芪多糖组、强的松组,每组10只。(1)正常对照组:未作任何干预,每日用1 m L生理盐水灌胃作为对照;(2)COPD组:第1、16天,气管内注入1 g/L的LPS 200μL/次,第2~15天和第17~30天将大鼠放入有机玻璃熏箱内被动吸烟,每天熏烟2次,每次20支香烟,时间持续1 h,2次熏烟间隔4 h每天熏烟前0.5 h以1 m L生理盐水灌胃作为对照;(3)黄芪多糖组:模型制备方法同COPD组,但每天熏烟前0.5 h以蒸馏水溶解黄芪多糖颗粒灌胃(40 mg/kg);(4)强的松组:模型制备方法同COPD组,将强的松片研成粉末,加蒸馏水溶解,熏烟前0.5 h按6 mg/kg灌胃。
1.3 观测指标及方法
1.3.1 取材方法
到第31天时,大鼠经股动脉放血处死,打开胸腔结扎右主支气管,取右下叶部分肺组织待检测羟脯氨酸含量,余右肺组织以10%的中性福尔马林固定,24 h以后石蜡包埋、切片,常规HE染色镜检。左肺用10%的中性福尔马林固定20 min,常规脱水,透明,浸蜡包埋,待免疫组化检测。
1.3.2 肺组织中羟脯氨酸含量测定
取大鼠肺组织用匀浆器在冰浴下制成10%匀浆,3 000 r/min离心10 min,取上清,按照羟脯氨酸试剂盒说明书进行操作,考马斯亮蓝法测定肺组织羟脯氨酸蛋白含量。
1.3.3 肺功能检测
处死动物前采用Ani Res动物肺功能仪进行大鼠肺功能测定。以3%戊巴比妥钠70 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,气管插管,将大鼠放进体扫描仪内,连接动物肺功能仪,描记一段平静呼吸后,在呼气末以相当于潮气量4倍的气量充气(相当于深呼气),所引起的容积变化经微机处理算出0.2 s用力呼吸量(FEV0.2)、FEV0.2与用力肺活量比值(FEV0.2/FVC)以及吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)。
1.3.4 肺组织MMP-9和TIMP-1蛋白含量测定
取左肺石蜡切片(6μm)作免疫组织化学染色(SP法)。免疫组化染色以细胞胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应,每组染色切片随机选取10个视野,经图像扫描测定每组免疫反应阳性信号强度的平均吸光度(A),求出平均值,然后用统计学方法进行半定量分析。
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,对相关指标进行Spearman法直线相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织病理改变
光镜下观察,正常对照组肺组织结构基本正常,COPD组大鼠肺泡壁增厚,间质内大量炎症细胞浸润,肺泡间隔明显增宽,局部可见代偿性肺气肿,证实造模成功,黄芪多糖组及强的松组肺泡壁增厚较COPD组有所减轻,炎性细胞浸润减少。
2.2 大鼠肺功能水平
与正常对照组比较,COPD组FEV0.2、FEV0.2/FVC均显著减少,Re、Ri显著增大(均P<0.05);与COPD组比较,黄芪多糖组和强的松组FEV0.2、FEV0.2/FVC均增多,Re、Ri减少(均P<0.05),其中强的松组改善最为显著。见表1。
注:1 cm H2O=0.098 k Pa;与正常对照组比较,*P<0.05;与COPD组比较,△P<0.05
2.3 大鼠肺组织羟脯氨酸含量
COPD组大鼠肺组织羟脯氨酸含量较正常对照组明显增加(P<0.01);黄芪多糖和强的松干预后,羟脯氨酸含量明显减少(P<0.05或P<0.01)。见表2。
2.4 大鼠肺组织中MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1蛋白水平
COPD组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平较正常对照组明显增加(P<0.05或P<0.01);黄芪多糖和强的松干预后,MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。
注:与正常对照组比较,#P<0.01,*P<0.05;与COPD组比较,##P<0.01,△P<0.05
2.5 相关性分析
正常对照组、COPD组、黄芪组、强的松组肺组织MMP-9/TIMP-1水平与FEV0.2/FVC呈负相关(相关系数r=-0.411、-0.621、-0.684、-0.542,均P<0.05)。
3 讨论
COPD是一种以进行性的气流阻塞和持续性的炎症过程为特征的疾病,目前认为其病变早期是以炎症细胞浸润为主,后期表现为ECM沉积在气道壁导致细支气管壁的增厚和呼吸道重建[1,2]。ECM的降解和沉积失衡是导致气道壁结构异常构建、肺实质破坏和间质增生的重要原因。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组具有相同功能、结构高度同源、依赖锌离子的内肽酶的总称,MMP-9是MMPs家族的重要成员,能降解气道和肺泡的ECM和基底膜,参与其重构和炎细胞趋化,在COPD的发病中占重要地位[3],TIMPs是MMPs的内源性天然抑制因子,能与MMPs形成1∶1复合体抑制其活性,它有五种亚型,其中TIMP-1是活性最强的一种,能特异性抑制MMP-9的活性,TIMP-1还具有细胞生长因子样作用,能使ECM沉积并抑制其降解,是气道纤维化的标志,反映了呼吸道修复重塑的过程[4]。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的,一旦平衡打破则出现病理状态,MMP-9/TIMP-1比值升高,表明呼吸道以炎症反应为主,将引起组织破坏,MMP-9/TIMP-1比值下降,表面呼吸道以修复为主,过度降低(尤其是TIMP-1过度升高时)将出现纤维化可能[5]本试验中,COPD组MMP-9及TIMP-1均较正常组明显升高,MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1水平的升高与COPD肺功能的下降、羟脯氨酸水平的升高有相关性,羟脯氨酸是反应组织纤维化程度的重要指标,上述结果提示MMP-9TIMP-1在肺组织的损伤及纤维化方面起着重要作用。
COPD属于中医咳嗽、痰饮、喘症的范畴,其病因与外邪入侵和内伤有关,中医理论认为肺主气,朝百脉,乃是气、血津液汇聚之地,气虚、血淤是COPD形成的重要病理基础[6]而中药黄芪多糖是传统补气中药,可补气血,去淤散结,有助于气血畅行,目前黄芪多糖在调节免疫方面的作用倍受关注,既往有试验提示黄芪多糖可以抗纤维化[7],故本试验将黄芪多糖作为干预药物,观察其对肺组织病理、MPO、MMP-9TIMP-1、MMP-9/TIMP-1表达的影响,并将其与强的松作对比来观测其疗效。试验结果显示:黄芪多糖能使肺泡壁间隔增厚减轻,炎性细胞浸润减少,并能部分改善局灶性肺气肿肺功能改善,使MPO、MMP-9、TIMP-1表达减少,MMP-9TIMP-1比值减低,其作用与强的松有类似之处。据此笔者推论:黄芪可能通过降低肺组织羟脯氨酸的水平,抑制肺组织中MMP-9、TIMP-1的含量,降低MMP-9/TIMP-1比值来使ECM的合成和降解趋于平衡,这一作用有助于改善呼吸道的无效重构和肺纤维化程度,因此肺功能得以改善。同时显示,黄芪多糖及强的松对肺功能的改善和MMP-9/TIMP-1的降低呈正相关,与之前MMP-9/TIMP-1比值减低时肺损伤倾向于修复的观点一致,但本试验结果显示,使用黄芪多糖和强的松后,MPO降低,与之前的MMP-9/TIMP-1比值降低肺部病变倾向于修复、有纤维化可能似乎有矛盾,但表2显示使用黄芪多糖后,MMP-9的减低幅度显著高于TIMP-1,导致MMP-9/TIMP-1降低的主因是MMP-9的减低,提示黄芪多糖可能通过改善MMP-9/TIMP-1的比例来改善肺纤维化。对于黄芪多糖是通过何种途径来影响MMP-9及TIMP-1的表达目前知之甚少,黄芪多糖对肺炎性因子表达的影响亦不清楚,这对进一步理解其作用机制有着重要意义,可作为下一步的研究目标。
目前对抑制MMP-9的表达及减轻肺损伤的药物的研究正成为药理学的研究热点,一系列合成抑制物在动物试验中已发挥明显作用,但也因副作用而受到制约。中药黄芪多糖毒副作用小,整体改善患者病情,本试验进一步证实了其在COPD中的疗效,提示黄芪多糖可能通过影响MMP-9/TIMP-1的比值来促进肺组织的修复。
摘要：目的 观察黄芪多糖(ASP)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织内基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和金属基质蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)表达的影响。方法 Wistar雄性大鼠40只,随机分为4组:正常对照组,COPD组,黄芪多糖组,强的松组;采用改良烟熏加气管内滴加脂多糖(LPS)方法复制COPD模型,黄芪多糖组采用黄芪多糖灌胃干预30 d,强的松组采用强的松灌胃干预30 d,其他组用等剂量生理盐水灌胃。此后检测各组动物肺功能,取肺组织观察其病理学变化,分别检测各组肺组织中羟脯氨酸(MPO)含量,MMP-9、TIMP-1蛋白的水平,计算MMP-9/TIMP-1比值。结果 COPD组呈现慢性阻塞性肺组织病理变化,肺功能减低,MPO、MMP-9、TIMP-1表达增加,MMP-9/TIMP-1比值增高;黄芪多糖和强的松干预后,肺组织病理改变好转,肺功能改善,MPO、MMP-9、TIMP-1表达减低,MMP-9/TIMP-1比值降低,0.2 s用力呼吸量/用力肺活量(FEV0.2/FVC)与MMP-9/TIMP-1比值呈负相关。结论 黄芪多糖可通过抑制COPD大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1的表达,改善肺组织损伤及肺功能。
关键词：慢性阻塞性肺病,黄芪多糖,基质金属蛋白酶-9,金属基质蛋白酶抑制剂-1
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